高效液相色谱法教学.ppt

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1、第十三章 高效液相色谱法,第一节 概述,高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法,一、HPLC与经典LC区别二、HPLC与GC差别三、高效液相色谱仪流程图四、特点,一、HPLC与经典LC区别,主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段,1经典LC：仅做为一种分离手段 柱内径13cm，固定相粒径100m 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H，n）分析周期长 无法在线检测2HPLC：分离和分析 柱内径26mm，固定相粒径10m（球形，匀浆装柱）高压输送流动相 柱效高（H，n）分析时间大大缩短 可以在线检测,二、HPLC与GC差别,相同：兼具分离和分析功能，

2、均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别,1分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测 占有机物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%,续前,2流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作

3、用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性,3操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）,三、高效液相色谱仪流程图,续前,四、HPLC的特点和应用,“三高”“一快”“一广”,高柱效n=104片/米，柱效高（远高于一般LC）高灵敏度高选择性分析速度快应用范围广泛（可分析80%有机化合物）,第二节 基本理论和条件选择,一、塔板理论二、速率理论 三、HPLC法中分离条件的选择,一、塔板理论,二、速率理论（与GC对比）,1.,续前,2）涡流扩散项及其影响 next,2.,讨论：1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）next,图示,bac

4、k,续前,3）传质阻抗项及其影响,图示,三、HPLC法中分离条件的选择,1.固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp10m）首选化学键合相，匀浆法装柱2.流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相甲醇，1ml/min 3.柱温的选择：选室温250C左右,第三节 各类高效液相色谱法,一、液固吸附色谱法（LSC）二、液液分配色谱法（LLC）三、化学键合相色谱法（BPC）,一、液固吸附色谱法（LSC）流动相为液体，固定相为固体吸附剂,1分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性 中心能力的差异,分离前提：K不等或k不等,续前,2固定相：与LC比，固定相粒径不同（10m）,

5、（2）高分子多孔小球：YSG 原理：吸附+分配 蒹小孔凝胶作用 特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 适用：分离弱极性化合物,续前,3流动相：底剂（烷烃）+有机极性调节剂 例：正己烷或庚烷+氯仿-,4影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关 溶质分子极性，洗脱能力，k，tR 溶剂系统极性，洗脱能力，k，tR注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间5出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱6硅胶吸水量，LSCLLC硅胶含水量较小 吸附色谱 硅胶极性较大硅胶含水量17%分配色谱 硅胶失活载体 吸附的水固定液,二、液液分配色谱法（LLC）,1分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异2固定相：载体+固

6、定液（物理或机械涂渍法）缺点：系统内部压力大，易流失，不实用 固定液极性NLLC 固定液非极性RLLC3正相色谱固定液极性 流动相极性（NLLC）极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分 反相色谱固定液极性 流动相极性（RLLC）极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分,三、化学键合相色谱法（BPC）,（一）化学键合相（二）反相键合相色谱（三）正相键合相色谱（四）离子对色谱和离子抑制色谱,（一）化学键合相,利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面,1分离机制：分配+吸附（以LLC为基础）2特点：1）不易流失 2）热稳定性好 3）化学性能好 4）载样量大 5）

7、适于梯度洗脱,（二）反相键合相色谱,1分离机制：疏溶剂理论 正相流动相与溶质排斥力强，作用时间 k，组分tR 反相流动相与溶质排斥力弱，作用时间，k，组分tR2固定相：极性小的烷基键合相 C8柱，C18柱（ODS柱HPLC约80%问题）3流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水 流动相极性 固定相极性 底剂+有机调节剂（极性调节剂）例：水+甲醇，乙腈，THF,续前,4流动相极性与k的关系：流动相极性，洗脱能力，k，组分tR5出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱6适用：非极性中等极性组分（HPLC80%问题）,（三）正相键合相色谱,1分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键

8、作用力2固定相：极性大的氰基或氨基键合相3流动相：极性小（同LSC）底剂+有机极性调节剂 例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇,续前,4流动相极性与k的关系：流动相极性，洗脱能力，组分tR，k5出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱 极性大的组分后出柱6适用：氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）分离物质也相似氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性 分析极性大物质、糖类等,（四）离子对色谱和离子抑制色谱,1反相离子对色谱法 2反相离子抑制色谱,1反相离子对色谱法（IPC或PIC）,反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离,1）离

9、子对试剂：烷基磺酸钠分析碱 四丁基季胺盐分析酸2）影响k的因素a与m的极性有关（同反相色谱）b与R的链长有关：R长，极性小，tR，k 3）适用：较强的有机酸、碱,2反相离子抑制色谱,在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制组分解离，增加其k和tR，以达到改善分离的目的,1）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质 pH一定的缓冲溶液2）k的影响因素：与流动相极性有关，还与pH值有关选择流动相：应同时考虑极性及pH值 酸性物质加入酸HAc tR，k 碱性物质加入碱NH3H2O tR，k 调节pH范围：3.08.0 pH8.0 破坏键合相与载体的结合 pH3.0 腐蚀柱子3）适用：极弱酸碱物质 p

10、H=37弱酸；pH=78弱碱；两性化合物,第四节 影响分离的因素,1,续前,2对流动相的要求：,1）与固定液不反应2）对样品有良好溶解度 k=110 k=25 最理想的3）与检测器匹配：UV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长）荧光，电化学4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈）使用前过滤、脱气,续前,3洗脱方式,1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）类似GC的等温度洗脱2）梯度洗脱：在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例 即不断改变其极性（两个泵）适于分析极性差别较大的复杂组分 类似GC的程序升温（沸程较长样品）,图示,第五节 高效液相色谱仪,1泵：恒压泵：流量精度不稳 恒流泵：常用2进样装置 1）隔膜进样（高分子有机硅胶垫进样室）GC系统压力较小，可以 HPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期）2）阀进样：不必停泵，六通阀,续前,3色谱柱：直径46mm,柱长1030cm 柱效评价：色谱系统适应性试验 R，n，fs（拖尾因子）柱再生：维护、保养、柱子的冲洗4检测器 1）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质 2）荧光检测器：只能分析自身发光的物质 灵敏度高 3）示差折光检测器：利用折光率的差别 灵敏度低，温度要求严格 4）电化学检测器 5）化学发光,