胶团、反胶团萃取.ppt
胶团萃取,胡姝姝 宋均凤2016-11-28,目录,一、胶团与反胶团概述二、反胶团的物理化学特性及制备 三、反胶团萃取机理四、在分离工艺中的应用,一、胶团与反胶团概述,1、胶团的形成及特性2、反胶团的形成及特性3、表面活性剂4、反胶团的分类,1、胶团的形成及特性 胶团或反胶团的形成均是表面活性剂分子自聚的结果，是热力学稳定体系。将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶团浓度（criticalmicelle concentration,CMC）时，表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起形成聚集体，称为胶团（micelles）。特性：水溶液中胶团的表面活性剂的极性基团向外与水相接触，而非极性基团在内，形成一个非极性的核心，此核心可以溶解非极性物质。,极性“头”,水,非极性的“核”,非极性“尾”,正胶团：表面活性剂的极性头朝外，疏水的尾部朝内，中间形成非极性的“核”,2、反胶团的形成及特性,若有机溶剂中加入表面活性剂，当其浓度超过临界浓度时，就会在有机相中也形成聚集体，称为反胶团。在反胶团中，表面活性剂的非极性基团在外，与有机相接触，而极性基团则排列在内形成一个极性核。特性：此极性核具有溶解极性物质的能力，极性核溶解水后，就形成“水池”。由于周围水层和极性基团的保护，保持了蛋白质的天然构型，不会造成失活。,极性“头”,有机溶剂,极性的“核”,非极性“尾”,反胶团：表面活性剂的极性头朝内，疏水的尾部向外，中间形成极性的“核”,3、表面活性剂 表面活性剂的存在是构成反胶团的必要条件，有三类表面活性剂都可在非极性溶剂中形成反胶团。（1）阴离子型表面活性剂（2）阳离子型表面活性剂（3）非离子型表面活性剂,常用的表面活性剂及其相应的有机溶剂,在反胶团萃取蛋白质使用最多的是阴离子型表面活性剂AOT，AOT容易获得，它具有双链，形成反胶团时无需添加辅助表面活性剂且有较好的强度；它的极性基团较小，所形成的反胶团空间较大，有利于生物大分子进入。,4、反胶团的分类,1）单一表面活性剂反胶团体系：是指在使用时无须加入助剂的表面活性剂，具有多条中等长度的烷基尾和一个较小的极性头。A、阴离子型，如AOT。该体系结构简单和稳定，反胶团体积较大，适用于等电点较高的、相对分子量较小的蛋白质的分离；B、阳离子型，如CTAB，DAP等。该体系适用于等电点较低的、相对分子量较大的蛋白质的分离；C、非离子型表面活性剂。能形成更大的反胶团体系，能分离相对分子量更大的蛋白质，但这类体系容易乳化。,2）混合表面活性剂反胶团体系：是指两种或两种以上表面活性剂构成的体系，一般来说，混合表面活性剂反胶团对蛋白质有更高的分离效率。3）亲和反胶团体系：是指除了有组成反胶团的表面活性剂以外，还有具有亲和特征的助剂，它的亲和配基与蛋白质有特异的结合能力，往往极少量亲和配基的加入就可使萃取蛋白质的选择性大大提高。,表面活性剂聚集体的可能的微观构造,1、反胶团的物理化学特性影响反胶团的大小的因素：（1）表面活性剂和非极性有机溶剂的种类、浓度；（2）操作时体系的温度、压力；（3）微小水池中的离子强度等。,二、反胶团的物理化学特性及制备,（1）反胶团的临界胶团浓度 表面活性剂在非极性有机溶剂相中能形成反胶团的最小浓度称为临界胶团浓度（CMC）。大多数在0.11.0mmol/L之间。CMC与表面活性剂的种类有关。见下表,某些表面活性剂的临界胶束浓度(molL),（2）反胶团含水率W：W用水和表面活性剂的摩尔浓度之比来定义：C 水 W=C表面活性剂 如：表面活性剂是AOT，则 W=W越大，反胶团的半径越大。,CAOT,C水,当W 6-8 时，“水池”（微水相）中水分子被表面活性剂亲水基团强烈地束缚，其表观粘度可增大到普通水粘度的50倍，且疏水性非常强。另外，其冰点通常低于0。这一部分水使表面活性剂的亲水性基团水合化，即被牢固地束缚着，所以粘度很大，流动性很差。,在AOT反胶团中，水合化一分子AOT需要68个水分子，而其它水分子则不受束缚，可与普通水一样自由流动。故当W 16时，“水池”中的水逐渐接近主体水相粘度，胶团内也形成二重电荷层。,假定反胶团为球形（除了W或表面活性剂浓度很大外），反胶团平均直径dm的增加和W的增加基本成正比，W=050之间，dm=230nm。AOT的Wmax=60，若W值再增大，反胶团溶液变浑浊，并开始分层。,2、反胶团的制备 制备反胶团系统一般有以下三种方法：（1）注入法 将含有蛋白质的水溶液直接注入到含有表面活性剂的非极性有机溶剂中去，然后进行搅拌直到形成透明的溶液为止。该方法过程快，并能较好地控制反胶团的平均直径和含水量。,（2）相转移法 将酶或蛋白质从主体水相转移到含表面活性剂的非极性有机溶剂中形成反胶团-蛋白质溶液，即把含有表面活性剂的有机相和含有蛋白质的水相接触，在缓慢的搅拌下，一部分蛋白质缓慢转入（萃入）有机相。该过程较慢，但形成的体系处于稳定的热力学平衡状态，有利于在有机溶剂相中获得较高的蛋白质浓度。,（3）溶解法 将含有反胶团（W330）的有机溶液与蛋白质固体粉末一齐搅拌，使蛋白质进入反胶团中。用于非水溶性蛋白质。该法所需时间较长，含蛋白质的反胶团体系稳定。说明反胶团“水池”中的水与普通水的性质有区别。,三、反胶团萃取,1.反胶团萃取原理2.反胶团萃取的优点3.影响反胶团萃取生物分子的主要因素4.反胶团萃取几种相互作用5.蛋白质的溶解模型,胶团萃取（micellar extrceion）是被萃取物以胶团或者胶体形式从水相被萃取到有机相的溶剂萃取方法，既可用于无机物的萃取，也可用于有机物的萃取。反胶团萃取（reversed micellar extrceion）是利用表面活性剂在有机溶剂相中形成反胶团进行萃取，即反胶团在有机相内形成一个亲水微环境，使蛋白质类生物活性物质溶解于其中，从而避免在有机相中发生不可逆变性的现象。,1、反胶团萃取原理 从宏观上看反胶团萃取，是有机相水相间的分配萃取，和普通的液液萃取在操作上具有相同特征。微观上，是从主体水相向溶解于有机溶剂相中的反胶团微水相中的分配萃取。从原理上，可当做“液膜”分离操作的一种。如下图所示：,2、反胶团萃取的优点,萃取率和反萃取率高，并具有选择性；分离、浓缩可同时进行，过程简便；能解决蛋白质(如胞内酶)在非细胞环境中迅速失活的问题；由于构成反胶团的表面活性剂往往具有细胞破壁功效，因而可直接从完整细胞中提取具有活性的蛋白质和酶；反胶团萃取技术的成本低，溶剂可反复使用等。,3、影响反胶团萃取生物分子的主要因素,（1）水相pH值的影响 蛋白质是一种两性电解质，水相的pH值决定了蛋白质分子表面可电离基团的离子化程度，当蛋白质所带电荷与反胶团内所带电荷的性质相反时，由于静电引力，可使蛋白质转移到反胶团中。相反，当水相pH大于等电点时，由于静电斥力，使溶入反胶团的蛋白质反向萃取出来，实现了蛋白质的反萃取。,（2）水相离子强度的影响 a：离子强度影响到反胶团内壁的静电屏蔽的程度，降低了蛋白质分子和反胶团内壁的静电作用力。b：减小表面活性剂极性头之间的相互斥力，使反胶团变小。这两方面的效应都会使蛋白质分子的溶解性下降，甚至使已溶解的蛋白质从反胶团中反萃取出来。,（3）助表面活性剂的影响 蛋白质的分子量往往很大，超过几万或几十万，使表面活性剂形成的反胶团的大小不足以包容大的蛋白质，而无法实现萃取，此时加入一些非离子表面活性剂，使它们插入反胶团结构中，就可以增大反胶团的尺寸，溶解相对分子质量较大的蛋白质。,（4）溶剂体系的影响 溶剂的性质，尤其是极性，对反胶团的形成和大小都有影响。常用的溶剂有：烷烃类（正己烷、环己烷、正辛烷、异辛烷等）。有时也使用助溶剂，如醇类。可以调节溶剂体系的极性，改变反胶团的大小，增加蛋白质的溶解度。,4、反胶团萃取相互作用,因分离中使用的表面活性剂种类不同，如阴离子型和阳离子型，其相互作用和分离原理也会不同。以立体性、静电性、疏水性相互作用的分离特性归纳如下：,1）氨基酸分离特性 氨基酸分子量与反胶团相比太小，不存在反胶团-氨基酸分子间的立体性相互作用和分子间的大小识别。但由于氨基酸因pH不同而发生正负电荷的变化和带有疏水性残基，所以，以静电和疏水性相互作用来定量评价氨基酸的萃取特性和效果。,如图，平均每单位正电荷量、每分子AOT，萃入的氨基酸分子数是一固定值，该值由氨基酸种类决定。氨基酸残基的疏水性越大，该值越大。,2）酶、蛋白质萃取特性 酶、蛋白质等生物大分子的空间尺度与反胶团的大小相接近，故存在立体性相互作用。各种相互作用都很重要，在大多数情况下，是它们之间的复合作用。有些蛋白质的构象发生很小的变化时，就可能对这些相互作用的结果产生很大影响。,（1）静电性相互作用,小分子蛋白质（Mr pI 时，蛋白质不能溶入胶团内，但在等电点附近，急速变为可溶。当pH pI时，即在蛋白质带正电荷的pH范围内，它们几乎完全溶入胶团内。,蛋白质分子量增大到一定程度，即使将pH向酸性一侧偏离pI，萃取率也会降低（即立体性相互作用效果增大）。分子量更大的BSA，全pH范围内几乎都不能萃取（即静电相互作用效果无限小，可忽略不计）。此时，AOT浓度如从通常条件（50100mmol/L）增加到200500mmol/L，逐渐变为可萃取。,降低pH，正电荷量增加，萃取率从某一pH开始，急速减小。这是因为pH导致蛋白质变性造成的。蛋白质和微量的AOT在静电、疏水性等的相互作用下，在水相中形成了复合体而变性。,添加KCl等无机盐，因离子强度的增加和静电屏蔽的作用，而使静电性相互作用变弱，一般地，萃取率下降。,（2）立体性相互作用（空间位阻）随蛋白质分子量的增大，蛋白质分子和胶团间的立体性相互作用增加，萃取率下降。,萃取溶入胶团的蛋白质的种类和分子量不同，对分离场的特性（胶团平均直径和含水率）影响很小。随着蛋白质分子量的增加，分配系数KpI（蛋白质等电点处的分配系数）迅速下降。可以认为相对分子量20000左右的蛋白质的高效分离是通过立体性相互作用来实现的。,（3）其它的相互作用 关于疏水性相互作用和特异性相互作用，还研究不多。一般认为疏水性相互作用对蛋白质分配特性的影响不大。,蛋白质向非极性溶剂中反胶团的纳米级水池中的溶解，有下图所示的四种可能。（1）为水壳模型；（2）蛋白质中的亲脂部分直接与非极性溶剂的碳氢化合物相接触；（3）蛋白质被吸附在微胶团的“内壁”上；（4）蛋白质被几个微胶团所溶解，微胶团的非极性尾端与蛋白质的亲脂部分直接作用。,5、蛋白质的溶解模型,在水壳模型中，蛋白质居于“水池”的中心，水壳层保护了蛋白质，使它的生物活性不会改变。蛋白质表面电荷与反胶团内表面电荷间的静电作用是使蛋白质进入反胶团的重要因素，因此凡能影响静电作用的因素都会影响蛋白质的溶入，如水溶液的pH、离子强度等。,四、在分离工艺中的应用,1、蛋白质分离 利用静电相互作用，通过三步分离核糖核酸a、细胞色素c和溶菌酶。调整pH，进行正萃取分离，通过控制KCl浓度，反萃取分离，获得较好地分离效果和收率。,第一步：在pH=9.0和较低的盐浓度下，核糖核酸酶a带负电荷，不能被反胶团萃取，留在水相中，而细胞色素C和溶菌酶由于都带正电荷，被萃取到反胶团中。第二步：利用提高离子强度，将细胞色素C反萃到水相中，而溶菌酶仍留在反胶团中。第三步：进一步提高pH值和离子强度，将溶菌酶反萃到水相中。,2、直接提取胞内酶,用反胶团直接从全发酵液中提取和纯化棕色固氮菌的胞内脱氢酶：将全细胞的悬浮液注入CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）/己醇-辛烷反胶团溶液中，完整的细胞在表面活性剂的作用下，析出酶进入反胶团的“水池”中，经反萃取，可选择性地回收浓度很高的酶。该技术不利的一面是细胞碎片留在反胶团中，使得反胶团不能循环利用。,3、反胶团萃取用于蛋白质的复性,反胶团萃取的另一个应用是蛋白质的复性。重组DNA技术生产的大部分蛋白质，须溶于强变性剂中，以便从细胞中抽提出来。除去变性剂，进行复性的过程通常要在极稀的溶液中进行，以避免部分复性中间体的凝集。利用反胶团包裹变性的蛋白质，通过调整系统组成的环境参数，使得每个微胶团只包裹一个蛋白质分子，然后改变胶团溶液组成进行复性，由于蛋白质被单独装在各个胶团中，复性时完全不接触，避免了有害作用，使酶的活性完全恢复。,4、从植物中提取油和蛋白质,用烃类有机溶剂对植物种子进行反胶团萃取，油被直接萃入有机相，蛋白质却萃入反胶团的“水池”中。先用水溶液反萃取得到蛋白质，溶液再经冷却使表面活性剂沉淀分离，最后用蒸馏的方法将油和烃类分离。,谢谢！,
