仪器分析中的样品处理.ppt

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1、仪器分析中的样品处理,中国分析测试协会 汪正范 Email:,仪器分析的四个基本程序,样品的采集样品的处理分析试样的制备上机分析数据处理,样品处理的目的,将微量或痕量的欲测组分富集将干扰欲测组分的物质去除将无法被仪器分析的欲测组分转化成可被仪器分析的物质,样品处理在仪器分析中的必要性和重要性,分析样品必须满足所用分析仪器的要求样品处理将直接影响分析结果的可靠性和准确性整个分析过程中样品处理花费的时间和精力最多,样品处理应遵守的原则,采集的样品要能满足分析测试的目的，采集的样品要有代表性，故在采样的时间和地点，采样的方法，采样的量等方面作充分考虑。,采样装置应保证采样时样品组成不发生变化。样品处

2、理前应首先了解分析测试的目的和欲测组分的物理、化学性能，对样品的基本情况(如：物理性能、化学组成等等)也应有所了解，以便选择适当的、合理的处理方法。,样品处理过程中要防止和避免欲测组分发生化学变化，如必须将欲测组分进行转换时，所使用的化学反应必须是已知的和能定量完成的。样品处理过程中要防止和避免欲测组分的沾污或丢失，在处理过程中应尽可能减少无关物质的引入。,样品处理所使用的方法应尽可能简单易行，所使用的装置尺寸应与处理的样品量相适应。样品处理时应同时处理2个或2个以上平行样品，并带一个空白，用以检查样品处理过程中是否存在问题。,样品的采集方法,气体样品的采集 直接采集：刚性容器采用预抽真空法采

3、样，柔性容器采用泵 采样。富集采集固体吸附法、溶液吸收法、冷阱收集法。液体样品的采集 直接采集：可直接用棕色玻璃瓶采集，样品灌满并溢出后封好，瓶中不应有气泡，需要时应加适当的保存剂。富集采集：吸附剂吸附。,固体样品的采集 直接采集：考虑样品的均匀性和代表性，采样量要大些，然后进行缩分。大气中悬浮颗粒物样品的采集 根据所需采集颗粒物大小选择适当的滤膜或滤筒采集。,样品处理的常用技术（方法）,灰化和消解 主要用于有机物中金属元素的分析，通过高温氧化或强氧化剂（如浓硫酸、硝酸、高氯酸、王水等等）氧化的方法将有机物中的大量碳除去。酸溶、碱溶和熔融 利用酸溶、碱溶或熔融的方法，将固体样品或灰化和消解后的

4、产物转化为溶液，以便仪器分析或进行下一步的处理。,萃取 将样品中欲测组分抽提到另一相中，使其与干扰组分分离，并可同时进行富集。可分为液相萃取将固体、液体或气体样品中欲测组分抽提到溶剂中；固相萃取将液体或气体样品中欲测组分吸附在固体上；气相萃取（顶空技术）将固体或液体样品中欲测组分抽提到气体中；超临界流体萃取将固体样品中欲测组分抽提到超临界流体中。,蒸馏 利用欲测组分与干扰组分的沸点不同而进行分离，亦可同时进行富集。可分为简单蒸馏、分馏（精馏）、减压蒸馏和水汽蒸馏等。,沉淀、结晶和重结晶 利用欲测组分与干扰组分在不同溶剂中的溶解度不同而进行分离，亦可同时进行富集。可将欲测组分沉淀，干扰组分留在溶

5、液中；亦可将干扰组分沉淀，欲测组分留在溶液中。可利用改变溶液的温度、浓度、pH值、溶剂的组成来改变欲测组分和干扰组分的溶解度，使其分离；亦可加入某些物质，使欲测组分或干扰组分沉淀或共沉淀（结晶或共结晶）而得到分离。可利用重结晶的方法得到很纯的化合物，以便利用某些仪器进行准确的结构分析。,膜分离 利用欲测组分与干扰组分对不同膜的透过性不同而分离。其分离过程可分为渗析、超滤和电渗析。膜分离也被称为膜萃取。衍生化 利用已知的、能定量完成的化学反应，将不能被仪器分析或检测的欲测组分转化成可被仪器分析或检测的物质，或将不能与干扰组分分离的欲测组分转化成能分离的物质使两者分离。,热解吸 利用控制加热速度和

6、温度的方法使欲测组分从固体样品或固相萃取所用的固体吸附剂中解吸出来，从而与干扰组分分离。热裂解 主要用于高分子化合物分析，通过控制加热速度和温度使高分子化合物发生分解，生成小分子碎片，分析这些分解产物，推断原高分子化合物的组成和结构。,电解 利用欲测组分与干扰物质的电解电位不同，通过电解的方法将欲测组分与干扰物质分离，并可以进行富集。如在作极谱分析或库仑分析时，可通过电解进行预分离和预富集。色谱 不同运行模式的色谱本身就是一种分析仪器，可以用来对欲测组分进行分析测试。不同运行模式的色谱又是一种分离技术，可将欲测组分与干扰物质分离，然后用其他分析仪器进行脱机或联机分析。在样品处理中最常用的是柱色

7、谱和薄层色谱。,膜分离技术在样品处理中的应用,工作原理 利用不同高分子膜对不同化合物的渗透性有所不同，将欲测组分与样品基体和干扰组分分离。在样品处理中常用的膜分离技术有：渗析、超滤和电渗析。下表给出这三种膜分离的分离机理和应用。,装 置 目前样品处理中常用的膜分离装置有两种类型：1.平面膜：下图给出平面膜与质谱或色谱分析联用结构图,2.中空纤维膜：下图给出中空纤维膜分离装置结构图,中空纤维膜,吹扫气体,样品出口,样品入口,捕集装置或分析仪器,应 用 由于膜分离技术具有装置结构简单、操作程序方便、无需有机溶剂处理、可与各种分析仪器直接连接，易于实现自动化和在线操作等，所以膜分离技术的可应用于各类

8、仪器分析的样品处理。下面介绍一个应用实例：利用膜分离和气相色谱联用测定血浆中的乙醇。,吹扫气体入口,吹扫气体出口,气相色谱,样品瓶,中空纤维膜,血样品和水,膜-气相色谱连接结构图,0.3m-0.5m长的空心毛细管,乙醇，6.4 mg/ml,血液样品中乙醇的膜萃取-气相色谱测定结果,测定血中乙醇三种方法的比较,膜分离技术可以与各种捕集技术相结合，使欲测组分得到富集。,膜萃取-微捕集串联与气相色谱或质谱联机结构图,吹扫/捕集技术在样品处理中的应用,工作原理 吹扫捕集技术实质上是一种连续气体萃取技术（属于动态顶空技术），吹扫气（一般使用氮气）通过液体或固体样品，将样品中的可挥发组分（其中包括欲测组分

9、）带出，然后用冷冻或固体吸附剂吸附的方法，将欲测组分捕集下来，再通过热解吸的方法，将欲测组分解吸下来，进入分析仪器分析。,装 置 目前已有多种商品化的吹扫捕集装置，各装置在结构上虽有不同，但其流程和工作原理基本一致，下图给出吹扫捕集方法的流程图：,吹扫和捕集方法流程图示A 吹扫(萃取)；B 解吸(进样)；C 烘烤清洗1温除水系统 2冷阱 3冷除水系统4热阱 5检测器 6除热水器,吹扫气,放空,烘烤气,样品排放,GC载气,排气,1,2,3,4,5,6,A,B,C,国外的吹扫捕集装置中捕集部分一般有低温装置（冷阱），解吸时的升温速度也是很快的，瞬间即可达到解吸温度，装置的价格也是很高昂的。国内太极

10、公司研制的TJ-618样品处理装置也是一种吹扫捕集装置，它的解吸升温速度不是很快，但是它采用一种特殊技术来减少由于升温过程而引起的进样带展宽，从而使装置的成本大大降低，该装置的价格仅为国外同类产品的1/31/2。下面给出几种产品性能的对比。,性 能 指 标,应 用 吹扫捕集技术主要用于气相色谱和气相色谱质谱分析可挥发性化合物，特别是分析水中有机挥发性化合物。该技术已列入美国EPA方法中水中有机挥发性化合物分析的标准方法。下面给出使用太极公司TJ-618样品前处理装置，结合气相色谱来鉴定真假红塔山烟和对茶叶中农药残留所作的分析。,烟 草 数 据（固体样品）,真红塔山假红塔山,茶叶农药残留检测数据

11、（固体样品）,检测器：电子捕获检测器,固相微萃取技术在样品处理中的应用,工作原理 在一根很细的熔融石英纤维上，涂上吸附剂，用来吸附欲测组分，使其与干扰组分和基体分离，并得到富集。被吸附剂吸附的欲测组分，可通过加热或洗脱液洗脱的方法解吸下来，进入分析仪器（主要是气相色谱和液相色谱）。,装 置 涂敷吸附剂的熔融石英纤维（称为萃取头）接在一根细的不锈钢钢丝上，外套一根细的不锈钢管（在取样和进样时保护萃取头），萃取头在细的不锈钢管中可自由伸缩进出。在取样和色谱进样时，由细的不锈钢管穿透密封垫，然后再将萃取头伸出。在拔出细的不锈钢管前，将萃取头缩进。下图给出了固相微萃取装置和色谱进样的示意图。,隔垫穿孔

12、针头,手柄,外套,活塞固定螺杆,Z-沟槽,连接器观察窗口,可调节针头导轨/深度标记,纤维固定管,敷涂层的石英纤维,弹簧,密封垫,固相微萃取装置示意图,固相微萃取的采样和进样操作方法,穿透样品瓶密封垫暴露/提取撤回萃取头插入GC注入口暴露/解吸撤回萃取头插入进样装置到HPLC柱撤回萃取头,应 用 主要应用于气相色谱和液相色谱分析时的样品处理，具有操作时间短，样品量小，无需萃取溶剂，易实现自动化，适于分析挥发性与非挥发性物质，重现性好等优点。很多研究结果表明，在样品中加入适当的内标进行定量分析时，其重现性和精密度都非常好，是近年发展很快的一种样品处理新技术。,根据欲测组分性质和样品情况选用不同萃取

13、方式,熔融石英纤维,膜,样品,涂层,样品,涂层,(a)直接萃取(b)顶空萃取(c)膜保护萃取,根据欲测组分的挥发性和极性选择涂层 种类和涂层厚度,Poly(dimethylsiloxane),Poly(acrylate),PDMS/DVB,Carbowax/DVB,Carbowax TR/DVB,吸烟妇女乳汁的固相微萃取气相色谱/质谱分析,1.苯胺2.甲基苯胺3.二甲基苯胺4.三甲基苯胺5.尼古丁,时间（分）,毛细管固相微萃取器在水样预处理中的应用,毛细管固相微萃取器是中科院大化所关亚风研究员等人研制开发的、用于水中半挥发和不挥发有机污染物分析的一种水样预处理装置。被分析样品从管壁交联固定相的

14、中空毛细管通过，欲测组分被固定相吸附，然后再通过热解析将欲测组分解析下来，进入GC或GCMS，进行分析。由于通过增加固定相的涂渍厚度和毛细管的长度和内径，可以获得比SPME固定相体积大十倍以上的固定相体积，使萃取富集倍数大大提高。,装 置 流 程 图,1.稳压阀 2.压力表 3.水瓶 4.水罐 5.四通阀 6.废水容器 7.六通阀 8.微型两通接头 9.微型三通接头 10.萃取毛细管柱 11.过滤器 12./13.稳流阀 14.GC进样器 15.毛细管预柱 16.毛细管分离柱 17.FID检测器,应 用,微波技术在样品处理中的应用,微波灰化 用微波高温马弗炉进行灰化，可不经炭化而一次完成灰化，

15、所需灰化时间极短。与传统马弗炉相比，升温速度极快，能在几分钟内迅速程序升温至10001500，灰化时间也可减少数倍至数十倍。,微波消解 密闭式微波消解（微波高压消解）：将放有样品和消解液的消解罐放入微波炉内，用微波加热，在高温、高压和微波的作用下，难消解的化合物很快消解，由于消解罐是密闭的，故不会有任何元素损失。使用试剂少，消解速度快，所有时间比电热板消解可减少数倍至数十倍，污染也大大减少。,微波萃取 在密闭的容器里，利用微波瞬间将萃取液加热到常压沸点以上，在微波的作用下，加快被萃取物从样品中溶出。微波萃取所有的溶剂仅为常规萃取的数十分之一，而萃取速度为常规萃取的数十倍，萃取效率也要高。下表给

16、出了微波萃取（MAE）与超声波萃取和索氏提取用于某些有机氯农药残留分析时结果的比较。,微波萃取（MAE）与超声波萃取和索氏提取法用于某些有机氯农药残留分析的比较,ASE快速溶剂萃取,工 作 原 理 ASE快速溶剂萃取是使用常规溶剂，利用提高萃取压力和萃取温度来提高萃取效率，缩短萃取时间，节省萃取溶剂。,工作原理图,生物样品的处理技术（方法）,生物样品通常是指植物的花、叶、茎、根、种子等，动物(包括人)的体液(如：尿、血、唾液及生物体的分泌液)、毛发、肌肉和一些组织器官。欲分析的组分常有植物体内的微量元素、营养成分、农药残留等等；动物体内的微量元素、药物及代谢产物、糖类及有关化合物、脂类及长链脂

17、肪酸化合物、维生素及辅酶类化合物、核苷、核苷酸及其衍生物、磷酸酯类化合物、固醇类化合物、胺、酰胺、氨基酸、多肽、蛋白及其衍生物和某些生物大分子（分子量在数千到数百万的生物大分子）。由于生物样品及某些欲测组分的特殊性，生物样品的处理，除可使用上述的样品处理常用技术外，在采样、欲测组分的分离提取方面需采用一些特殊技术，现对这些特殊技术作些简要介绍。,采 样 生物样品一般采自动、植物活体，采样方法与其他样品有所不同，一般采用注射器吸取，手术刀、剪切割等方法采集。采样时要注意采样时机，因为生物活体总在新陈代谢；采样后对采集的样品要立即加以处理，因为生物样品一般都有生物活性，如不立即加以处理，欲测组分就

18、可能发生变化。如采集血样后要立即加抗血凝剂；采集好某些器官组织后要立即加一些防腐剂，或立即进行速冻或脱水处理。生物样品的采集最好在无菌条件下进行。,细胞的破碎 当生物样品中的欲测组分（主要是各种多肽激素、各种酶以及各种基因工程的产物如干扰素、胰岛素、生长激素等等）存在于生物体细胞内及多细胞生物组织中时，需在分析测定它们之前将细胞和组织破碎，使这些欲测组分充分释放到溶液中去。不同的生物体，或同一生物体的不同组织，其细胞破碎的难易程度不一样，使用的方法也不完全相同。如动物胰脏、肝脏、脑组织一般比较柔软，用普通的匀浆器研磨即可，肌肉及心脏组织较韧，需预先铰碎再作成匀浆。植物肉组织可用一般研磨方法，含

19、纤维较多组织则必须在捣碎器内破碎或加砂研磨。许多微生物均具有坚韧的细胞壁，常用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声波和加压处理等方法。总之，破碎细胞的目的就是为了破坏细胞的外壳，使细胞内含物有效地释放出来，获得有效的提取。,常用细胞破碎方法,细胞的破碎方法,机械的,非机械的,液体剪切,固体剪切,脱水,溶胞作用,超声波,机械搅拌压力,研磨,压力,空气干燥,物理的,化学的,酶的溶菌,杆和臼,Hughes压榨机,真空干燥,渗透冲击,阳离子和阴离子洗涤剂,酶和有关的酶噬菌体溶胞,球磨机,“X”压榨机,冷冻干燥,压力释放,溶剂干燥,冻结和融化,抗生素,抗菌素,甘氨酸,生物大分子的提取 生物大分子是指分子量在数

20、千到数百万的大分子。主要包括多肽、蛋白质、酶、核酸、多糖等生物大分子。它们在细胞破碎时被充分释放出来。为了将它们制备成仪器分析的样品就要用一定的溶剂将它们抽提出来，与细胞残渣分离。这些生物大分子大部分可溶于水或含有少量酸、碱、盐的水溶液。有时也加入一些有机溶剂改善欲测组分的提取效率，并使欲测组分与其他组分分离。影响提取的因素较多，要根据经验，结合具体实验条件，特别是溶剂性质、pH值、离子强度、介电常数、提取温度等主要因素灵活加以运用，选择最佳条件和方法，达到提取的最佳效果。,蛋白的沉淀 在用仪器分析生物样品中的一些小分子化合物及一些多肽类化合物时，蛋白质的存在，常常严重干扰分析，需要在制备仪器

21、分析样品时将这些蛋白质除去，常用的除蛋白质方法有以下一些：1.加热 当欲测组分热稳定性好时，可采用加热的方法将一些热变性蛋白沉淀。加热温度视欲测组分的热稳定性而定，通常可加热到90。蛋白沉淀后可用离心或过滤除去，这种方法最简单，但只能除去热变性蛋白。,利用不同蛋白质在高浓度的盐溶液中，溶解度不同程度的降低来沉淀除去蛋白质。在低盐浓度下蛋白质溶解度随着盐浓度升高而增加，称为盐溶作用。当盐浓度不断升高时，不同蛋白质的溶解度不同程度下降，并先后析出沉淀，称为盐析作用。盐析法的优点是对设备和条件要求低，安全，应用范围广泛，一般可在室温下操作。常用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。硫酸

22、铵的盐析能力强，饱和液浓度大，溶解度受温度影响小，一般不会使蛋白质变性。缺点是缓冲能力差，pH值常在4.55.5间。,2.盐析,3.有机溶剂沉淀 蛋白质的沉淀与溶解，与溶剂的介电常数有关。降低溶液的介电常数，能增加蛋白质分子上不同电荷的引力，使其溶解度变小，同时还破坏蛋白质的水化膜而使蛋白质沉淀析出。乙醇和丙酮是最常用的有机溶剂，丙酮的介电常数小于乙醇，故沉淀的能力较强 4.等电点沉淀 利用蛋白质在等电点时溶解度最低，用酸、碱调pH，可使蛋白沉淀析出，但这时沉淀不完全，可与有机溶剂沉淀法、盐析法联合使用。,5.膜分离 膜分离技术包括超滤、反渗透析、电渗析、微孔过滤、气体渗析和超精密过滤等。利用

23、膜分离技术可将欲测小分子化合物和大分子的蛋白质很好分离。6.凝胶层析 利用分子大小不同的物质在流过凝胶固定相时的保留时间不同，大分子首先流出，小分子最后流出，可将欲测小分子化合物与大分子蛋白质分离。这时欲测小分子化合物的浓度被流动相所稀释，必要时还要进行浓缩。,7.柱层析 用能吸附蛋白质的材料装填成小柱，使欲除蛋白质的样品流过小柱，样品中的蛋白质被柱填料吸附，欲测组份不被吸附，从小柱中流出。8.高速离心 高速离心是根据物质沉降系数、质量、浮力因子等不同，应用强大的离心力使物质分离、浓缩、提纯的方法，是生物样品制备中常用的分离方法之一。由于蛋白质等生物大分子，分子量大，在高速离心时将首先沉淀在离

24、心管底部，不同分子量的蛋白质等生物大分子沉降速度不同，也可按分子量大小沉降在离心管的不同位置，这样就可以从离心管的不同位置取出样品进行分析。,活体取样微透析技术 微透析是一种在不破坏（或破坏很少）生物体内环境的前提下，对生物体细胞液的内源性或外源性物质进行连续取样和分析的新技术。将由膜制成的微透析探针植于需要取样的部位，用与细胞间液非常接近的生理溶液以慢速度（0.55l/min）灌注探针，由于膜内外欲测组分的浓度差而使得膜外的体内欲测组分进入膜内，并被灌注液带到体外，进入仪器。,微注射泵,检测系统,管子,微透析探针,活体实验动物,样品处理技术的发展趋势,自动化与分析仪器联机新的分离技术不断引入

25、现有处理技术新组合样品处理装置体积和重量减小,样品处理技术的发展趋势就是要使处理样品的过程要简单、处理样品的速度要快、处理样品的装置要小、处理样品时所需的化学试剂和样品量要小、处理样品时引进的误差（欲测组分的丢失或沾污）要小、要提高欲测组分的选择性和回收率。Hawthorne等人对城市灰尘中测定PAH样品用经典方法（索氏提取）、脱机超临界流体萃取与联机超临界流体萃取三种技术作了比较，结果（见下表）说明样品处理技术的发展将大大缩短分析时间，大大减少样品处理所需的化学试剂和样品量。,科学技术的发展，一方面使分析仪器的性能不断得到提高（最低检出限、灵敏度、分辨率和线性范围等都在不断得到改进，抗干扰性能也不断提高），分析仪器对所分析样品的要求在降低；而另一方面欲分析测试的样品更加复杂，其中的欲测组分的含量越来越低，对结果的精度和准确度要求越来越高，这些都对样品处理有更高的要求。样品处理技术就是在不断地解决这些矛盾中得到发展。,