[历史学]伦敦大学帝国学院igem项目之 学习笔记.doc
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1、伦敦大学帝国学院igem项目之 学习笔记一:荒漠化土壤侵蚀和荒漠化是全球范围内的问题。导致耕地的损失,经济困难和环境退化。我们的项目侧重于解决这些严重问题的工程菌,以提高植物根系生长。我们正计划来实现我们的细菌带入一个种皮,以帮助重新植被的土地侵蚀的风险。树木和植物有助于保持土壤和防止水土流失,导致荒漠化。荒漠化是下降的,其中包括干旱,半干旱和亚湿润干旱地区的干旱地区。干旱地区近40的地球陆地约两个亿人,其中大部分生活在发展中国家。旱地土壤维持一个脆弱的生态系统,适应罕见的降水和剧烈的温度变化。过度开发旱地种植和原料用途的土壤呈现无益的,强迫迁移的社区搜索肥沃的土地,离开贫瘠的土地裸露,容易受
2、到侵蚀力。在许多发展中国家的粮食供给缺乏强制的土地短期收益,以及砍伐森林,耕地不断培养。影响:土壤侵蚀影响的气候和生物多样性,往往会导致不可逆的荒漠化。罗茨提高土壤的稳定性和防止水土流失 。此外,树木提供掩护和保护附近的动物和植物。在容易发生水土流失的区域,这是特别重要的,因为降雨往往是罕见的,但是当它发生,它往往是非常激烈的,很容易造成表土被冲走。二:植物路线趋化性是根据吸引或排斥的化学品的细菌的运动。根系分泌多种化合物,大肠杆菌 大肠杆菌不会被吸引到自然。因此,我们设计了一种化学感受器到我们的底盘,可以感知苹果酸盐,一个共同的根渗出物中,以便它可以向根游泳。此外,E. 大肠杆菌都在积极采取
3、了由植物的根,这将使成根,我们的系统,有针对性的IAA交付。主要由细菌运动对植物根系的植物路由模块。细菌运动的根源,微生物到自己的根。事实上,细菌,它们被用来对营养物质的植物,在植物的根,是一个新的发现,去年只当Paungfoo Lonhienne等 。非致病性大肠埃希氏菌的吸收到根的拟南芥(豆瓣)和番茄(番茄植物)。他们已经成功地复制了这些调查结果。为他们的项目,这是特别有趣的,将暴露于作为植物内的根细胞,这显着影响的细菌浓度的IAA需要产生的,以实现最佳的根生长的细菌的生长素。此外,植物路线有可能被用来作为一个平台,提供化合物,自然不会发生在工厂,没有基因改造植物本身的根。 (1)细菌趋他
4、们的主要底盘,湿实验室的实验是大肠埃希氏菌。趋化性E. 大肠杆菌是有据可查的。这些细菌可以执行两种类型的运动,翻滚和光滑游泳。两者之间的差异被确定由鞭毛运动。在翻滚运动,鞭毛顺时针移动。这是崔泰源-P和FLIM的,一体的鞭毛相关蛋白之间的复合物的形成引起的。在平滑游泳,鞭毛逆时针移动。崔泰源未磷酸化,并因此,不能与鞭毛蛋白,导致在相反的方向旋转的鞭毛。平滑游泳是运动,进行细菌对引诱或远离剂。平滑游泳是控制趋化蛋白的信号转导通路,使一些示范。图1:大肠杆菌细胞表达superfolder GFP(sfGFP)的拟南芥根的植物与细菌培养过夜后利用共聚焦显微镜可以看到里面。根在PBS中洗涤,成像前,以
5、避免“假阳性”的根的外侧附着的细菌。根内的细菌对于一个很酷的3D视频,看看我们的结果页。(数据和影像帝国IGEM 2011)。 (2)产品规格1。应积极迈向根的细菌。为了做到这一点,需要的细菌是能够感应到一个共同的根渗出物。我们选择了重新布线E. 大肠杆菌的趋化通路朝着L( - )的苹果酸(也简称为苹果酸),柠檬酸循环中发现的化合物。它是由分泌的根在低浓度。2。根吸收的细菌进入。吸收细菌进入根,接着所分泌的天然化学物质提出了一个新的平台,为修改而基因改造植物基因组的植物。3。在我们的机箱的外源基因的高效表达。由于我们是从土壤细菌的基因导入到E. 大肠杆菌我们必须考虑到影响密码子偏性,可以发挥我
6、们的结构的表达。因此,我们必须确保我们的结构并不受这种现象的表达。(3)设计目标是确保制定的规格。1。这种细菌应该感觉到苹果酸,积极迈向根。虽然苹果酸敏感的传感器不自然地发生在E. 大肠杆菌,他们已经确定了其他一些细菌的种类,包括土壤中的微生物铜绿假单胞菌 PA01株和恶臭假单胞菌 KT2440株。PA2652是一个敏感的苹果酸的化学感受器中发现P. 铜绿微囊藻和MCP是一种受体,发现P. 恶臭响应一些TCA循环的中间体,包括苹果酸的1 2 。铜绿假单胞菌和P.趋化的分子机制 恶臭不同的大肠杆菌 大肠杆菌。然而,有高度的结构相似性的蛋白质,使在这些生物体的趋化性途径之间。因此,这是合理的假设,
7、PA2652或MCPS域的将互动与本地的趋化途径E. 大肠杆菌,细菌将能够执行引入受体结合的趋化反应后,苹果酸盐。2。他们的底盘中的高效表达。他们用他们的密码子优化软件优化PA2652结构(BBa_K515102)表达的E. 大肠杆菌。3。构建体必须是如模块化尽可能。表达的苹果酸的化学感受器的基因结构并不复杂。然而,他们是模块化的。目前的结构,表达组成型启动子J23100受。这是的组成启动的零件注册表中最强的之一。我们选择了这个,因为它是更容易的一个结构调整的表达,而不是调整它的启动子。要表达的遗传结构调整,我们已经推出了15个基点绝缘体序列,可以方便的启动子通过PCR使用的互换性和微调的表达
8、水平。确保启动子替换时不改变的核糖体结合位点的TIR(翻译起始速率)。PA2652和MCP翻译起始率,分别为42010和44050。4。根吸收的细菌进入。根系的吸收都E. 大肠杆菌和面包师的酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中可以观察到的模式生物拟南芥,并在番茄植株。这是一个自然发生的过程,(虽然它在土壤中,则仍有待观察),我们并不需要把额外的基因,我们的设计吸收发生。(4)模型1)简介趋化性上升趋化因子(如在我们的项目中的苹果酸)的浓度梯度和远离的驱虫剂是细菌的运动(例如毒物)。E. 大肠杆菌是太小的,检测到任何在其两个端部之间的浓度梯度。这些细菌周围的环境重新
9、取样,每隔3-4秒,无论是翻滚导致细胞或运行。趋化因子短暂的“翻滚”(或偏见)的概率增加。这之后,由感官的适应过程,返回到基线偏置,使细胞进一步的浓度变化来检测和响应。在趋化因子浓度的变化在空间上均匀的环境中增加一小步的响应时间从1秒到2-4秒。改变的饱和水平的趋化可以增加响应时间到几分钟。每一个化学感受器上的细菌周质结合结构域和一个胞内信号结构域通信的鞭毛马达通过CHEA,崔泰源,和Chez蛋白的磷酸化继电器顺序。趋化通路建模的结果,将决定的阈值用于细菌检测的趋化因子的浓度和饱和细菌趋化检测成为在哪一级,降低细菌的趋化反应的效率。2)模型的趋化途径 2.1目的使用MATLAB模型的趋化作用的
10、途径和8M化学感受器,从而确定检测阈值和饱和度水平的趋化因子的细菌。因为它被认为应放置在靠近最佳生长的种子( 0),翻滚频率减小,因此翻滚的概率减小。参考中的式(10)6,我们知道,当C t1的 -C t2的 0,翻滚随着chemostatic常数,细菌速度,浓度差之间相邻的时间点和角度之间的指数函数的概率的两个时间点。8因此,我们可以凝聚上面的描述,下面的语句:3.3结果与讨论3.3.1 Baterial趋化实验室在实验室条件下,趋化因子从源头上不断扩散,因此,趋化因子随时间变化的分布格局。的误差函数(方程2)在这种情况下,被用来描述的非稳定状态下的趋化分布。对于趋化的湿实验室的实验,用户界
11、面设计的实验方法来验证其可行性。最初,一个实验的目的是作为放置一定数量的细菌的6厘米距离与不同浓度的趋化源。放置100个细菌的趋化性的模拟的6厘米远离5 mM的苹果酸源示出在下面的电影。而这MATLAB程序具有一个图形用户界面(GUI)(图4),它可用于由湿实验室学生简单的输入参数和生成静态的图形或动画。图4: MATLAB的图形用户界面,(帝国学院2011年iGEM比赛的球队)。上面的视频显示,趋化需要14000秒扩散到菌落。在这段时间内的细菌会被复制到所有的板。因此,从建模,可以推断,这些实验结果可能无法清楚地表明趋化性(看到的结果,在我们的湿实验室)。因此,设计了新的实验设置,作为趋化因
12、子被保持在毛细管和以及与细菌悬浮液放入;诱食扩散入井设置浓度梯度。细菌游泳的浓度梯度,给定的时间后进入毛细管,毛细管被除去,并在毛细管中的细菌数进行计数。表明在图5示出在整个实验设计。这种新的模式整合,完善我们的实验结果。这进一步细化又是通知的设计,我们的分析,这将导致更准确的数据,从而创造出精致的植物检疫路由模块之间的循环的建模和湿实验室。图5:演示实验装置的毛细管分析。(图由伦敦帝国学院2011年iGEM比赛的球队。)毛细管和趋化因子的分布状况是不同的。因此,两种趋化因子分布状况进行了推导,推导的详细信息,请在这里下载。示出的单核细胞趋化在阱的分布,在毛细管内的分布方程中所示的等式3和等式
13、4。同样地,一个用户接口的设计,使湿实验室学生不同的输入参数(图6)。以下的视频显示的模拟与1000个细菌,用直径为1mm的填充用1mM的趋化chemotaxing朝向毛细管。图。图7示出了在每个时间点在毛细管中的细菌数量。该模型表明,在毛细管中积累的细菌,是在3600秒的最大数目。因此,我们的模型表明,的湿实验室的学生应执行本实验为60分钟,然后收集数据。图6: Matlab的图形用户界面,为我们的趋化毛细管分析。(帝国学院2011年iGEM比赛的球队)。图7:细菌的数量在毛细管与时间(帝国学院2011年iGEM比赛的球队)。3.3.2在土壤中的细菌趋在现实的土壤,苹果酸盐用作趋化。马拉特是
14、不断从根尖分泌3 mM的9的浓度。在这种情况下,苹果酸源总是补充由于持续分泌从根和分配方式可以被认为是稳定的(即与时间无关)。的稳定状态Keler的谢格尔模型是用来证明这个分布(公式5)。真正的苹果酸在土壤中的分布显示在图5。细菌趋药性的路径,当将细菌在稳态苹果酸分布在不同的位置上时,表明在图5。图8(a):的苹果酸盐的距离(1D),图8(b):苹果酸盐用半径(2D)中的分布的分布,图8(b)示出的位置的阈值检测的浓度(1e的-8 M的半径= 0.028 m)和饱和浓度(是1e-5 M的半径= 0.012)。图9:与细菌的趋化性放置在不同的起始位置。 蓝:210 5秒趋化开始于半径= 0.01
15、5米(之间0.012 m和0.028米的),绿色:210 5秒趋化开始于半径=0.008米,这是小于0.012。这表明的细菌的趋化反应是低效的,当它们被放置在从根尖端0.0028米0.0012米。绿线表示,这种细菌可保持接近的种子,当它被放置在远离根尖的距离小于0.012米。因此,该模型表明,这种细菌被放置在一个距离小于0.012米,在我们的项目实施。最后,用于细菌检测的阈值的趋化因子的浓度是110 -8 M和细菌趋化检测变得饱和水平是110 -5 M。我们还表明,检测阈值和饱和度水平是趋化因子受体的数量无关,然而,为了使最大灵敏度,最强的启动子应该选择植物路由模块。此外,与苹果酸浓度等于3
16、mM的,阈值检测的浓度是在从根0.028米的距离,和饱和浓度达到0.012米(1.2厘米)远离根。从建模的细菌种群的趋化性,我们观察到根的趋化性是缓慢的,如果该细菌最初放置在两者之间0.012 m和0.028米的,同时,放置从根0.012米内细菌时,细菌很可能稳定和保持密切的根。稳定的细菌本地化,(1.2厘米)的距离是大于0.25厘米(营养物质可以有效地根的距离),因此,建议的细菌,我们的种皮的实施,应放置在或接近0.25厘米远离根。二:生长素(1) 概观生长素,或吲哚-3 -乙酸(IAA),是一种植物生长的激素,它是通过几个土壤细菌。我们已经采取的基因编码,从假单胞菌savastanoi I
17、AA生产的途径,并表示他们在大肠埃希氏菌。植物路由模块对根和吸收趋化之后,IAA表达,目的是提高土壤的稳定性,促进根系生长其也被称为是一个充分研究的负责响应于生物和非生物胁迫的用于植物生长的植物激素。通常,类似的-萘乙酸(NAA)和2,4 - 二氯苯氧乙酸(2,4-D)的合成生长素作为除草剂的使用。在过去的50年来,由于他们的高效率和廉价的成本,他们已经在作为除草剂的用途。虽然生长素是一种促生长的激素,它可以在高浓度下对植物的代谢负担,因此,毒性。合成生长素是非常稳定,在土壤中能坚持几个星期,这就是为什么他们是非常有效的除草剂。IAA,在另一方面,是化学不稳定的,并可以很容易地由植物代谢。因此
18、,如果我们在我们的底盘生产IAA,它应该促进而不是阻碍植物根系的生长。仍然是一种风险,即IAA可以仿照在硅片告知生长素随心模块的设计,其合成前在高浓度,因此,基因表达水平的植物是有毒的。我们的目标是产生IAA E. 大肠杆菌中以受控的方式,以便它永远不会到达的毒性阈值。在整个项目,该模块将负责影响根系生长,形成复杂的根网络,可以有效地保持土壤,防止其侵蚀的目的。图1。的化学结构,合成的和天然的生长素。(图片由先正达提供)。(2)产品规格1。一个简单的的IAA生产的途径,可以表现在我们的底盘。IAA是一种植物激素,促进植物生长的细菌快递(PGP) IAA的植物对营养物质的交换。有几种不同的途径可
19、以制作IAA(图1)。我们决定使用的IAM的途径,因为它已被证明在E.工作 大肠杆菌,并且由的只有两种酶。2。片段序列设计适合聚合酶延伸组件的方法,以最低的成本。我们决定用聚合酶延伸,而不是标准限制连接的组件的装配,因为它将使我们能够订购多个片段的序列。这将保持低于1000 bp的订单,也降低了生产时间。此外,像吉布森和CPEC的方法,使我们能够建立包含多个组件的结构,在一个反应,而不是不必结扎每个BioBrick顺序的。3。实现足够的IAA的表达水平在我们的底盘,在我们的工厂模式,以提高根系的生长。IAA在我们的底盘表达的目的是提高植物根系的生长,并最终提高土壤的稳定性。因此,我们需要的IA
20、A浓度的影响根系生长模拟和测试,以确定最佳的浓度不引起毒性。4。调整的IAA生产水平启动子不影响RBS强度的情况下切换。要促进未来调整的表达,我们在设计结构时,苏格兰皇家银行是不会受到影响的发起人。为了做到这一点,我们增加了15个基点绝缘体它们之间的序列。5。建立一个结构,密码子优化为E. 大肠杆菌和B。枯草芽孢杆菌。我们使用的是E. 大肠杆菌作为我们的机箱,因为人类实践问题,周围环境中的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的蔓延。此外,它已被证明,大肠杆菌 大肠杆菌是采取了积极的拟南芥 2 。然而,在未来,我们希望有可能建立相同的构造B. 枯草芽孢杆菌,一个突出的土壤中的孢子形
21、成的细菌。图1。有几种不同的IAA的生产途径。该IAM通路是一个两步骤的途径,从前驱体色氨酸生成吲哚-3 -乙酸(IAA)。IAA色氨酸单加氧酶(IAAM),催化氧化羧化的L-色氨酸为吲哚-3 -乙酰胺水解为吲哚-3 -乙酸和氨的吲哚乙酰胺水解酶(IAAH)1 。(3)设计他们心中的规格,我们通过文献搜索和咨询专家告知我们的IAA表达结构的设计。1。该IAM通路是一个简单的IAA的制造途径与只有一个中间。他们选择,使用IAM(吲哚乙酰胺)的途径,来源于假单胞菌savastanoi。此途径只涉及两种酶产生IAA(iaaM和战胜饥饿国际联盟),因此最大限度地减少碎片的数量,我们需要在我们的结构组装
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