第六章一般毒性1.ppt
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1、第六章 一般毒性作用(General Toxicity of Xenobiotics),汪春红027-68759956,补充参考书,周宗灿,付立杰主编.现代毒理学简明教程.军事医学科学出版社,2012卡萨瑞特 道尔著.毒理学基础周宗灿主编.毒理学教程(第3版).北京大学医学出版社,2006,All substances are poisons,there is none which is not a poison.The right dose differentiates a poison and remedy.No substance is a poison by itself.It is
2、the dose that makes a substance a poison.Paracelsus(1473-1548)欧洲医生,医药化学运动的始祖所有物质都是毒物,没有不是毒物的物质,唯有剂量使之区分为毒物还是药物 物质本身不是毒物,主要是剂量才使一个物质变成毒物,毒性评价或安全性评价的基本目的,受试物毒作用的表现和性质剂量反应(效应)研究确定毒作用的靶器官确定损伤的可逆性其它:敏感检测指标和生物学标志、毒作用机制、毒物动力学、中毒的解救措施,毒性试验的设计不是为了证明化学品的安全性,而是为了表征化学品可能产生的毒作用。,第一节 概述(毒理学实验基础),描述毒理学是以动物中毒模型(mod
3、el)模拟/预测人中毒原型(prototype),实验动物体内实验是常规试验。,gy,外推,A.人是最敏感的物种B.人和实验动物的生物学过程包括化学物的代谢与体重(或体表面积)相关。以单位体表面积计算在人产生毒作用的剂量和实验动物相近,以体重计算则人通常比实验动物敏感,差别可达10倍。如果某一化学物对几个物种实验动物的毒性是相同的,则人的反应也可能是相似的,毒理学研究方法,体内试验体外试验,人体观察流行病学研究,动物实验,人群调查,以实验动物为模型,最终目的是通过外源化学物对实验动物的毒性反应,向人(原型)外推,以期评估外源化学物对人的危害及危险性。,筛选和预测急性毒性和机制研究,进一步深化和
4、证实在动物实验中所得到的资料,动物实验,整体动物实验(in vivo),体外试验(in vitro),一般毒性试 验,特殊毒性试 验,微 生 物试 验,哺乳动物试 验,急性毒性重复剂量毒性亚慢性毒性慢性毒性,致突变致癌致畸,致突变,器官水平组织水平细胞水平亚细胞水平分子水平,实验动物单次、多次或长期染毒所产生的综合毒性效应,以动物实验为中心,动物实验的设计、实施、结果观察和评价是毒理学研究 的基本功,Lumley(1990)/Igarashi(1994)根据有限的临床资料报告对人的毒性约一半不能由临床前(动物)毒性研究预测。Heywood(1983)报告27个化学物(多为药物)的靶器官毒性在大
5、鼠和狗(或猴)之间的相符率仅20%。Olson等(1998)报告131种化学物对动物的毒性与人的毒性的相符率,啮齿类6%,非啮齿类28%,合并达36%,所有物种相符率可达69%。按照目前的广泛进行毒理学安全性评价,可在一定程度上提高新药和各种化学品的使用安全性,但仍不能完全排除对人健康危害的风险WHO在临床前药物安全性实验原则的文件中指出:虽然事先对生物活性物质进行了最仔细彻底的研究,但给人使用时总是不可能避免地要冒一定的风险,基本假设为:人是最敏感的动物物种;人和实验动物的生物学过程包括化学物的代谢,与体重(或体表面积)相关。这两个假设也是全部实验生物学和医学的前提。以单位体表面积计算在人产
6、生毒作用的剂量和实验动物通常相近似。而以体重计算则人通常比实验动物敏感,差别可能达10倍。,2.实验动物必须暴露于高剂量,这是发现对人潜在危害的必需的和可靠的方法。,描述毒理学实验的基本原则,1.化学物在实验动物产生的作用可以外推于人,此原则是根据质反应的概念,随剂量或暴露增加,群体中效应发生率增加。,选用成年的健康(雄性和雌性未孕)实验动物是为了使实验结果具有代表性和可重复性。以成年健康实验动物作为一般人群的代表性实验模型,而将幼年和老年动物、妊娠的雌性动物、疾病状态作为特殊情况另作研究。这样可降低实验对象的多样性,减少实验误差。,3.成年的健康(雄性和雌性末孕)实验动物 和人可能的暴露途径
7、是基本的选择,外源化学物以不同途径染毒,实验动物表现的毒性可有很大差异。因此,毒理学试验中染毒途径的选择,应尽可能模拟人接触该受试物的方式。,毒理学实验的局限性(不确定性),WH0在临床前药物安全性实验原则文件中指出“虽然事先对生物活性物质进行了最仔细彻底的研究,但给人使用时总是不可避免地要冒一定的风险。”这就是利用动物实验的局限性。,1、实验动物结果外推到人的不确定性。实验动物和人对外源化学物的反应敏感性不同,有时甚至存在着质的差别。,2、高剂量结果向低剂量外推的不定期性。,4、小数量实验动物结果外推大数量人群的不确定性。毒理学实验所用动物数量有限,那些发生率很低的毒性反应,在少量动物中难以
8、发现。,5、一般人群结果外推易感人群的不确定性,3、异质性小的群体外推异质性大的不定期性。,6、不同暴露方式(途径、期限、频率)的结果的外推不确定性,1统计原则,随机:代表性对照:鉴别处理因素与非处理因素的差异及处理因素效应大小,消除和减少随机化原则所不能控制的抽样误差及实验者操作熟练程度等造成的差异 空白/阴/阳性对照,自身对照,历史性对照重复:样本量、重复次数,实验设计过程应遵循基本原则,2动物选择原则,首先考虑代谢与毒性效应上与人一致注重对受试物毒性敏感的动物物种种属、品系、个体差异自然寿命不太长、易于饲养和实验操作、经济易获得动物年龄、性别,毒理学实验设计基本原则,没有一种实验动物完全
9、符合物种选择的原则,目前常规选择2个物种:啮齿类+非啮齿类,急性毒性试验:大鼠、小鼠、狗亚慢性、慢性:大鼠、狗皮肤刺激试验和致敏试验:兔、豚鼠眼刺激试验:兔遗传毒理学试验:小鼠致畸试验:大鼠、小鼠、兔致癌试验:大鼠、小鼠迟发性神经毒性试验:母鸡,为什么常选大、小鼠呢?,因为它的毒性反应与人较为一致,而且繁殖快、易饲养、价格便宜且易获取。使用实验动物来推论于人必须慎而慎之。因为动物的反应敏感性一般不及人。曾有报导发现有138种化合物人对之反应比大鼠更为敏感。,人与大鼠对不同化合物的急性毒性敏感比值,*以大鼠为1,人:大鼠,另外,由于不同种属动物其生理状况不一,在做实验时要根据实验需要注意:啮齿类
10、动物:无呕吐反应猫、狗:呕吐反射灵敏,可用于研究引发呕吐的实验兔、豚鼠:多用于经皮肤接触的毒作用研究。猴:用于一些特殊的实验。,实验中小动物至少应为清洁动物及以上级别,国际上SPF动物已成为毒理学实验的标准实验动物。,实验动物微生物等级标准,3剂量分组原则,实验动物必须暴露于高剂量,这是发现对人潜在危害的必需和可靠的办法。除对照组外,一般设3个或3个以上剂量组,以观察剂量-反应(效应)关系,确定受试化学物引起的毒效应及其毒性参数。,高剂量组:应出现明确的有害作用,或高剂量组已达到极限剂量或染毒的最大剂量低剂量组:应不出现任何可观察到的有害作用(即相当于NOAEL),但应当高于人可能的接触剂量,
11、至少等于人可能的接触剂量中剂量组:介于高低剂量组之间,应出现较轻的毒性效应(相当于LOAEL)三组剂量一般按等比例计算,低剂量组一般为高剂量组的1/10-1/20,4试验期限,一般由毒性实验的定义决定:急性毒性:一次或1d内多次观察14d 亚慢性毒性:持续至实验动物寿命的10%(大/小鼠90d,狗1年)某些试验(如致畸和多代生殖试验)由受试实验动物物种或品系决定。,5给受试物途径,尽可能利用人拟用途径 吸收速率:静脉注射吸入腹腔注射经口经皮,质量控制,优良实验室规范(good laboratory practice,GLP):严格控制可能影响实验结果准确性的各种主客观因素,降低试验误差,确保实
12、验结果的真实性 实验操作规程、试剂/动物选择、仪器使用、实验环境 安全性评价的最终产品并没有实体,而是数据。因此,难以通过检查最终产品来保证其质量,只有通过保证有关安全性试验的计划、实施等所有的因素和过程的可靠性才能保证最终产品的可靠性,毒理学实验结果评价,统计学意义生物学意义毒理学意义,统计分析,是否具有统计学意义是否具有生物学意义,即是否是真实的效应是否具有毒理学意义,即是否是有害效应,有统计学意义无生物学意义,有统计学意义有生物学意义,无统计学意义无生物学意义,无统计学意义有生物学意义,I,II,IV,III,毒理学实验结果评价,统计学意义生物学意义毒理学意义,在判断生物学意义时应先考虑
13、:剂量依赖性趋势 结果的重现性 相关指标结果的一致性 差别的大小和类型 两种性别的一致性,一般毒性,外来化学物在一定剂量、一定接触时间和接触方式下对试验动物产生的综合毒效应,即基础毒性特殊毒性:致癌、致畸、致突变 生殖发育毒性,污染物理化特性,了解毒性大小和特征,了解在体内蓄积和耐受,了解对机体毒作用靶点和指标,确定阈和阈下剂量,急性毒性试验,亚急性毒性试验,亚慢性毒性试验,慢性毒性试验,一般毒性试验,外源化学物对全身各系统的毒性效应全身各系统对外源化学物的毒性反应,目的要求,掌握一般毒性作用的概念、试验目的熟悉一般毒性试验方法要点熟悉蓄积毒作用概念了解蓄积毒作用研究方法,第二节 急性毒性作用
14、acute toxicity,机体一次或24h内多次接触外源化学物后在短期内(最长14天)所产生的毒性效应,包括一般行为和外观改变、大体形态变化以及死亡效应,一、急性毒性的概念,急性毒性(acute toxicity),急性毒性的概念,需要注意,急性接触的次数 一次:经口、注射;呼吸道、皮肤(一段时间)24h多次(不超过3次)中毒效应出现的时间 不能仅以接触毒物后毒性症状出现的时间,主要以接触毒物的时间,观察时间:714天强度 一次性大剂量,中毒症状明显,常发生死亡,二、急性毒性试验的目的,求出致死剂量及其他急性毒性参数观察中毒表现、毒作用强度和死亡情况,初步评价毒物的毒效应特征、靶器官、剂量
15、-反应(效应)关系 等为其他毒理试验提供接触剂量和选择观察指标的依据为毒理学机制研究提供线索,急性毒性的参数半数致死剂量:LD50,GB15193.3-2003食品安全性毒理学评价程序和方法的急性毒性分级标准,急性毒性危害类别和急性毒性估计值(GHS)(WHO-全球化学品统一分类和标签制度),急性毒性的参数剂量-反应曲线ED,TD:ED50,TD50,(1)霍恩法(Horn)(2)改进寇氏法(3)Bliss法 最大似然性法(maximum likelihood method),最精确的计算方法,LD50的几种计算方法,(1)霍恩法(Horn):(剂量递增法/平均移动法)剂量对数与死亡率(反应率
16、)的转换数(概率单位)呈直线关系。简单、精确度不够!4个剂量组,每组动物数相等(4-5只),剂量按等比级排列一般为2个参考染毒系列:剂量组距为2.15倍或3.16倍根据每组动物数、组距、每组动物死亡数,查表求出受试物LD50、95%CI,LD50的几种计算方法,(2)改进寇氏法(Karber法/平均致死剂量法),利用剂量对数与死亡率呈S型曲线而设计的方法该法计算简便,准确率高,较为常用要求:每组动物数相同、至少5个实验组、各剂量组组距呈等比级数、死亡率呈正态分布、最低剂量组死亡率80。,lgLD50及其95可信限为1.35211.960.02131.35210.0417LD50及95可信区间范
17、围为22.50mgkg(20.4424.76mgkg),(1)霍恩法(Horn)(2)改进寇氏法(3)Bliss法 最大似然性法(maximum likelihood method),最精确的计算方法,LD50的几种计算方法,三、急性毒性试验方法的要点,经典急性毒性试验:死亡急性毒性替代试验,固定剂量法,急性毒性分级法,上-下移动法(阶梯法),限量试验,经典急性致死(LD50)试验设计流程,总体原则,经典急性毒性试验,实验动物染毒途径染毒剂量观察周期观察指标的选择、计算方法和评价,急性毒性反应与人近似 易于饲养、操作方便 繁殖力较强,数量较大 价格较低,易于获得,(一)实验动物的选择和要求,主
18、要原则,除特殊需要外,首选哺乳动物,实验动物的物种和品系,啮齿类(rodent species),非啮齿类(nonrodent species),小鼠:昆明种、NIH、ICR,大鼠:Sprague-Dawley(SD)、Wistar,犬或猴,为了有利于预测化合物对人的危害,要求选择两种以上的实验动物,最好一种为啮齿类,一种为非啮齿类,分别求出其急性毒性参数。,根据接触途径选择实验动物,急性经口和吸入毒性试验大鼠、小鼠,急性经皮毒性试验成年大鼠、豚鼠、家兔,实验动物的物种和品系,实验动物的年龄和体重,刚成年、健康、未曾交配和受孕的动物小动物根据体重同一次试验相同性别实验动物起始体重变异范围不应超
19、过平均体重的20%,实验动物的生存年限与体重选择,实验动物的性别,雌雄各半如雌、雄动物毒效应有明显差异,应分别并求出雌性和雄性动物的LD50值特殊的试验研究可仅作单一性别的急性毒性试验,实验动物分组与数量,根据组数和每组数量来决定总数量LD50,一般为4-6组大、小鼠每组每性别至少5只,犬类3只严格遵循随机、均衡的原则,随机性:每只动物分散到各组去的机会均等,以避免成见或系统误差均衡性:各组动物的平均体重及体重的离散度尽可能一致 每只动物的体重不应超过全体实验动物平均体重的20%每组之间的平均体重相差不应超过10%,控制离散度,控制均衡性,实验动物的预检,给药前检疫观察大、小鼠、兔、豚鼠1周,
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