蛋白质组学与分析技术课第九讲.ppt
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1、蛋白质组学与分析技术(第 九 讲),酵母双杂交技术基因敲除技术,酵母双杂交技术,主要内容,酵母双杂交概念酵母双杂交的基本原理酵母双杂交系统的优缺点酵母双杂交系统的应用酵母双杂交衍生系统酵母双杂交技术未来展望,什么是酵母双杂交?,酵母双杂交(Yeast Two-Hybrid),简称双杂交系统(Two-Hybrid System),又称相互作用陷阱(InteractionTrap),是1989年由Stanley Fields和Song等在验证两个蛋白质间相互作用的亲和力时初步建立的,并在Nature杂志上首先描述了这一系统,该系统是以酿酒酵(S.cerevisiae)为宿主,在酵母菌内研究蛋白质蛋
2、白质相互作用的一种分子生物学方法。酵母双杂交正成为探索蛋白质相互作用最常用和最有力的工具。目前已被广泛地应用于真核基因的表达与调控、细胞黏合因子间的相互作用、信号传导通路以及细胞周期与分化、反式因子的鉴定与分离等诸多领域的基础研究及药物开发。,酵母双杂交的基本原理,酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物转录起始调控的认识。转录起始需要转录激活因子的参与,而真核生物转录激活因子大多是由结构上分离、功能上独立的两个结构域组成,即DNA结合结构域(DNA binding domain,简称为DNA-BD)和转录激活结构域(transcription activating domain,简称AD)。转录
3、激活蛋白可以和DNA上特异的序列结合,同时可启动相应因子的转录。它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DNA-BD和AD都不能激活转录起始。但不同转录激活因子的DNA-BD和AD形成的融合蛋白仍然具有正常的激活转录起始的功能。,结合结构域,与DNA结合结构域(DNA-BD)融合的蛋白一般称为“诱饵蛋白”(bait protein)与转录激活结构域(AD)融合的蛋白一般称为“猎物蛋白”(prey protein)或“靶蛋白”(target protein),诱饵蛋白,结合结构域,报告基因 mRNA,如果分别融合于DNA-BD和AD上的“诱饵蛋白”和“猎物蛋白”之间存在相互作用,那么DNA-B
4、D和AD就能重新形成有活性的转录激活因子,从而激活相应报告基因(reporter gene)的转录与表达。通过对报道基因表达产物的检测,反过来就可判别“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。,报告基因 mRNA,报告基因 mRNA,报告基因 mRNA,报告基因 mRNA,酵母双杂交系统的优缺点,1 酵母是真核细胞,表达的蛋白可保持天然状态在细胞中产生相互作用,一定程度上代表了细胞内的真实情况;2 易于转化、便于回收扩增质粒,3 采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料来构建cDNA文库,分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白;4 具有很多营养缺陷型标记和特
5、征报道基因,筛选方便;5 高度敏感性,可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时性的相互作用;6 酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合,避免了对文库编码蛋白的干扰。,1 有些诱饵蛋白质本身具有激活转录功能使在无特异激活结构域情况下激活转录;2 有些蛋白通常在细胞表面发生相互作用,不能稳定地在酵母中表达或定位于酵母细胞内;3 有些DNA-BD融合蛋白或AD融合蛋白一部分可能封闭正常的作用位点,或者破坏了蛋白质的正确折叠,从而影响了蛋白间作用的能力;4 有些蛋白质的正确折叠、修饰和功能有赖于其它非酵母蛋白的辅助,这限制了某些胞外蛋白(如哺乳动物)和细胞膜受体蛋白等的研究;5 有些蛋白质本身对酵
6、母细胞具有毒性作用。,优势,局限性,酵母双杂交系统的应用,1 检验对功能已知蛋白间的相互作用 优点快速和高灵敏度,且反映了蛋白在体内的相互作用;还能检测出瞬间发生的信号反应,而用体外检测法检测蛋白要经过一系列洗涤过程,常致使相互作用不再发生。融合蛋白由于BD和DNA序列的相互作用而变得更加稳定。并且杂合蛋白一般都是由高拷贝质粒的强启动子过量表达的蛋白,在转录过程中产生了一些复合酶使信号得以放大。2 研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域 可应用于确定两已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构域。利用此系统已分析和测定了多种重要的结构域,当证实了两个蛋白有相互作用后,可以对其进行缺失实验而找到相
7、互作用发生所必须的氨基酸残基。通过该方法还能研究蛋白质的结构与功能。通常需要对待测蛋白做点突变或缺失突变的处理。,3发现新的作用蛋白质 用已知功能的蛋白基因筛选双杂交cDNA文库,以研究蛋白质之间相互作用的传递途径,寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白,是双杂交系统最广泛和最有价值的应用。4 寻找具有药物治疗作用的小分子多肽 通过双杂交系统筛选和目标蛋白相互作用的多肽,如靶蛋白是药物设计的目标,则有可能得到一些具有药物治疗作用的小分子多肽药物。,5分析新基因的生物学功能 即以功能未知的新基因蛋白克隆在BD载体上,而把将要筛选的cDNA文库克隆在AD载体上,利用双杂交技术可以找到一个新的结合蛋白,这个结
8、合蛋白可能是已知基因也可能是未知基因所编码,然后根据调到的已知基因的功能推测该新基因的功能。6寻找调控蛋白相互作用的蛋白,在恢复转录活性的双杂交系统中加入某一分子化合物后再检测报告基因的表达强度,可用来寻找抑制蛋白质之间相互作用的小分子化合物。,7 蛋白质相互作用图谱的构建 随着基因组研究计划的开展,及mRNA在不同组织器官的不同发育阶段表达图谱的构建,蛋白在不同时空状态下相互作用图谱的构建也逐渐展开。酵母蛋白质相互作用的横向研究是近年来双杂交系统最引人注目的应用,用以揭示多种细胞活动过程中各控制因子间的联系。,酵母双杂交技术应用的趋势及展望,酵母双杂交技术问世至今十多年来,已经在蛋白质间的相
9、互作用研究、筛选新的蛋白、研究蛋白质的功能等诸多方面发挥了重要作用。该技术已经成为许多实验室研究蛋白质的相互作用和蛋白质的结构与功能的必备手段。目前除了应用双杂交系统继续寻找和靶蛋白起相互作用的新蛋白外,相当一部分的实验重点已放在如何利用双杂交系统作为媒介来研究蛋白相互作用的调控机制以及寻找蛋白联系图谱,这在后基因组时代更具意义。,交链孢菌植物激活蛋白信号传导机理的研究应用实例,利用酵母双杂交技术,即将交链孢菌植物激活蛋白目的基因克隆在DNA-BD载体上,将拟南芥cDNA文库或番茄cDNA文库克隆在AD载体上,在酵母中进行表达筛选,可得到目的基因的互作蛋白,然后针对互作蛋白进行植物激活蛋白信号
10、传导机理的研究。,技术路线图,酵母双杂交体系的实验程序,诱饵蛋白自激活作用检测,待筛cDNA文库片段克隆在AD质粒载体上,把cDNA文库质粒转化到含诱饵载体BD-X的感受态酵母菌内,检测挑选阳性克隆,酵母质粒DNA提取并转化大肠杆菌,提取细菌质粒酶切鉴定,明确与已知靶蛋白X相作用的Y蛋白的核苷酸序列,待筛cDNA文库 质粒的准备,将已知靶蛋白质X的编码基因插入BD质粒载体,构建诱饵载体,酵母双杂交衍生系统,单杂交系统(One-hybrid system)三杂交系统(Three-binding hybid system)反向双杂交系统(Reverse two-hybrid system)无核双杂
11、交系统(Non-nuclear two-hybrid system),单杂交系统,单杂交系统是1993年发展出来的一种研究蛋白质和DNA相互作用的实验体系,用于确定识别特异DNA结合蛋白。在该系统中,转录激活域AD相融合的待筛选蛋白质Y直接与DNA结合位点相结合,使AD直接激活启动子下游报告基因的表达。这一过程无需BD-X的参与,因而通过对AD-Y文库的筛选可分离出与靶DNA序列直接作用的蛋白质Y。,2 酵母单半杂交系统 酵母单半杂交系统(one-and-a-half hybrid system)也是一种筛选DNA结合蛋白的方法,它结合了单杂交系统和双杂交系统的特点。是专门用来鉴别那些只有在与
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- 蛋白质 分析 技术 第九
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