大学课程植物组织培养12体细胞杂交组培课件.ppt
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1、体细胞杂交,体细胞杂交,引言,离体原生质体最重要特性:具有彼此融合的能力动物细胞融合只是个分析工具,而植物细胞融合为制造新杂种开辟了一条新途径。(为什么?)体细胞杂交:完全不经过有性过程,只通过体细胞融合制造杂种的方法称做体细胞杂交。针对:有性生殖能力很低或者不具备的植物(如,香蕉,马铃薯,甘薯,等)步骤:原生质体制备、原生质体融合、杂种细胞选择、杂种细胞培养、由杂种愈伤组织再生植株、杂种植株鉴定。,引言离体原生质体最重要特性:具有彼此融合的能力,细胞融合(cell fusion),又称体细胞杂交(somatic hybridiazation),是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜 融合形成单
2、个细胞的过程。,细胞融合(cell fusion),又称体细胞杂交(soma,Muller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。Lange于1875年第一个观察到脊椎动物(蛙类)的血液细胞发生融合的过程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。1958年日本学者冈田(Okada)发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。1974年华裔加拿大
3、学者高国楠创立了聚乙二醇(PEG)化学融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。20世纪80年代出现了电融合技术。,细胞融合研究进展,Muller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地,几种细胞融合成功的例子,生物种类细胞来源成功年代烟草两个种间叶叶1972几种细胞,动物细胞融合实验使用的小白鼠,动物细胞融合实验使用的小白鼠,动植物细胞的融合过程,植物细胞融合过程,人造小鼠培育过程示意图,动植物细胞的融合过程植物细胞融合过程人造小鼠培育过程示意图,细胞融合的意义,理论上说任何细胞,都有可能通过体细胞
4、杂交而成为新的生物资源。这 对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制,为远缘物种间 的遗传物质交换提供了有效途径。体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统,在杂种的分 裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组,从而产生新 的核外遗传系统。淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。,细胞融合的意义理论上说任何细胞,都有可能通过体细胞杂交而成为,细胞融合的基本原理,细胞融合的基本原理,显微镜下细胞融合过程,显微镜下细胞融合过程,融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解,融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的
5、变化过程图解,用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图,用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图,细胞融合的常用方法,细胞融合的常用方法,自发融合在酶解细胞壁过程中,有些相邻的原生质体能彼此融合形成同核体,每个同核体包含240个核,这种类型的原生质体融合叫自发融合。原理:由不同细胞间的胞间连丝的扩展和粘连造成用药物切断胞间连丝可减少自发融合的频率,自发融合,一、仙台病毒法,仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段:两种细胞在一起培养,加入病毒,在4条件下病毒附着在细胞 膜上。并使两细胞相互凝聚;在37中,病毒与细胞膜发生反应,细胞膜受到破环,此时需 要Ca2+和Mg2+,最适PH为8.0一8.2;细胞膜
6、连接部穿通,周边连接部修复,此时需Ca2+和ATP;融合成巨大细胞,仍需ATP 。,一、仙台病毒法仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段:,病毒促使细胞融合的主要步骤如下:,两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近;通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透,胞质互相渗透;两个原生质体的细胞核互相融合,两个细胞融为一体;进入正常的细胞分裂途径,分裂成含有两种染色体的杂种细胞。,病毒促使细胞融合的主要步骤如下:两个原生质体或细胞在病毒黏结,用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图,用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图,优点是易得,用法简单,融合效果稳定。聚乙二醇(PEG)结构为:HOH
7、2C(CH20CH2)nCH2OH,分子量大于 200小于6000者均可用作细胞融合剂。PEG浓度以W/W;如将10克PEG与10mlEagLe氏液混合(假定1ml 培养液为1g重),即成50PEG溶液。PEG经高压灭菌后,与温热的Engle氏液混合。通常用分子量低于1000的PEG作融合剂最好,50PEG溶液能产生 最多杂交细胞。PEG溶液在pH6.0时细胞融合率最高。,二、聚乙二醇(PEG)法,优点是易得,用法简单,融合效果稳定。二、聚乙二醇(PEG),聚乙二醇(PEG)处理是应用非常广泛的方法。高国楠(1974)用聚乙二醇(PEG)为融合剂诱发大豆与大麦、大豆与玉米、哈加野豌豆与豌豆的融
8、合。此法比病毒更易制备和控制,活性稳定,用PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合。在PEG诱导细胞融合的有效浓度范围内(50%55%)对细胞的毒性应进一步减小。异核体形成频率高,可重复性强,毒性低,特异性低。,聚乙二醇(PEG)处理是应用非常广泛的方法。,聚乙二醇(PEG)法细胞融合过程,聚乙二醇(PEG)法细胞融合过程,PEG诱导融合的特点:其优点是融合成本低,勿需特殊设备;融合子产生的异核率较高;融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐,PEG可能对细胞有毒害。,PEG诱导融合的特点:其优点是融合成本低,勿需特殊设备;融合,PEG诱导融合的真正机制不完全明了。可能的作用机制:由于PEG分子具
9、有轻微的负极性,故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成化学键,从而在在质膜之间形成分子桥在相邻原生质体间起分子桥的作用,促进粘连。进而促使质膜的融合使膜紧密接触区电荷重新分配,导致带不同电荷的基团连接,最终引起融合。PEG使膜内蛋白或糖蛋白颗粒凝聚,使脂膜中出现不含蛋白质的双层脂类分子区,膜融合的部位就在这些区域。另外,PEG能增加类脂膜的流动性,也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。,PEG诱导融合的真正机制不完全明了。,聚乙二醇(PEG)法细胞融合步骤(1)将两种不同亲本细胞各5l06混匀;(2)离心沉淀,吸去上清液;(3)加1ml 50PEG溶液,用吸管吹打,使之与细胞接触
10、1分钟;(4)加9ml 培养液,离心沉淀,吸去上清液;(5)加5ml 培养液,分别接种5个直径60mm平皿,每个平皿加培养 液至 5ml,37的CO2培养箱中培养。(6)624小时后,换成选择培养液筛选杂交细胞。,聚乙二醇(PEG)法细胞融合步骤,影响PEG诱导原生质体融合的因素:除了课本所列的11条,原生质体的来源(即其来自什么物种)也可影响诱导的效果。,影响PEG诱导原生质体融合的因素:,三、电融合法,电融合法是80年代出现的细胞融合技术,在直流电脉冲的诱导下,细胞膜表面的氧化还原电位发生改变,使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂,进而质膜开始连接,直到闭和成完整的膜,形成融合体。电融合法的优
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