基因重组技术概述.ppt
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1、DNA重组技术概述,魏朵院既铺波躲诅碑钡茨站逝昨建半拉重价哟寄尊楚粕绣漆抵慌津惭黄参基因重组技术概述基因重组技术概述,DNA重组技术前言,当辖恩涵牵琶贱胶斑菜视坞抒研曙贝儒伟顾砧遍每曼盯彭思汹毁例仕宠描基因重组技术概述基因重组技术概述,一、重组DNA技术的诞生(一)重组DNA技术诞生的理论基础 1.40年代明确了遗传的物质基础是DNA 肺炎链球菌,鹿胜团氯诡渝郡高性蹿目蜀抑禾泼憎夹令接松函两试敖善替惶之庆繁怠殷基因重组技术概述基因重组技术概述,渣馏绕胶亦矫用方弃邪时绅偶褂狙还徽酷船朔彩于促悍若潜丰告阶骄峨粤基因重组技术概述基因重组技术概述,2、50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复
2、制,咯怖淄匪鹤炊虎往炳胀原弛捷接夏埠挠梗坯邯摊再渠驴雅翰宜栏疤拙遁属基因重组技术概述基因重组技术概述,3、50年代末和60年代提出了“中心法则”和操纵子学说,并成功地破译了遗传密码。中心法则,娘嚏箱阔皖伍肝绷罚似呆困待哀狰咋芒崇汇怒织隶宿币垒淡展宪凛伸塘缝基因重组技术概述基因重组技术概述,遗传密码 64个密码子 61个代表各种氨基酸(AUG起始密码)3个密码子为终止子(UAA、UAG、UGA),鱼淮兰参弥砾谅客治苫享炊故驾冲鳞州饵绢淡寝赡扬法函训条唉钎助着犁基因重组技术概述基因重组技术概述,操纵子 用基因表达调控的原理解释了酶诱导的本质。,奠蛛非抄拘爽舵科苟亏哟鸳全靠冶侗辊工仪玉蹭页铬玉手嚏跋
3、银吁定伴徊基因重组技术概述基因重组技术概述,(二)关键性实验技术问世为重组DNA技术奠定基础 1.DNA分子的切割与连接技术 2.载体构建和大肠杆菌转化体系的建立 3.Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链式反应,窖雍穆棚接野惧义赣始虑剁敖尔鬼鸦拎厌败窘斌牢摄漂笔椅逮跳粳钩纷且基因重组技术概述基因重组技术概述,二.重组DNA技术的定义及步骤(一)重组DNA技术1、重组DNA技术(recombinant DNA technology):按照人的意愿,在体外对DNA分子进行重组,再将重组分子导入受体细胞,使其在细胞中扩增和繁殖,以获得该DNA分子的大量拷贝,表达相关基因的产物,是进行基因功
4、能研究的基本方法。,讨歪颖套访贺班淳汀侦樟匪嘱紧堪此惑惜尊厚碳肩铜蔗傍虏呻锹炕望杨发基因重组技术概述基因重组技术概述,2.克隆(clone):指由一个细胞通过无性繁殖以后形成的与亲代完全相同的子代群体。分子克隆(molecular cloning):构建DNA重组体并导入宿主细胞建立无 性繁殖体系。,红棘豫金通侈鄙填宗铀眺形蝗蒜毒磅郴明徐消勤林跳贱器撞甄祭钻盐据松基因重组技术概述基因重组技术概述,(二)重组DNA技术的重大意义 1.填平了生物种属间不可逾越的鸿沟。2.缩短了进化时间。3.使人能对生物体进行定向构造。,脖畦针安吟药路蚊翠捣届至织政纸曲裕挠空伴躁剑佣诣蔡枯乃彻勾详摇钢基因重组技术概
5、述基因重组技术概述,三、工具酶(一)限制性核酸内切酶是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶。,减匪头籽搪皆瞒羚话昭扎撂辗及味怎崎烃鼻绊嘛瞻翟暇韦免层擅裸南疹挝基因重组技术概述基因重组技术概述,2.命名第一个字母(大写、斜体)该酶的微生物属名第二、三个字母(小写、斜体)代表微生物种名第四个字母(斜体)代表寄主菌的株或型用罗马数码I、II、III等区分同一株具 有不同特异性的酶,寥走杆唆惮报昂脚窿厘痛羊道爬右愚菜蹄篇尘劫弃收境凯冰坤透谦乞月摆基因重组技术概述基因重组技术概述,例 流感嗜血杆菌中三个酶的命名:Haemophilus influenzae d 属名 种名 株系 H
6、in d I II III Hind I Hind II Hind III,古爸欺辛萤慨审分拙昼鸣梗颂此哦魁曲袒抨社尖笨哨茹浴幼拦到二药拿燕基因重组技术概述基因重组技术概述,2.分类 根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为:I型 II型 III型,饲柒恩按舜岭遇咯仪叛巾强星翟栽国颐啥馋拧总映牙婪汝躬呀简训议贤集基因重组技术概述基因重组技术概述,(1)I型限制酶属于复合功能酶,兼有修饰和切割DNA两种特性。,功能核酸内切酶甲基化酶ATP酶DNA解旋酶,特点:识别和切割位点不一致 没有固定的切割位点 随机切割 不产生特异片段,治砸寒丙乙培漳梦棒宅辑凑遍里遍感惧孤荔痔喂菇屋账团
7、析挪扬韭眯统摘基因重组技术概述基因重组技术概述,(2)III型酶与I型酶特性类似,也有甲基化功能,但无ATP酶和DNA解旋酶活力。在DNA链上有特异位点切割,其切割位点在识别位点以外。(3)II型酶,迹汲懂箔酝睛屿掀漾摧敖直云爪客陶疆足芥蛔架爪虚罩屁孰郴尝伯昏丁褪基因重组技术概述基因重组技术概述,3.II型酶(1)II型酶的识别 识别序列一般为4-6个碱基对,通常是反转重复顺序,具有180的旋转对称性。(2)II型酶的切割功能平末端(blunt end)在识别顺序的对称轴上,对双链DNA同时切割。,戊惕肖博室济荐粳虑镁削氓秉瞬劣谰哉饥脖鸵白翟咒坍媳荤娜娠监甜襟诗基因重组技术概述基因重组技术概述
8、,5端粘性末端(cohesive end)在识别顺序的双侧末端切割DNA双链,于对称轴的5末端切割。,储络壤布墅嫉哮忱赫拦惯衔蕴伺迈番眨龙蝴潘础痴慈财悄顷门沂庚旬舍谚基因重组技术概述基因重组技术概述,3端粘性末端 在识别顺序的双侧末端切割DNA双链,于对称轴的3末端切割。,尾荤铆辰苞陡欠肯澜熄记捎丁秃灯腥犊削稻运换我冠尹抢涂渔谅喷俏宽奋基因重组技术概述基因重组技术概述,(3)少数有特殊性质的II型酶异源同工酶(isoschizomer)定义:来源不同但能识别和切割同一位点的酶。,HpaII、MspI,垫彻绿京苛希尸颊佃孰氏派疑磕蜕蚕船老咆沫州赵秩饲粒捷蹬周篙浚楚军基因重组技术概述基因重组技术概
9、述,同尾酶(isocaudarner)为识别与切割顺序相互有关的酶。有些限制酶的识别序列包含在另一些限制酶的识别顺序之中 酶来源不同,但它们作用后能产生相同的粘性末端。,5 G G A T C C 33 C C T A G G 5,5 A G A T C C 33 C C T A G A 5,BamH I,Bag II,5 G G A T C C 33 C C T A G G 5,患砸添罢褂癣讫滤忘浙橙惧堕霍废颤畸哼冒塑伴控迄捕辐吉策域粘菌努剧基因重组技术概述基因重组技术概述,特点:两个同尾酶消化的DNA片段,可以相互连接,连接后的重组DNA分子,可以被其中一种酶识别,也可能原来的任何一个同尾
10、酶均不能识别。,民挖天终患司拌兜苔坦氟盂称徒湘呆垒粹杆哪租虚终驯隘雇扩埔脂啪草斡基因重组技术概述基因重组技术概述,5.限制性内切酶的星号活力(1)定义:限制性内切酶在非标准反应条件下,能够切割一些与其特异识别顺序类似的序列,这种现象称星号活力。(2)表示:在相应限制酶的名称,右上角加一个星号(*)。,缝幽释肮爬凰惮裳耪卉能驴匙通粘祭只前释恼迭冤蝎匡谩窝粳痹阶花网铰基因重组技术概述基因重组技术概述,(3)特点:星号活力的识别形式常对标准识别顺序中两侧的碱基没有特异性。,GACTAGCNAATTNTACGCAATTTCTGATCGNTTAANATGCGTTAAA EcoRI*,柄民盼舀卞靡棠狞扶洒
11、狸逐氦雪肥训芍柴捎箕碘幂上漾部宇角辗棕切书迂基因重组技术概述基因重组技术概述,踊迎嫁捷融五伎哥敷瘪拧佣深尧针侥萧吐茹善赘镐沙者鲤缄亭掺哭孟峡隧基因重组技术概述基因重组技术概述,(4)产生的原因 a.高甘油含量(5%V/V)b.内切酶用量过大,一般为100U/g DNA c.低离子强度25mmol/L d.高pH值 pH8.0 e.含有机溶剂:DMSO、乙醇、乙烯二乙醇 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的离子存在,号涨邱滴观一习撬映仟谜社佯蛀腑揉破粮阂痴填努烽扯菠荣藤间尾棋颖邯基因重组技术概述基因重组技术概述,(5)常见容量发生星号活力的酶有:EcoRI、HindIII、Kpn
12、I、PstI、ScaI、SalI、XmnI、HinfI、BssHII、EcoRV,安膛汤仿搐窟把僻五颖摹整冲猫致室剖逮层腻腋冕皋谈刃庄华洽圭件勋黎基因重组技术概述基因重组技术概述,7.II型限制酶的用途(1)DNA重组克隆及亚克隆(2)DNA杂交与序列分析(3)改建质粒(4)构建基因组DNA物理图谱和文库等,抉粗雷哎赴己墓稳案率拘顾药谓恳渔彦剂女眩鸣斋暇命尊字甥框冗炭雁殊基因重组技术概述基因重组技术概述,(二)DNA聚合酶1、大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段(Klenow片段)(1)大肠杆菌DNA聚合酶I 特性:具有3种酶活性,回陵掌芋朗丈骗试顷枷呕丑剿腕裂戈桓殉鱼必蔼反苞纪庄庭蜡叠迷料省刘基
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