《切片制作技术》PPT课件.ppt
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1、病理切片制作技术,第一章 组织的取材和固定方法 第二章 组织切片技术 第三章 苏木精-伊红染色方法,第一章 组织的取材和固定方法,病理标本的检查应包括大体和显微镜下观察二个方面,而正确的诊断往往取决于准确的显微镜下观察,因此,制片质量的好坏将直接影响诊断结果的准确性,甚至会带来错误的结果。近年来,免疫组织化学方法在病理学上应用越来越广泛,对取材的要求也越来越高,不仅要求组织细胞的形态保存完整,而且要求最大程度的保存组织或细胞成分的抗原性。抗原性不受损伤是一方面,还要求不能弥散,否则,对于抗原含量较少的标本,抗原性完全丧失,产生假阳性结果,影响病理诊断的准确性,甚至抗原的定位也无从谈起。,第一节
2、 取材,从大体标本上按照病理检查的目的和要求切取适当大小的组织块,供制片进行显微镜检查。一、取材时对送检组织的要求二、取材三、取材时的注意事项四、冰冻切片取材,一、取材时对送检组织的要求,送检组织切取后应立即放入10%福尔马林溶液内固定;尸检标本应争取在死亡后尽可能短的时间内取材;有特殊要求(如细菌培养、结石的化学成分分析等)须事先联系,在标本未固定前进行处理。,二、取材,对送检组织应进行详细检查,根据诊断的需要,确定取材的部位和块数;切取的组织要按不同部位分别给予不同的编号或标记,以便镜检时查对。,三、取材时的注意事项,1注意防止人为损伤 切取组织的刀具应锋利、薄;切取组织块时,避免前后拉动
3、或用力挤压组织,避免使用有齿镊,引起组织结构的变形和损伤。2标本大小 经修整后的组织大小以1.5 cm 1.5 cm 0.2-0.3 cm 为宜。3取材时间 原则上应尽快取材。4注意包埋方向 需指定包埋面的应作记号表明。如皮肤组织的包埋面应与表面垂直,才能保证皮肤的各层结构都能被观察到。5小标本的处理方法 较小的标本(如穿刺材料等)常常用易透水的薄纸包好,在取材时将标本染上伊红液,以免包埋过程中丢失。6注意特殊情况 取材应避免过多的坏死组织或凝血块,组织块上如有血液、粘液、粪便等污物,应先用水冲洗干净再取材。7取材数量 不同的标本取材的组织块多少不同,原则上是凡是可疑处均应取材。一般来讲,除了
4、病变的主体部分外,应注意切取病变组织和正常组织交界处。8清除多余部分 取材时应注意清除组织周围的多余脂肪组织,否则会对以后的切片和观察带来一定的影响。9核对 取材完毕,应核对无误,并签署有关信息和记录日期。10组织存放 取材完毕,标本应按序存放,并加足固定液以备复查。,四、冰冻切片取材,(一)取材 在详细检查的基础上选取最有代表性的组织,必要时应取2块或更多组织块。取材后应立即用液氮速冻,然后在-70或-40低温冰箱保存。(二)注意事项 1液氮速冻时,标本盒不能直接浸入液氮,以免组织膨胀破碎。2新鲜组织不能放入-10冰箱内缓慢冷却,否则组织内水分可逐渐析出形成冰晶,造成组织结构破坏。3冷冻后的
5、组织块应密封保存,防止脱水。4在组织块复温时,应在37加温速融,自然复温将造成组织结构破坏。,第二节 固定方法,将组织浸入某些化学试剂,使细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构和位置,这一过程称为固定。凡需病理检验的各种组织都需经过固定。一、固定的意义二、固定方法的选择 三、固定液,一、固定的意义,1保持细胞与生活时的形态相似,防止自溶与腐败。2保持细胞内的特殊成分与生活状态时相仿。经过固定,细胞内的一些蛋白质等可沉淀或凝固,使其定位在细胞内的原有部位,有利于其后物质的确切定位。3便于区别不同组织成分。组织细胞内的不同物质经固定后产生不同的折光率,对染料产生不同的亲和力,经染色后容易区别。
6、4有利于切片。固定剂有硬化作用,可使细胞正常的半液体状胶体变为半固体状凝胶,使细胞组织硬度增加,便于制片。,固定剂对组织细胞的不利影响,1影响常规染色。如用福尔马林固定时,常有福尔马林色素的异常沉积。2固定造成物质损失。不同的固定剂和固定方法会引起不同程度的细胞内蛋白质、粘多糖、脂类、核酸和低分子量物质的损失,因此应根据研究目的的不同选择适当的固定剂和固定方法,以使所研究的物质损失达到最小。3组织皱缩。甲醛、福尔马林固定的组织均有不同程度的皱缩。,二、固定方法的选择,(一)细胞内物质成分与固定剂的关系(二)常用的固定方法(三)固定时注意事项,(一)细胞内物质成分与固定剂的关系,组成细胞的主要成
7、分是蛋白质、脂类和糖类,根据研究目的不同选用不同的固定剂和固定方法,如要保存细胞内糖原用Carnoy液固定,T淋巴细胞表面抗原为不稳定抗原,极易被固定液破坏,因此常用冰冻切片进行染色。,(二)常用的固定方法,1蒸汽固定法 要固定组织中的可溶性物质,一般选用蒸汽固定法;较小而薄的标本,也可用锇酸或甲醛蒸汽固定。主要用于某些薄膜组织以及血液或细胞涂片的固定。2注射、灌注固定法 某些组织块体积过大或固定剂难以进入内部,或需要对整个脏器或动物进行固定。3细胞涂片的固定方法 可采用浸入法和滴加法。用浸入法时,可将新鲜而湿润的涂片直接浸入固定液内,如可能,应每个病例单独固定以免交叉污染。4微波固定法 微波
8、固定的组织具有核膜清晰、染色质均匀、组织结构收缩小的优点,目前已经用于病理诊断。但应严格控制固定的温度,否则会影响组织固定的质量。,(三)固定时注意事项,1固定液的量 固定组织时,固定液的量要充足,一般为组织块总体积的4-5倍。而且应在组织切取后立即或尽快放入适当的固定液中。2固定液的穿透性 一般固定液在24 h内不能穿透厚度大于2-3 mm的实体组织或0.5 cm的多孔疏松组织。3组织块的大小 厚度可根据组织类型而不同,原则上不应超过4 mm,以3 mm更为适宜。4固定时间 大多数组织应固定24 h。固定的时间与使用固定液的种类、组织块大小、温度等有关,不同的固定液有不同的固定时间,一般固定
9、时间为3-24 h。5固定温度 大多数可在室温(25)固定,在低温固定时,固定时间应相应延长。6加热 加热可使蛋白质凝固,但一般不要求加热,因为加热可加速组织的自溶。7特殊固定 用于确诊病变,保证在诊断时特殊结构保存完好。如尿酸盐结晶就需要特殊固定。,三、固定液,用于固定组织的化学物质称为固定液或固定剂,一般由单一化学物质组成者称为固定剂或单纯固定液;由多种化学物质混合组成者称为混合固定液或复合固定液。(一)单纯固定液(二)混合固定液,(一)单纯固定液,1甲醛(formaldehyde)2重铬酸钾 3苦味酸 4锇酸(四氧化锇)5丙酮 6酒精,1甲醛(formaldehyde),市售的为40%的
10、甲醛水溶液,也称为福尔马林(formalin)。此液久存自行分解,形成白色沉淀为副醛(三聚甲醛或多聚甲醛),可过滤后使用,但这种溶液中有甲酸产生,使溶液呈酸性,影响细胞核的染色,因此,储存时间长的甲醛应放入少量碳酸镁或碳酸钠,或用大理石中和。在40%甲醛中加入甲醇可阻止聚合作用。一般作为固定剂使用的10%的甲醛,是用水和40%甲醛(9:1)混合而成,实际上是4%甲醛。甲醛水溶液渗透能力强,固定均匀,组织收缩小,但经乙醇脱水后收缩较大。甲醛为非沉淀性固定剂,不能使白蛋白和核蛋白沉淀。甲醛通过使蛋白质分子发生交联而产生固定作用。因其价格较低,可用于固定和保存大标本。长时间固定的标本,甲醛氧化产生的
11、蚁酸在组织中与血红蛋白形成棕色的福尔马林色素,在制片前应注意充分流水冲洗,否则可能影响染色效果。,2重铬酸钾,常用其1%-3%水溶液作为固定剂。未酸化的重铬酸钾不能使蛋白质沉淀,但可以使蛋白质变为不溶性,保持其生活时的状态,对于细胞质的固定较好,并且可固定类脂类物质使其不溶于脂溶剂。用于固定高尔基体和线粒体有良好效果,但有溶解染色质的缺点,染色质保存相对较差。,3苦味酸,是一种强酸,易燃易爆。一般应配成饱和溶液储藏,常用其饱和溶液作固定剂。苦味酸能沉淀一切蛋白质,穿透慢,组织收缩明显,但组织没有明显硬化,可使皮肤软化,因此皮肤组织用苦味酸或其混合固定液固定时,易制作完整的切片。用含苦味酸的固定
12、液固定组织时,时间不宜超过24 h,固定后的组织应尽快放入70%的酒精,并在酒精中滴加少量饱和碳酸锂水溶液或浓氨水,有助于除去苦味酸固定产生的黄色。,4锇酸(四氧化锇),为强氧化剂,不能与酒精、甲醛等混合。常用其1%-2%的水溶液作为固定液。是电镜研究必需的固定剂,常用于后固定。锇酸的渗透力极弱,易使组织变硬,固定的组织块应小,否则内部固定效果不好。但延长固定时间,组织的脆性增加,对染色不利。,5丙酮,可与水、醇、氯仿和醚等混合,可使蛋白质沉淀,渗透力强,对核的固定差。广泛用于酶组织化学方法中各种酶的固定(如磷酸酶、脂酶和氧化酶等)。作用基本与酒精相同。,6酒精,即乙醇。有固定兼脱水作用,固定
13、速度较慢,易使组织变脆。用于固定的浓度为80%-95%。用于糖原的固定,如肝组织等糖原染色。酒精的渗透力弱,能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白。但核蛋白经沉淀后,能溶于水,不利于染色体的固定。高浓度乙醇固定的组织硬化显著,时间过长组织变脆,收缩明显。酒精一般不作常规固定剂,用酒精固定时,常先用80%酒精固定数小时,再换95%酒精继续固定。,(二)混合固定液,1B-5固定液 2Bouin液 3Carnoy液 4Helly液 5甲醛-生理盐水 6中性缓冲甲醛液7中性甲醛液,1B-5固定液,即醋酸钠-升汞-甲醛固定液。多用于固定淋巴组织。用该液固定的组织,在染色前应进行脱汞处理。,2Bouin液,常用于活
14、检标本固定的固定液。用于固定大多数组织和器官,适用于结缔组织染色。固定效果好,组织细胞结构完整。细胞核着色鲜明,但细胞质着色较差。对脂肪的固定效果好,尤其适用于含脂肪的淋巴结、乳腺组织和脂肪瘤标本的固定。固定液偏酸,对抗原有一定的损害,使组织收缩,不适宜于标本的长期保存。固定后组织被染成黄色,需用70%-80%酒精洗涤。在酒精中加入饱和碳酸锂水溶液有助于清除组织块的黄色。,3Carnoy液,固定细胞浆和细胞核,对染色体的固定佳,显示DNA和RNA效果较好。也常用于糖原和尼氏体的固定。不适宜于保存脂类,不适宜于脂肪染色。固定液有防止酒精的硬化和收缩作用,增加渗透力,可用作外膜致密不易渗透的组织的
15、固定。该液固定速度快,3 mm厚的组织块1 h即可固定,大块材料最好不超过4 h。,4Helly液,又成为Zenker福尔马林液。对细胞质固定效果好,显示某些细胞质内特殊颗粒有独特优越性,对骨髓等造血器官的固定效果好,对心肌的闰盘保存也有良好效果。,5甲醛-生理盐水,应用最广泛的一种固定液,可保护脂类和细胞核。,6中性缓冲甲醛液,为免疫组织化学最常用的固定液,对组织的穿透性好,组织收缩小。对大多数抗原物质保存较好,对细胞膜的通透性有影响,可能使某些大分子抗原失去活性。固定时间以24 h以内为宜。固定液配方:40%甲醛 10 ml,0.01 mol/L PBS(pH 7.4)90 ml。,7中性
16、甲醛液,是最常用的固定液之一,固定效果好。,第二章 组织切片技术,在取材后,经固定的标本如组织块较厚则应进行修整。有条件的应根据组织块大小分别进行脱水、透明、浸蜡和包埋,包埋好的组织块即可按需要进行切片。第一节 组织的脱水、透明、浸蜡第二节 组织的包埋和包埋方法 第三节 组织切片法,第一节 组织的脱水、透明、浸蜡,一、脱水 二、透明 三、浸蜡 四、骨和含钙组织脱钙法,一、脱水,脱水是借某些溶媒置换组织内水分的过程。组织经固定和水洗后含大量水分,水与石蜡不能混合,因此在浸蜡和包埋前必须进行脱水。脱水剂必须能与水以任意比例混合,至于选用何种脱水剂,应根据固定剂的要求,不要任意选用,否则无法得到满意
17、结果。现将一些常见脱水剂及其性能和注意事项简介如下:(一)酒精(二)丙酮(三)异丙醇(四)正丁醇和叔丁醇,(一)酒精,是最常用的脱水剂之一。它可与水随意混合,脱水能力较强,并且可硬化组织。酒精的穿透速度很快,对组织有较明显的收缩作用。为避免组织过度收缩,在用酒精作为脱水剂时,应从低浓度开始,然后再依次增加其浓度。一般从70酒精开始,经80%、90、95酒精,尔后至无水酒精。对于少数柔嫩组织应从50或30酒精开始脱水。但也应注意,对于一些需特殊处理的标本,如进行糖原和尿酸盐结晶染色的标本,为较好的保存物质的结构(它们在水中会溶解消失),应直接用无水酒精固定。经无水酒精固定的组织,更换一次无水酒精
18、脱水即可。一般情况下,组织经上述处理,即可达到脱水要求。但大量组织块同时进行脱水时,为达到满意的脱水效果,常经过95酒精和无水酒精各两次。但注意组织块在纯酒精中放置时间不宜过长,防止组织过度硬化造成切片困难。无水酒精经应用后,很难保证无水,因此应在无水酒精容器内加人硫酸铜吸收水分。硫酸铜遇水变蓝后,即应更换无水硫酸铜或更换纯酒精。但放人容器的硫酸铜最好不要与组织块接触,可在硫酸铜表面加一块滤纸。对于标本量较大的单位,应经常更换酒精,对于标本量少,又不经常进行切片的基层单位,可用以上方法。脱水的时间与组织块大小有关,对于1.5 cm1.5 cm0.2-0.3 cm的组织块,一般脱水时间如下:70
19、酒精数分钟,80、95、95、100、l00酒精各2-4 h,将酒精在温箱加温可缩短脱水时间。对于小块组织,80-100酒精30-45 min即可。但对于结构紧密的组织(如致密结缔组织等)和大块组织则不适用,应根据具体情况进行调整。另外,脂肪组织和疏松结缔组织应延长脱水时间,在95酒精中水分必须洗净,脂肪必须溶解掉。否则石蜡不能渗入脂肪细胞和纤维组织,无法切出好的切片,而且染色时也容易脱片。这样的组织蜡块,因含有水分,经与空气接触后即干燥出现凹陷。,(二)丙酮,丙酮的脱水作用与酒精相似,但对组织块的收缩作用比酒精更严重,因此一般很少单纯应用丙酮作脱水剂。在快速脱水或固定兼脱水时有时应用,脱水时
20、间约l-3 h。丙酮可作为染色后的脱水剂,用于DNA和RNA染色。,(三)异丙醇,是酒精的良好代用品,不含水,可代替无水酒精使用。脱水后组织收缩小,对组织的硬化作用也较弱。对火棉胶和染料不溶,因此不能用于火棉胶包埋和染料配制。在常规制片中很少应用。,(四)正丁醇和叔丁醇,正丁醇是无色液体,脱水能力较弱,可和水、酒精和石蜡混合,因此这种脱水的组织块可直接浸蜡和包埋。叔丁醇无毒,可与水、酒精、二甲苯混合。可单独使用,也可与酒精混合使用,是目前常用的一种脱水剂。与正丁醇相比,它不易使组织收缩或变硬,而且脱水后可不经透明直接浸蜡,浸蜡前先经过叔丁醇和石蜡1:1混合液。电镜标本制作时常用作中间脱水剂。,
21、二、透明,为使石蜡能浸人组织块,组织脱水后,必须经过一种既能与酒精相混合,又能溶解石蜡的溶剂,通过这种溶剂的媒介作用,而达到石蜡浸入组织块的目的。在这一过程中,因组织块中的水分被溶剂(如二甲苯)取代,其折射指数接近于组织蛋白的折光指数,组织块变得透亮,因此称之为透明。组织染色后,也要进行透明。用作透明剂的有二甲苯、苯、甲苯、氯仿、环己酮等。(一)二甲苯(二)苯和甲苯(三)氯仿,(一)二甲苯,是常用的透明剂,其折射指数(refractive index,RI)为1.50。它对组织的收缩性强,易使组织变硬变脆。因此,组织块(3-4mm)在二甲苯中一般30 min即可使组织透明,时间不宜过长。组织块
22、可先经过1:1无水酒精、二甲苯混合液处理,再浸人二甲苯。切片染色后进行透明,不会使苯胺染料退色。如进入二甲苯时出现浑浊,说明脱水不充分。,(二)苯和甲苯,苯(RI=1.50)和甲苯(RI1.50)与二甲苯的性质相似,对组织收缩较小,与二甲苯相比,不易使组织变脆。但透明速度慢且挥发快,吸人苯易引起中毒,操作应在通风橱或空气较流通处进行。苯对组织的收缩小,不引起组织硬化变脆,适于处理致密结缔组织、肌肉及腺体等组织的透明。脱水至无水酒精时即可进入纯苯透明,可长时间停留。甲苯多用于切片染色后的透明。,(三)氯仿,氯仿也不易使组织变脆变硬,但透明能力比二甲苯差,其RI1.45,且极易挥发和易吸收水分,用
23、作透明剂时,多用于大块组织(1 cm)的透明,而且应在容器内放置无水硫酸铜。总体比较来看,以二甲苯最为常用,而且一般工业用二甲苯即可达到透明效果。用二甲苯透明时,一般经过2-3次纯二甲苯溶液,每次10-15min。同时也应根据组织的种类和组织块大小以及液体的新鲜程度加以调整,不应机械照搬。如脑组织和凝血块,应缩短在二甲苯内的留置时间。而肌肉组织和胃肠组织则应延长。,三、浸蜡,组织经透明后,在熔化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡。为使石蜡充分渗入组织块中,常需经过2-3次石蜡浸渍才能完成。在第一次石蜡中加入少量二甲苯或用低熔点的软蜡,尔后再浸入高熔点的硬蜡效果更好。一般用于浸蜡的石蜡熔点为52-56。但
24、具体应用时还应考虑当时的情况,一般在夏天气温较高的情况下,应采用高熔点的硬蜡,而在气温较低的季节,应用低熔点的石蜡,这样有利于切片制作。组织块总的浸蜡时间约3-4 h。当然也应根据组织块的种类和大小以及温度情况加以灵活掌握。时间不宜过长,否则易造成组织块脆硬,时间不足,也难制作良好的切片。,对于一般的动物组织,脱水、透明和浸蜡时间如下:75酒精 长短不定 85酒精 120-300 min 95酒精I和 II 120-300 min ll 无水酒精I、II 和 III 30 min 无水酒精 III 60-120 min 二甲苯I和 II 30 min 二甲苯III 60 min 56-58石蜡
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