酿造微生物学中的常用培养技术.ppt

第三章 酿造微生物学中的常用培养技术,酿造学,一、微生物分离培养技术画线接种法,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,步骤一,火焰灭菌接种针,酿造学,微生物分离方法,常用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,步骤一,轻触营养平板上无菌的琼脂,冷却接种针,步骤二,酿造学,微生物分离方法,常用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,步骤一,步骤二,以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌,步骤三,酿造学,微生物分离方法,常用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,步骤一,步骤二,步骤三,更换一个新的无菌营养平板,步骤四,酿造学,微生物分离方法,常用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,步骤一,步骤二,步骤三,步骤四,将接种针上的细菌划于一个新的营养平板上。此为第一菌区。,步骤五,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。,步骤六,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,由第五步骤的第一区中划出第二区,步骤七,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,重复第六以及第七步骤，由第七步骤的第二区中划出第三区。,步骤八,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三区中划出第四区，划满剩下的空间。,步骤九,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,在营养平板上贴好标签，标示好接种日期、操作者姓名、菌种学名以及培养基名称。,步骤十,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,二、食品酿造常用微生物,1、细菌及其应用2、酵母菌及其应用3、霉菌及其应用,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,1、细菌及其应用,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,1.1 乳酸菌(Lactic Acid Bacteria),乳酸菌的概念及其分布 并非生物分类学名词，而是指能够利用发酵性糖类产生大量乳酸的一类细菌的统称。乳酸菌生成的乳酸，能抑制一些腐败细菌的活动。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,乳酸菌的发现,二十世纪初期,首先发现东欧保加利亚某一高山村落的居民极为长寿，自其日常饮食酸奶（yogurt）中分离出二种乳酸菌:保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus bulgaricus)嗜高温乳酸链球菌(Streptococcus thermophilus),酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,酸奶中的乳酸菌,乳酸球菌,乳酸杆菌,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,乳酸菌主要分布在：乳杆菌属（Lactobacillus）保加利亚乳杆菌（L.bulgaricus）发酵酸奶的生产菌链球菌属（Streptococcus）乳脂链球菌（S.cremoris）干酪、酸制奶油发酵剂菌种,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,明串珠菌属（Leuconostoc）肠膜状明串珠菌（L.mesenterides）生产酸泡菜及右旋糖苷（代血浆）片球菌属（Pediococcus）嗜盐片球菌（P.halophilus）耐NaCl浓度18%20%,参与酱油酿造 乳酸片球菌（P.acidilactici）可在含6%8%的NaCl环境中生长，耐NaCl浓度13%20%，参与酸泡菜发酵。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,双歧杆菌属（Bifidobacterium）人体肠道有益菌群，可定殖在宿主的肠粘膜上形成生物学屏障，具有拮抗致病菌、改善微生态平衡、合成多种微生素、提供营养、抗肿瘤、降低内毒素、提高免疫力、保护造血器官、降低胆固醇水平等重要生理功能，其促进人体健康的有益作用，远远超过其它乳酸菌。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,各式乳酸杆菌,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,各式乳酸球菌,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,双歧杆菌,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,泡菜坛中的乳酸菌,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,乳酸菌在食品酿造中的应用,1发酵乳制品（1）酸牛乳（Yoghurt）（2）干酪（Cheese）。（3)酸性奶油 2果蔬汁乳酸菌发酵饮料3益生菌制剂,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,乳酸菌的分离,一般实验室分离来源：乳制品、葡萄酒、酸泡菜、酱醪、醋醪等。链球菌属分离用培养基：醋酸亚铊琼脂培养基（链球菌属）:pH6.0，35-37，12h，粪链球菌菌落中央红色，边缘白色；乳链球菌菌落深红色。西红柿汁琼脂培养基（乳杆菌）：白色小菌落。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,有些霉菌也能产生大量乳酸，这些霉菌也是乳酸菌吗？乳酸菌为何能抑制腐败细菌的活动？,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,1.2 醋酸菌,醋酸菌不是细菌分类学名词。在细菌分类学主要分布于醋酸杆菌属（Acetobacter）和葡萄糖杆菌属（Glucomobacter），用于酿醋的醋酸菌种大多属于醋酸杆菌属。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,主要醋酸菌种纹膜醋酸杆菌（A.aceti）培养时液面形成乳白色、皱褶状的粘性菌膜。能产生葡萄糖酸及醋酸。奥尔兰醋酸杆菌（A.orleanense）法国奥尔兰地区用葡萄酒生产食醋的菌种。许氏醋杆菌（A.schutzenbachii）法国著名的速酿食醋菌种，也是目前酿醋工业重要的菌种之一。醋酸杆菌AS 1.41 是我国酿醋工业常用菌种之一。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,实验室常用分离来源：醋、啤酒、果酒、酒曲、酒糟、柿饼、果汁等。分离用培养基：曲汁琼脂,pH5.0，25-30，培养37天。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,椭圆形单细胞微生物；出芽繁殖(budding)；为真菌的一种，无叶绿素，不能进行光合作用；喜欢代谢各种糖类；发酵产物为酒精与CO2；较一般细菌耐酸及渗透压；兼性厌氧；常用来制造面包与酒精饮料；制造未来能源之星酒精。,2、酵母菌及其应用,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,Saccharomyces cerevisiae,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,酵母的分布,植物：苹果、谷物、葡萄、橄榄；植物根际、茎、叶、花;动物：鸟类、蚯蚓、鱼、人体、昆虫等;食品或酿造物：啤酒、奶油、罐头、奶酪、巧克力、水果、葡萄酒、蜂蜜、泡菜、面团等;其它：土壤、石油、海水、淡水、空气。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,酵母分离用培养基,豆芽汁琼脂麦芽汁琼脂苹果汁酵母膏琼脂白垩琼脂赖氨酸琼脂萨布德琼脂,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,酵母分离用培养基的特点,最适pH4.55.6（大部分酵母pH 2.5时生长良好）；琼脂量3（pH低时琼脂不易凝固）；加入0.25丙酸钠抑制霉菌；加入抗菌素抑制耐酸菌；最适生长温度2830（培养温度根据需要15-45）。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,酿造业主要酵母菌种,啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）典型的上面酵母，又称爱丁堡酵母。广泛应用于啤酒、白酒酿造和面包制作。在自然界中常出现于水果、果汁、花蜜及富含糖类的食品中。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,葡萄酒酵母（Saccharomyces ellipsoideus）属于啤酒酵母的椭圆变种，简称椭圆酵母。常用于葡萄酒和果酒的酿造。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,产蛋白假丝酵母（Candida utilis）产蛋白假丝酵母，又称产朊假丝酵母或食用圆酵母，富含蛋白质和维生素B，常作为生产食用或饲用单细胞蛋白（SCP）以及维生素B的菌株。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,啤酒酿造果酒酿造白酒酿造面包加工 单细胞蛋白生产,酵母菌在食品酿造中的应用,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,3.食品酿造中霉菌及其应用,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,3.1 毛霉属（Mucor）3.2 根霉（Rhizopus）3.3 曲霉（Aspergillus）3.4 青霉（Penicillium）,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,属接合菌亚门，接合菌纲，毛霉目，毛霉科。具有很强的分解蛋白质和糖化淀粉的能力，常用于酿造、发酵食品等工业。,3.1 毛霉属（Mucor）,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,常见的毛霉菌种,高大毛霉（Mucor mucedo）产生3-羟基丁酮、脂肪酶。总状毛霉（Mucor racemosus）毛霉中分布最广的一种。我国四川的豆豉即用此菌制成。鲁氏毛霉（Mucor rouxianus)最初从小曲中分离出来，产生蛋白酶，有分解大豆的能力，我国多用它来做豆腐乳。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,3.2 根霉属（Rhizopus）,根霉与毛霉类似，能产生大量的淀粉酶，故用作酿酒、制醋业的糖化菌。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,常见的根霉菌种1米根霉（Rhizopus oryzae）常见于我国酒药和酒曲及土壤、空气中。产淀粉酶、乳酸、反丁烯二酸和微量的酒精。是腐乳发酵的主要菌种。2华根霉（Rhizopus chinensis）耐高温，淀粉液化力强，有溶胶性，能产生酒精、芳香脂类、左旋乳酸和反丁烯二酸。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,3.3 曲霉属（Aspergillus）,发酵工业和食品加工业的重要菌种，广泛用于柠檬酸、葡萄糖酸、淀粉酶和酒类的生产。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,葡萄糖,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,常见的曲霉菌1米曲霉(A.oryzae）米曲霉具有较强的淀粉酶和蛋白酶活力，是酱油、面酱发酵的主要菌种。2黄曲霉（A.flavus）有些种产生毒性很强的黄曲霉毒素，使食品和粮食污染带毒，有致癌致畸作用。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,霉菌的分离,分布：土壤、食品、谷物；植物的根、茎、叶、花、果实；动物的粪便；堆肥、生霉材料、某些化工原料等。多数腐生，部分寄生或兼性寄生。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,霉菌分离用培养基,土壤：马丁培养基，马铃薯葡萄糖琼脂（PDA，Potato-Dextrose-Agar）培养基；食品：麦芽汁琼脂，察贝克琼脂，PDA，曲汁琼脂培养基；生霉材料：察贝克琼脂，PDA，麦芽汁琼脂；动物或昆虫：萨布德琼脂，牛肉浸汁，牛肉浸汁血琼脂，牛肉浸汁葡萄糖琼脂。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,霉菌在食品工业中的应用,酱油酿造酱类酿造腐乳发酵柠檬酸发酵,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,各类微生物生长适宜的pH范围,细菌：7.08.0；放线菌：7.58.5；酵母菌：3.86.0；霉菌：4.05.8；藻类：6.07.0；原生动物：6.08.0,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,三、菌种保藏的常用方法,菌种保藏有许多的方法，其共同的目标是把菌株的优良性状保存下来，防止退化、死亡或杂菌污染。保藏的一般程序是选取优良的纯菌种，最好是用其分生孢子或芽孢等休眠体，在其休眠和停止生长的条件下保藏。微生物生长要求适宜的温度、水分、空气和营养物质等，如将菌种处于低温、干燥、无氧和缺乏营养的条件下，就可以使菌种暂时处于休眠状态。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,低温保藏法 低温定期移植法 石蜡油低温保藏法 干燥保藏 甘油管保藏法 真空冷冻干燥法 液氮超低温保存,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,这是一种常用的简便方法。一般的斜面孢子、液态孢子、斜面种子以及用麸皮、大米、小米或碎玉米制成的孢子，可以放在4冰箱内保藏，这种温度条件下不能使菌体进入休眠，而仅是抑制微生物的生命活动。因此，保藏时间不宜过长，一般不超过12个月为宜。本方法虽然简便，但由于菌株处于较高的水平活性下，这对保藏株的生产性状是不利的，因此，生产菌种一般不采用此法保藏。,1、低温保藏法,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,问题为何低温能保存菌种？,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,把培养好的斜面菌种放在4处保存，定期移植，一般36个月移植一次(视菌种特征而定)。也可以用穿刺培养定期移植法保藏细菌，其效果也较好。穿刺培养是将含0.60.8的琼脂培养基装试管灭菌后直立冷凝后，用接种针尖挑取少量菌体，垂直刺入琼脂培养基中心，放在适当温度下培养，待菌长好后即可放低温保存，此法较斜面保存有利，大肠杆菌可保藏2年以上不发生明显变异。,2、低温定期移植法,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,斜面定期移植与穿刺移植法有其缺陷，即容易发生遗传变异；连续传代可使一些生产性状丢失或减弱，也易于污染杂菌。因此，一些贵重菌株及生产优良菌株不宜用此法保藏。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,本方法的原理是在长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡，达到菌体与空气隔绝，使菌处于生长和代谢停止状态，同时石蜡油还防止水分蒸发，在低温下达到较长期的保藏菌种的目的。保藏温度要求在-44下。液体石蜡法适用于不产孢子的菌种。,3、石蜡油低温保藏法,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,具体操作是：菌种为斜面培养菌种，斜面不宜过长；选择纯净优质石蜡油，置三角烧瓶中经过121高压蒸汽灭菌12h，将其放40温箱中，去除灭菌时渗入的水分，待石蜡油变得清澈透明后冷却即可加入斜面。斜面上不能出现气泡，液蜡添加量以高出斜面顶部约1cm左右为宜。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,微生物生长需要水分，干燥法是使菌处于干燥条件下停止生长及处于休眠状态，达到较长期保藏的目的。此法用于细菌芽孢或产分生孢子的菌种，是现在发酵工业生产中较常用的菌种保藏方法。为了转接方便，控制接种量以及对菌种的保护作用，通常将菌种的分生孢子、芽孢，甚至菌丝体吸附于一些载体表面放至干燥容器里进行常压干燥或真空干燥，所用载体有沙土、滤纸、硅胶及大(小)米等。,4、干燥保藏,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,4.1 沙土管法,取河(海)沙，过0.78mm(24目)筛，用10盐酸浸泡24h，倒去盐酸用清水冲洗至pH呈中性，去水烘干或晒干。取菜园或果园土粉碎过筛，把烘干的沙土装入指形管或高100mm、直径为10mm的小试管中，高约1cm(约2g)，塞棉塞121灭菌1h，也可用1702h干热灭菌(或蒸汽三次间歇灭菌)，蒸汽灭菌后需烘干。经肉汤检查确实证明无菌即可使用。将要保存的斜面菌种制成浓孢子悬液(106个/ml)，用灭菌滴管或吸管吸取孢子悬液滴入无菌沙土上，每管约0.30.5ml，用接种环将其混合均匀。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,也可将真菌分生孢子用接种环从斜面直接挑取放入沙土中。然后将沙土管抽真空以加速干燥。这时管内砂土松散，表明已干燥。将干燥的砂土管放置在干燥器或密闭容器内、干燥器下部放置变色硅胶等干燥剂，于4下保存。也可以将从斜面取出的孢子放入沙土管中混匀后，可以不抽真空直接放干燥器内保存。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,在沙土保藏初期，菌死亡率高，以后逐渐减慢，存活下来的孢子在以后保存期间稳定性较好，保藏的有效时间与菌种存活率的关系见图2-10。用沙土管保藏的某些抗生素产生菌保藏期可达18年(土霉素和链霉素产生菌)到22年(新霉素产生菌)，但对利福霉素、卡那霉素、四环素等容易产生变异的菌种，就不适合作长期的沙土管保存。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,4.2 滤纸保藏法,本法是将要保藏的微生物细胞或孢子吸附在灭菌滤纸上，干燥后冷藏。其方法是3#滤纸剪成5mm50mm的小条，放入干燥的培养皿中灭菌。将培养好的菌种用灭菌脱脂乳或奶粉复原乳制成孢子悬液，用灭菌镊子将准备好的滤纸条在灭菌操作下浸入菌悬液中，充分吸附菌细胞，取出后放入灭菌小试管或安瓿管中，在真空干燥机上抽干，真空条件下火焰熔封，冷藏。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,4.3 大(小)米保藏法,是根据我国制曲原理加以改进的一种方法。此法是将曲霉等大量产生孢子的菌直接培养在大(小)米培养基上，待孢子充分成熟后干燥后保藏。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,4.4 麸皮保藏法,麸曲是曲霉菌生长的粗放固体酶制剂。麸皮中碳水化合物和蛋白质含量极为丰富，含有提供曲霉生长的一切维生素、微量矿质元素及其它生长因素。麸皮本身又是固体酶制剂的良好载体，具有表面积大、吸水性好、通气优良等特点，是制曲的好原料。好的麸皮，碳水化合物和蛋白质含量十分协调，即碳氮比适当，有利于曲霉菌的生长和产酶，而且其碳水化合物的主要成份是淀粉，是产生淀粉酶的适宜诱导物。其蛋白质含量，也足以达到正常生产的酶活性。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,什么是曲？,周德庆,曲的构成与功能,固体基质,菌体（菌丝、孢子或细胞）：可用作种子,代谢产物,提供营养源,有利于疏松通气,赋予曲的外形,外酶类：可用作粗酶制剂,其它：如柠檬酸、赤霉素、抗生素等,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,周德庆,曲既是酿造的酶制剂，也是保存酿造用微生物的一种方式。用这种方法保存根霉、曲霉、青霉、红曲霉等属和赤霉菌效果较好，经试验赤霉菌经过4年、红曲霉经过12年后仍然保持着生活活力。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,本法也是利用微生物在低温时代谢和生理等生命活动受到抑制的原理达到保藏目的。其方法是，将80%的甘油高压蒸汽灭菌待用。将培养好的斜面菌种用无菌水制成高浓度的菌悬液(1081010/ml)。取1ml灭菌甘油放入与甘油充分混匀，使甘油浓度约为40%，于-20下冻存。,5、甘油管保藏法,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏的主要因素，除不宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细菌、放线菌、酵母及丝状菌孢子等各类微生物都适用，不宜用冻干法保存的微生物不到2%。冷冻干燥保存的菌种存活时间长、效果好，一般菌种可保存5年以上，有的可保藏15年以上不发生变异。还具有体积小、不易污染、便于运输等优点，是一种最为广泛的菌种保藏方法。,6、真空冷冻干燥法,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻结，然后在真空条件下干燥，使微生物的生长和酶活动停止。为了防止在冷冻和水分升华过程中对细胞的损害，要采用保护剂来制备细胞悬液，使菌在冻结和脱水过程中起到保护作用。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,设备 冷冻干燥装置具有不同型号和类型，但都由四个部分组成：干燥箱、蒸汽捕集器、真空泵、冷冻系统。干燥箱可控制温度范围为-4040。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,本方法是近年推广使用的一种菌种保存法。大多数微生物如病毒、噬菌体，立克氏体，各种细菌、放细菌、支原体，各种丝状菌、酵母、藻类和原虫，特别是一些无法用冻干保存的微生物，都可用此法长期保存。工业微生物高产菌种也逐步采用此法保存。液氮保存的原理是微生物在-130以下温度时，它的新陈代谢作用停止，化学反应也消失，而液氮温度可达-196，在这种情况下可以长期保存。,7、液氮超低温保存,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,菌种的提纯通过寄主体进行复壮淘汰已衰退的个体,四、菌种的提纯与复壮,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,即从已衰退的菌种中，通过分离纯化，将尚未退化的个体分离出来，以恢复和建立具有原来生产性状的群体，继续供科研及生产使用。菌种提纯：一是只要求达到菌落纯化的水平，通过稀释平板法、划线法等常规操作法，该方法较为粗放，适用于菌退化不太严重的情况。另一类方法，可达到“细胞纯”的水平，采用单胞分离法，也可以二者结合，先用前一种方法获得较纯的菌种后再采用单胞分离法进一步纯化。,1、菌种的提纯,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,对于寄生性微生物如苏云金杆菌、白僵菌、多角体病毒等，由于长期使用，其毒力会下降，导致杀虫效率降低即产生衰退现象。这时可以用菌种感染菜青虫幼虫等，然后从致死的虫体上重新分离，经过几次重复感染与分离，就可以逐步恢复和提高毒力。,2、通过寄主体进行复壮,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,通过物理、化学的方法处理菌体(或孢子)，使大部分死亡(80%以上)，存活的菌多为生长健壮者，可从中选出优良菌种来。,3、淘汰已衰退的个体,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,影响细菌、酵母菌、霉菌生长的因素，也是影响发酵的因素。请大家回忆影响微生物生长的因素有哪些？,小 结,营养因素：水、碳源、氮源、无机盐、生长因子、氧；物理化学因素:温度、光线；pH、水活度、氧化还原电势。,酿造学,微生物分离方法,常 用微生物,细 菌,乳酸菌,醋酸菌,霉 菌,酵母菌,菌种保藏提纯复壮,碳源：葡萄糖、糖蜜、淀粉、糊精；氮源：氨盐、硝酸盐、氨水；花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟；无机盐：氯化钠等。,酿造业微生物主要营养物质的来源,