第二章 核酸化学解析课件.ppt
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1、第二章 核酸化学,周毅峰2015年秋,核酸作为遗传物质的证实与核酸的分类,核苷酸结构与功能,核酸结构,核酸性质及研究方法,第一节核酸作为遗传物质的证实与核酸的分类,核酸是一类重要的生物大分子,担负着生命信息的储存与传递。,核酸是现代生物化学、分子生物学的重要研究领域,是基因工程操作的核心分子。,1核酸作为遗传物质的证实,核酸的研究发现史,1868年,F. Miescher(瑞士)首次在绷带上的脓细胞核中发现一种富含磷酸呈酸性又不溶于酸溶液的分子,命名为核素(nuclein ),其实是核蛋白。,Johann Friedrich MiescherSwiss biochemist (18441895
2、),Physiological Laboratory of the University of Basel,1889年,R.Altman从酵母和小牛的胸腺中提取了一种溶于碱性溶液中的纯净物,这才是真正的核酸。从此,对核酸的研究全面展开,揭开了生物化学领域惊天动地的一页。,1928年,Griffith F.首次发现肺炎双球菌(Streptococcus pneumoniae)的转化现象。,Frederick Griffith (1879 - 1941),Griffiths experiments (1928) first demonstrated that genetic information
3、 could be transferred. Without knowing what this information was, he called it the Transforming Principle.,1944年, Oswald Theodore Avery等在离体条件下重复这一实验,并对转化本质进行了研究。,DNA的纯度越高,转化就越有效。,用DNA酶处理DNA,S型死细菌就不能使R型细菌发生转化。,discovering,1952年,Hershey & Chase 用E. coli, phage T2做材料,利用同位素示踪法进行实验。,Alfred D. Hershey(190
4、81997),Alfred Hershey and Martha Chase did the Hershey-Chase blender experiment that proved phage DNA, and not protein, was the genetic material.,Alfred Hershey and Martha Chase (1928-2003) 1953,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969,Hershey-Chase blender experiment,DNA是遗传物质!,conclusion,2核酸的
5、种类和分布,脱氧核糖核酸 Deoxyribonucleic Acid (DNA),核酸分为两大类:,核糖核酸 Ribonucleic Acid(RNA),DNA,真核,原核,98核中(染色体中),线粒体(mDNA),叶绿体(ctDNA),拟核,核外:质粒(plasmid),病毒:DNA病毒,核外,主要的RNA种类,第二节核苷酸结构与功能,1核苷酸的组成,1.1戊糖,在溶液中-D-核糖和-D-2-脱氧核糖都可发生环状和直链分子的互换。但在RNA和DNA中只存在环状分子。,戊糖的构象,在核苷酸中核糖呋喃环存在4种折叠结构。,-D-2-脱氧核糖,-D-核糖,1.2核酸分子中常见碱基,嘧啶,嘌呤,1.
6、3核酸分子中稀有碱基,二氢尿嘧啶dihydrouracil,7-甲基鸟嘌呤,1.4碱基的性质,碱基几乎不溶水,碱基的互变异构,酸碱解离,强烈的紫外吸收,1.5核苷,碱基与戊糖形成糖苷键,核苷具有高度亲水性和碱性条件下的稳定性。,嘧啶核苷可抗酸水解,而嘌呤核苷易发生酸水解。,核苷的构象,呋喃环平面与碱基平面近似垂直,自由嘌呤核苷常成顺式构象,DNA和RNA中嘌呤核苷主要是反式构象,syn-,anti-,嘧啶环O-2和戊糖C-5之间空间位阻,使得嘧啶核苷常为反式构象,1.6核苷酸,常见核苷酸,常见脱氧核苷酸,核苷酸的存在形式,核苷酸的构象,核苷酸上的COP之间的键可以旋转,核苷酸上有7个扭角:、,
7、戊糖环的四种构象使得核苷酸也有四种构象,戊糖环与碱基之间的糖苷键使得核苷酸存在顺反异构,2核苷酸的功能,能量货币,遗传物质合成的前体,信息转导中的信号分子,作为其它物质的前体或辅酶/辅基的成分,代谢活化的中间物,作为酶的别构效应物参与代谢调节,调节基因表达,第三节核酸结构,1核酸的一级结构,5未端,3未端,核酸一级结构特征,核酸具有方向或极性,核酸在生理pH下带电荷,核酸碱基的有序性,pA-C-G-T-AOH、pApCpGpTpA、pACGTA,核酸的一级结构是指构成核酸链上的所有核苷酸残基或碱基的排列顺序,核酸的一级结构书写方式有,2DNA的二级结构,1950年,Chargaff应用紫外分光
8、光度法结合纸层析等简单技术,对多种生物DNA作碱基定量分析,总结了DNA碱基组成 “Chargaff规则”,Erwin Chargaff1905-2002,2.1 Chargaff规则,不同生物来源的DNA四种碱基比例关系,不同生物来源的DNA碱基组成不同,同一生物的不同组织的DNA碱基组成相同,同一种生物DNA碱基组成不随生物体的年龄、营养状态或者环境变化而改变,在所有生物的DNA,无论种属来源如何,其腺嘌呤摩尔含量与胸腺嘧啶摩尔含量相同A=T,鸟嘌呤摩尔含量与胞嘧啶摩尔含量相同G=C。总的嘌呤摩尔含量与总的嘧啶摩尔含量相同,即AG=CT。,Chargaff Rules,2.2 DNA双螺旋
9、结构的揭示,Francis Crick (35y),1951,James Watson (23y),丹麦 哥本哈根,剑桥大学 Cavendish Lab.,生命科学的重要里程碑,Rosalind Elsie Franklin (1920-1958),Maurice Hugh Frederick Wilkins,Francis Harry Compton Crick (1916-2004),James Dewey Watson(1928),2006年10月18日,James Watson (34y)Francis Crick (46y)Maurice Wilkins (46y),DNA Doub
10、le Helix model 1953,1962,2.3DNA的B-型双螺旋结构,DNA是由两条呈反向平行的多聚核苷酸链组成,一股链是53走向,另一股链是35走向。,链的骨架(backbone)由交替出现的亲水的脱氧核糖基和磷酸基构成,位于双螺旋的外侧。,碱基位于双螺旋的内侧,两股链中的嘌呤和嘧啶碱基以其疏水的、近于平面的环形结构彼此密切相近,平面与双螺旋的长轴相垂直。,一股链的嘌呤碱基与另一股链中位于同一平面的嘧啶碱基之间以氢链相连,称为碱基互补配对或碱基配对(base pairing) 。碱基互补配对总是出现于A与T之间(A=T),形成两个氢键;或者出现于G与C之间(G=C),形成三个氢键
11、。,两股DNA链围绕一假想的共同轴心形成一右手螺旋结构,双螺旋的螺距为3.4nm,双螺旋每转一周为10碱基对(bp),碱基对层间的距离为0.34nm。双螺旋直径为2.0nm。,表面形成一条大沟,一条小沟。大沟与小沟是蛋白质识别DNA的碱基序列,与其发生作用的基础。,The homeodomain of the Engrailed protein binds to a particular site in the DNA. Helix 3 contacts the base pairs in the major groove, while the amino-terminal portion o
12、f the homeodomain enters the minor groove.,The HMG-I(Y) DNA-bending protein wraps a 60-base-pair coil of DNA around the transcriptional activators NF-kB (the p50/p65 complex), IRF1, and ATF2/c-Jun. The HMG-I(Y) is in the minor groove, while the other transcription factors operate in the major groove
13、 of the double helix. Once the enhanceosome is assembled, it contacts the basal transcription apparatus at several sites.,结构回顾,2.4A型双螺旋,DNA在75%相对湿度的钠盐中形成A-DNA螺旋的构型。,A-DNA螺旋是右手螺旋,螺旋一周11bp,螺距2.46nm,螺旋直径2.6nm碱基平面与螺旋轴成19夹角,大沟窄而深,小沟宽而浅。,DNA与RNA的杂分子和RNA双链为A型双螺旋,2.5Z-型双螺旋DNA,Z-DNA螺旋是左手螺旋,1979. Alecxander R
14、ich,美国麻省理工学院教授,GCGCGC在高盐条件下形成, 戊糖磷酸骨架呈“Z”字形走向,Z型双螺旋的结构特征,鸟嘌呤核苷(G)的糖苷键呈顺式,胞嘧啶核苷(C)的糖苷键呈反式,G与C交替排列, 左手双螺旋,鸟嘌呤核苷(G)的糖苷键呈顺式,不仅使螺旋方向发生改变,而且使G残基位于分子表面, 分子外形呈波形,鸟嘌呤核苷(G)的糖苷键呈顺式,不仅使螺旋方向发生改变,而且使G残基位于分子表面, C和G 的构象促使了Z型双螺旋的形成,胞嘧啶核苷(C)戊糖C2为内式构象,碱基为反式构象(anti-)使糖环转离小沟,而鸟嘌呤核苷( G )戊糖C3为内式构象,碱基为顺式构象(syn-)使糖环弯向小沟。,胞嘧
15、啶C5和鸟嘌呤N7、C8填满了大沟并指向表面,使大沟变得不明显,而小沟窄且深。,影响Z-DNA稳定的因素(in vivo),1 m5C,(G-C)n 排列不是Z-DNA形成的必要条件,2 Z-DNA 中G的C2-NH2在大沟内与H2O-H2O形成氢键连接,3 Z-DNA中G的N7, C8外露, 易与特异蛋白(或Br)结合,Histon H1,稳定B-DNA,H2A, H2B, H3, H4,稳定Z-DNA,4 B-DNA,负向超螺旋,应力,Z-DNA,m5C- GATm5C-G Gm5CTA-Gm5C,可能的功能,基因表达调控,基因关闭,基因表达,2.6双螺旋稳定的力(Forces that
16、help to form the DNA double helix ),氢键(Hydrogen bonding is not the most energtically signicant component note: maintenance of distance from the two phosphate backbone requires Pur-Pyr),碱基堆积力(Stacking interactions - electronic interactions between planar bases),磷酸骨架的刚性(Rigid phosphate backbone),离子键(I
17、onic interactions - salt stabilizes the duplex form of DNA shielding of phosphate backbone),疏水作用(Hydrophobic interactions - highly negative phosphate backbone vs. nonpolar bases),2.7与DNA碱基顺序相关的特殊二级结构,回文序列指含有反向重复( inverted repeat )碱基序列的一个DNA区域,DNA双链呈二重对称。,回文序列 (palindrome),DNA片段旋转180后,顺序不变,回文序列中的单链可形
18、成发夹结构,双链可形成十字架结构,这种发夹结构或十字架结构在大肠杆菌细胞DNA中已有发现,镜象重复(mirror repeat)结构,镜象重复指每条DNA链内存在的反向重复序列,三股螺旋(triplex DNA, H-DNA),多嘌呤-多嘧啶的镜象序列可形成三螺旋结构(H-螺旋或Hoogsteen螺旋),参与三股螺旋DNA氢键的原子称为Hoogsteen位点,为有嘌呤的N-7、为O6和N6,这种非Watson-Crick配对称为Hoogsteen配对,三股螺旋( tripleDNA )可分为分子内的三股螺旋、分子间的三股螺旋和平行三股螺旋,1987 年 Mirkin . S . M Natur
19、e 330 (495) 证明plasmid DNA 在 pH= 4.3的溶液中, 有T.S DNA的存在,分子内的三股螺旋,由于分子内的三股螺旋结构类似于“铰链”,因此,也称为Hinge DNA,H-DNA。,1957年Davis , Felsenfeld , Rich 发现,poly(U) + poly(U) + poly(A) T.S RNA,T.S DNA的概念,1966年Miller & Sobell,实现 RNA + D.S DNA,Triple polyNt,但由于D.S DNA的提出而被忽视,但因证明 LacI 产物为 Repressor 而被忽视,as Repressor 关闭
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