免疫组化5-结果的分析和判断.ppt

免疫组化结果的分析和判断,一、免疫组化结果的判断原则,必须同时设对照染色。没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上；CK应定位在细胞浆内；PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内；EMA应定位在细胞膜上，等等。不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。,阴性结果不能视为抗原不表达。由于检测方法灵敏度有高低之分，有时可因染色方法灵敏度不够，而导致阴性反应，判断时应注意。,尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达，特别是酶免疫标记。因为这类阳性着色多系内源干扰，或系人为因素所致。,对免疫组化标记结果的意义不能绝对化，应结合临床资料、X线等影像学及实验结果综合分析。,二、对照染色设计,(一）对照染色的目的-排除假阴性和假阳性。假阴性的原因主要有三：组织处理不当，抗原丢失过多或被遮蔽抗体失活、效价过低或稀释度不合适（主要指一抗，即特异性抗体）染色步骤遗漏及差错，或显色剂的选择、缓冲液的pH和离子强度不当等。,假阳性系由多种因素造成的非特异着色所致，原因主要有：自发荧光或内源酶等干扰抗体试剂不纯(特别是一抗）操作失误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等Fc受体的干扰，等等,（二）对照的种类及其选用目的 对照染色大致可分为：阳性组织对照、阴性组织对照及阴性试剂对照和自身对照四大类：,阳性组织对照 用已证实含有靶抗原的同源及不同源组织切片或细胞涂片与待检实验切片同时作同样处理和免疫染色的组织对照。正确的结果应呈现阳性目的：证实所用免疫组化染色流程的有效性，排除假阴性的可能。,阴性组织对照 用已证实不含靶抗原的同步处理和免疫标记染色的组织对照。正确的结果应为阴性目的：排除假阳性的可能。,3、阴性试剂对照 用于证实在免疫组化染色中所用试剂，尤其是特异性抗体试剂的有效性和可靠性而所设立的同步免疫染色对照，包括有：空白对照；替代对照；吸收试验和抑制试验等。目的：排除假阳性和证实所用免疫组化试剂及其技术方法的有效性和待检实验切片免疫标记阳性结果的可靠性。,空白对照 以缓冲液（PBS、TBS等）取代第一抗体（主要的，必要时还可做第二抗体及桥联抗体的空白取代），其他各步不变的试剂对照染色，结果应为阴性。,取代对照 指以所用方法第一抗体同源动物的正常血清，或与本实验无关的抗体(靶生物缺如的)取代第一抗体，其他步骤不变的试剂对照染色，结果应为阴性。吸收试验 是指用事先经过量抗原吸收的第一抗体上清液取代第一抗体，其他步骤不变的免疫染色试剂对照。结果应是阴性或阳性着色明显减弱（吸收不全时）。,抑制试验 是指用标记抗体和未标记抗体（可以是一抗，也可以是二抗或桥抗体）两者的混合物作试剂，其他步骤不变的免疫组化染色试剂对照，结果其阳性着色应成比例的减弱（等量或1：9）。此试剂对照多用于直接法。,这类阴性试剂对照的选用原则是：空白对照不能省，其他对照在预实验中应尽量多做，尤其是应用新抗体试剂对照必需与实验片同步进行染色对照的结果应附合要求。,自身对照 是指在同一标记切片上的自身组织成分的阴性背景对照。即与靶抗原阳性反应细胞或成分相邻的阴性背景结构的显色，结果应为阴性或着色较浅，需与阳性着色成分呈鲜明对比目的：排除内源性干扰产生的假阳性和因抗原弥散移位造成的错误结果。,三、非特异染色,非特异染色是指免疫组化染色过程中产生的非靶抗原的呈色结果，属假阳性，又称背景着色，能严重干扰免疫组化染色结果的正确判断，应竭力避免或减轻。,内源性干扰(自发荧光、内源酶、内源性生物素等)；试剂污染(质量差，交叉反应，Fc受体干扰等)；组织处理不当(组织固定不及时或固定不良所导致的抗原弥散移位、洗涤不充分所导致的游离试剂残留等)。,原因：涉及免疫组化染色流程的各个环节：,纠正的方法视原因而异，可在预实验基础上，采用有针对性的纠正对策，对症下药。,四、阳性标记的形态特征和判断,免疫组化标记具有一定形态特点，若能熟练掌握则有助于对免疫组化标记结果的正确判断。内容包括定性、定位和定量三方面。,定性定量指标-免疫显色强度和阳性细胞密度（抗原含量）,定位指标-阳性细胞的着色形态及组织分布特点（功能）,（一）阳性标记免疫特征：分弱(+)、中(+)、强(+)三级。免疫荧光法（FITC为例）则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光；,免疫酶标记（HRP-DAB/H2O2）则表现为淡黄色细颗粒、棕黄色颗粒和褐黄色粗颗粒，后者耀眼易见。图像摄影，原则上多取强阳性区域。,（二）阳性标记细胞学特征（以HRP-DAB/H2O2为例）可分为胞膜型；胞核型；胞质(浆)型；微绒毛型和复合型（胞膜-胞质兼有，胞核-胞质兼有，或微绒毛-胞质兼有）等五种阳性细胞类型。这与抗原所在部位相关联，但应注意排除因组织固定不好引起的抗原弥散假象，尤其是复合型图像。,（三）阳性标记组织学特征（以HRP-DAB/H2O2为例）免疫组化染色阳性细胞在组织中的分布排列形式可以有如下7种：局灶型；弥漫型；片块型；网状型；腺管型；腔缘型和菊团型，等。这主要取决于抗原抗体复合物在细胞内的分布和阳性细胞在组织内的群体分布特点。,（四）阳性标记强度特征 依照细胞阳性着色程度（抗原含量），可分为弱阳性（+）1分；中等阳性（+）2分；强阳性（+）3分。依照阳性细胞数量，可分为：弱阳性（+，指阳性细胞数在25%以下）1分；,中等阳性（+,指阳性细胞数在25%49%)2分；强阳性（+，指阳性细胞数在50%以上)3分。目前多采用积分综合计量。计算公式：两者相乘（或相加）。大多主张4者为阳性，6者为强阳性，至少随机观察5-10个HPF,取其均值。,五、染色失败的可能原因,免疫组化染色的基本要求：实验切片的阳性抗原定位准确，呈色鲜明，背景着色浅或无对照染色的结果应附合要求。否则，所得实验结果都是错误的，或为假阳性或为假阴性。,实验切片呈阳性，阴性组织对照或阴性试剂对照也呈阳性原因：内源性干扰，试剂不纯，交叉反应等,假阳性,实验切片呈阴性，阳性组织对照及阴性试剂对照也均呈阴性的结果原因：组织处理不当，组织细胞抗原丢失或试剂错误(如漏加、错加、失效、变质等),操作失误等,假阴性,对照结果判断：,假阴性常见原因：抗原丢失或减弱 抗体失效或稀释度不当 操作失误假阳性常见原因：抗原弥散 抗原异位表达 病变中正常组织残留 抗体交叉反应 内源性物质着色,