基因工程32大肠杆菌克隆载体课件.ppt
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1、大肠杆菌的克隆载体,Cloning Vectors for E. coli,基因工程32大肠杆菌克隆载体,1,大肠杆菌的克隆载体Cloning Vectors for基,所有克隆质粒中,最多的一类是以大肠杆菌为宿主的。因为: 过去50年内,这种细菌在基础研究中一直扮演着中心角色; 已积累大量有关大肠杆菌的微生物学、生物化学和遗传学知识; 事实上所有关于基因结构和功能的基础研究都是以大肠杆菌为材料而开展的。,基因工程32大肠杆菌克隆载体,2,所有克隆质粒中,最多的一类是以大肠杆菌为宿主的。基因工程32,3.1 基于大肠杆菌质粒的克隆载体,基因克隆领域最得到广泛应用的也是最简单的,是那些以大肠杆菌
2、质粒为基础而构建的克隆载体。可用于大肠杆菌的有很多不同的质粒载体,其中有很大一部分是由商业公司提供的。他们开发的载体既易于纯化,又结合一些想要的特性,如高的转化效率、方便的转化和重组的筛选标志以及克隆相当大的DNA片段(高达8kb)的能力。如:pBR322。pBR322是最早被构建的质粒,至今仍被广泛使用。,基因工程32大肠杆菌克隆载体,3,3.1 基于大肠杆菌质粒的克隆载体基因克隆领域最得到广泛应用,3.1.1 质粒克隆载体的命名法,“pBR322”这个名字符合载体命名法的标准规则: “p”说明它是一个质粒; “BR表示最初构建它的实验室(BR代表了两个构建人的名字:Bolivar和Rodr
3、iguez)。 “322把该质粒和该实验室构建的其他质粒区分开来(另外还有pBR325,pBR327,pBR328,基因工程32大肠杆菌克隆载体,4,3.1.1 质粒克隆载体的命名法“pBR322”这个名字符,3.1.2 pBR322的一些有用特性,从pBR322的遗传图谱和物理图谱(图6-1)可以看出为什么它能是一个如此受欢迎的克隆载体?第一个优点在于它的大小 第2章里提到,作为一个克隆载体它的大小应该小于10kb,否则在提纯它的时候很容易导致DNA断裂。 pBR322只有4 363bp,意味着可以很容易纯化质粒本身及其所携带的重组DNA分子。即使添加上6kb的DNA链,重组的pBR322的
4、大小仍在可操作的范围内。,基因工程32大肠杆菌克隆载体,5,3.1.2 pBR322的一些有用特性从pBR322的遗传,基因工程32大肠杆菌克隆载体,6,基因工程32大肠杆菌克隆载体6,第二个优点是拥有两套抗生素耐药性基因两个耐药性基因(氨苄青霉素耐药性和四环素耐药性基因)都可作为含有该质粒的筛选标志,而且每个抗性基因内都拥有一个限制性单酶切位点,这在克隆实验中非常有用。用PstI,PuvI或ScaI酶切后插入DNA会导致氨苄青霉素抗性基因失活;用BamHI及Hind等8个限制性内切核酸酶酶切后插入DNA会导致四环素抗性基因失活。这意味着pBR322支持很多种不同黏性末端的DNA片段的导入。,
5、基因工程32大肠杆菌克隆载体,7,第二个优点是拥有两套抗生素耐药性基因基因工程32大肠杆菌克隆,第三个优点在于pBR322有相当高的拷贝数 通常在被转化过的大肠杆菌中有大约15个pBR322质粒分子; 在蛋白质合成抑制剂(如氯霉素)的存在下,通过质粒扩增,拷贝数可以增加到1 000-3 000。 这样,通过培养大肠杆菌就可以获得大量重组过的pBR322质粒分子。,基因工程32大肠杆菌克隆载体,8,第三个优点在于pBR322有相当高的拷贝数基因工程32大肠杆,3.1.3 pBR322的家谱,BR322作为一个克隆载体的方便性决非偶然,它在被设计时就定好了要拥有这些特点。构建pBR322的步骤简述
6、如图。它的构建是一件曲折而艰巨的操作,用到了全部巧妙的基因操作技术。pBR322实际上由3个在自然界存在的天然质粒拼接而成。,基因工程32大肠杆菌克隆载体,9,3.1.3 pBR322的家谱pBR322作为一个克隆载体,基因工程32大肠杆菌克隆载体,10,基因工程32大肠杆菌克隆载体10,3.1.4 其他大肠杆菌质粒克隆载体,BR322质粒是在20世纪70年代后期被构建出来的,第一份描述它的用途的论文在1977发表。从那以后,人们构建了大量其他的质粒克隆载体,它们大多数只是对pBR322作了少量修改。,基因工程32大肠杆菌克隆载体,11,3.1.4 其他大肠杆菌质粒克隆载体pBR322质粒是在
7、2,BR327一个高拷贝数质粒,BR327通过从pBR322中移除一个长1 089bp的片段而构建。片段的删除并没有损伤ampR和terR这两个抗性基因,但改变了质粒的复制能力和接合能力。pBR327与pBR322有两点重要的不同 (1)pBR327的拷贝数比pBR322更高。每个大肠杆菌中可以存在30-45个质粒分子。当实验的目标是研究被克隆的基因功能的时候,有更高拷贝数的pBR327就更适合于用作载体。拷贝数越高,被克隆的基因在细胞中所产生的效果就越容易被发现。,基因工程32大肠杆菌克隆载体,12,BR327一个高拷贝数质粒pBR327通过从pBR322,(2)1 089bp片段的删除,破
8、坏了pBR322的接合能力,使pBR327不能把自己转移到另外一个大肠杆菌细胞中去。这一点对生物防范很重要,避免了粗心的生物学家使重组后的质粒从试管和细菌植株中逸出。相反,pBR322在理论上可以通过结合而进入天然的大肠杆菌细胞中去,虽然事实上pBR322也有一定的安全措施减少这种情况的发生。当被克隆的基因有潜在的危害性时,应优先选择pBR327。,基因工程32大肠杆菌克隆载体,13,(2)1 089bp片段的删除,破坏了pBR322的接合能力,基因工程32大肠杆菌克隆载体,14,基因工程32大肠杆菌克隆载体14,UC8乳糖选择质粒,UC8也是一个源自于pBR322的质粒,只保留了pBR322
9、的复制起点和ampR基因。ampR基因的核酸序列也被改变了,不再包含唯一的限制性酶切位点。所有这些位点被集中到pUC8所携带的lacZ基因中的一小段序列上。 pUC8所拥有的3个优点使它成为最受欢迎的大肠杆菌克隆载体之一。,基因工程32大肠杆菌克隆载体,15,UC8乳糖选择质粒pUC8也是一个源自于pBR322的质,基因工程32大肠杆菌克隆载体,16,基因工程32大肠杆菌克隆载体16,第一个优点人们在构建这个质粒时,在它的复制起点上产生了一个偶然的突变,使得它在大肠杆菌内的拷贝数达到了500-700(扩增以前的数目)。这样可以在转化后的大肠杆菌细胞中获得大量的目的DNA。第二个优点在于重组体的
10、识别只需一步,仅仅只要把待筛选的大肠杆菌铺板到含有氨苄青霉素和X-gal的琼脂培养基上。而pBR322和pBR327,重组体的筛选都需要把菌落从一种抗生素培养基原样转移到另一种抗生素培养基平板。一个用pUC8做载体的克隆实验比选择pBR322和pBR327要节约一半的时间。,基因工程32大肠杆菌克隆载体,17,第一个优点基因工程32大肠杆菌克隆载体17,第三个优点是pUC8拥有多克隆单酶切位点,这使有两个不同黏性末端的DNA片段(比如一端是被EcoRI酶切过的,另一端是被BamHI酶切过的)可以直接被克隆,而不需求助于加入连接片段的操作。其他的pUC载体,拥有不同的限制性酶切位点,具有更大的灵
11、活性,允许更多种不同的DNA片段被克隆。此外,这些载体中的限制性酶切位点与存在于M13mp 系列载体中的限制性酶切位点一样,可以很方便的进行DNA测序或体外诱变。,基因工程32大肠杆菌克隆载体,18,第三个优点是pUC8拥有多克隆单酶切位点,基因工程32大肠杆,基因工程32大肠杆菌克隆载体,19,基因工程32大肠杆菌克隆载体19,GEM3Z克隆DNA的体外转录,GEM3Z与pUC载体很相似:都含有ampR和lacZ基因,在后者上有一个限制性酶切位点,而且两个质粒有着差不多完全相同的大小。区别:pGEM3Z多两个短片段,每一个片段都可以充当启动子,黏附RNA聚合酶。外源DNA在限制性酶切位点被导
12、入pGEM3Z载体,在限制性酶切位点的两边分别存在着这两个启动子序列。这就意味着,在试管里同时放入重组后的pGEM3Z质粒和提纯的RNA聚合酶,被克隆的DNA分子会指导合成相应的RNA,发生转录。产生的RNA可用作杂交探针,也可用于研究RNA加工 (如内含子如何切除),或是用于合成蛋白质。,基因工程32大肠杆菌克隆载体,20,GEM3Z克隆DNA的体外转录pGEM3Z与pUC载体很,基因工程32大肠杆菌克隆载体,21,基因工程32大肠杆菌克隆载体21,被pGEM3Z和其他同类载体所携带的启动子并不是被大肠杆菌RNA聚合酶识别的标准启动子。实际上这些启动子有的被T7噬菌体编码的RNA聚合酶专一性
13、识别,有的被SP6噬菌体编码的RNA聚合酶专一性识别。当大肠杆菌被其中某种噬菌体侵染时就合成这些RNA聚合酶,用以转录噬菌体基因。之所以在体外转录系统中选择病毒RNA聚合酶,是因为它们有着相当高的酶活,因此噬菌体基因一定能够很快被转录出来,能够在每分钟合成1-2gRNA,比标准的大肠杆菌RNA聚合酶高效得多。,基因工程32大肠杆菌克隆载体,22,被pGEM3Z和其他同类载体所携带的启动子并不是被大肠杆菌R,3.2 基于M3噬菌体的克隆载体,对任何克隆载体而言,最基本的要求是能够在宿主细胞内自我复制。质粒载体很容易满足这个要求首先它有一个短的DNA序列能够充当复制起点,并且它复制所需要的酶也可以
14、全部或大部分从宿主细胞获得。精密的构建操作,使最终形成的质粒载体如pBR322成为一个完整而具备功能的复制子。,基因工程32大肠杆菌克隆载体,23,3.2 基于M3噬菌体的克隆载体对任何克隆载体而言,最基本,噬菌体,如M13的复制情况就较为复杂。噬菌体的DNA分子通常带有几个为复制所必需的基因,包括编码噬菌体蛋白外壳的组分的基因和编码噬菌体特有的复制酶的基因。改变或是删除这些必需基因中的任一个,都会损伤或是毁坏噬菌体的复制能力。因此可供改变噬菌体DNA分子的自由度很小,而通常的噬菌体载体与原始分子的差别很小。,基因工程32大肠杆菌克隆载体,24,噬菌体,如M13的复制情况就较为复杂。基因工程3
15、2大肠杆菌克,以M13噬菌体为例,可以看出构建噬菌体克隆载体的难度。一个正常的M13噬菌体的基因组是6.4kb,为紧紧挤在一起的10个基因所占据,每一个基因对噬菌体的复制都是必需的。在基因间只有一个仅长507bp的短序列,新的DNA必须从这里插入才不会损伤其他基因,还必须保证同样处在这个短序列中的复制起点不被破坏。所以,只有一个很小的空间用于改造M13噬菌体。然而,M13有一个很吸引人的优点:它使人们可以获得单链的被克隆DNA。,基因工程32大肠杆菌克隆载体,25,以M13噬菌体为例,可以看出构建噬菌体克隆载体的难度。基因工,基因工程32大肠杆菌克隆载体,26,基因工程32大肠杆菌克隆载体26
16、,基因工程32大肠杆菌克隆载体,27,基因工程32大肠杆菌克隆载体27,3.2.1 M13mp2克隆载体的开发,构建M13克隆载体第一步,是把lacZ基因导入到噬菌体M13的短序列中。产生了M13mpl,它在含有X-gal的琼脂板上形成蓝色的噬菌斑。M13mpl的lacZ基因上不含有任何的限制性酶切位点,但在靠近基因起始位置的地方有一个GGATTC的序列。改变一个核苷酸就变成GAATTC,这是EcoRI的识别位点。这个改变是用体外诱变完成的,产生了M13mp2克隆载体。,基因工程32大肠杆菌克隆载体,28,3.2.1 M13mp2克隆载体的开发构建M13克隆载体第,M13mp2有一个稍稍改变的
17、lacZ基因(第六个密码子编码天冬氨酰而不是天冬氨酸),但转染了M13mp2的细胞产生的-半乳糖苷酶仍然有着正常的功能。 M13mp2是最简单的M13克隆载体。有EcoRI黏性末端的DNA片段可以插入进克隆位点,重组体可以通过在X-gal培养基上的噬菌斑得到识别。,基因工程32大肠杆菌克隆载体,29,M13mp2有一个稍稍改变的lacZ基因(第六个密码子编码,基因工程32大肠杆菌克隆载体,30,基因工程32大肠杆菌克隆载体30,3.2.2 M13mp7对称的克隆位点,开发M13克隆载体的下一步是在lacZ基因上添加额外的酶切位点。通过在试管中合成一个叫做多接头(polylinker)的寡核苷酸
18、而实现。多接头包含一系列的限制性酶切位点,有一个EcoRI的黏性末端。多接头被插入到M13mp2克隆载体的EcoRI位点上,形成了一个更加复杂的载体,即M13mp7。,基因工程32大肠杆菌克隆载体,31,3.2.2 M13mp7对称的克隆位点开发M13克隆载体,M13mp7有4个可能的克隆位点: EcoRI,BamHI,SalI和PstI。为了不完全破坏掉lacZ基因,在设计这个多接头时,人们使得读码框在通过多接头后没发生改变。这样,产生的-半乳糖苷酶虽然被改变了序列,但仍然有着正常的功能。,基因工程32大肠杆菌克隆载体,32,M13mp7有4个可能的克隆位点:基因工程32大肠杆菌克隆载,基因
19、工程32大肠杆菌克隆载体,33,基因工程32大肠杆菌克隆载体33,用EcoRI,BamHI,SalI中的任意一种去酶解M13mp7,整个多接头或其一部分会被切掉。在其他DNA存在下,有3种连接可能发生: (1)插入的新DNA, (2)插入的多接头。 (3)载体自连。,基因工程32大肠杆菌克隆载体,34,用EcoRI,BamHI,SalI中的任意一种去酶解M13m,新DNA的插入会阻碍-半乳糖苷酶的产生,因此重组体在含X-gal的琼脂培养基上产生无色透明的噬菌斑。当插入的片段是多接头时,原来的M13mp7载体又再次形成了,噬茵斑是蓝色的。如果是载体自连,噬菌斑应该是什么颜色? 多接头又一次显示其
20、巧妙设计:不管用哪一个内切酶酶解,自连的载体都会连成有功能的lacZ基因,最终形成蓝色的噬菌斑。因此,只有重组体产生无色透明的噬茵斑。,基因工程32大肠杆菌克隆载体,35,新DNA的插入会阻碍-半乳糖苷酶的产生,因此重组体在含X-,基因工程32大肠杆菌克隆载体,36,基因工程32大肠杆菌克隆载体36,由于携带对称的克隆位点,无论新的DNA是通过BamHI,SalI或PstI中的哪一个酶切位点插入载体,都可以用EcoRI从重组后的分子中切除。,基因工程32大肠杆菌克隆载体,37,由于携带对称的克隆位点,无论新的DNA是通过BamHI,Sa,基因工程32大肠杆菌克隆载体,38,基因工程32大肠杆菌
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