核酸分离和纯化.ppt
1,核酸的分离和纯化,2,找答案？,核酸分离纯化的原则是什么？为防止核酸降解需要注意什么？核酸制备基本步骤？如何鉴定核酸浓度和纯度？核酸的保存方法有哪些？,3,前言,核酸（nucleic acid）是以核苷酸为基本组成单位的生物信息大分子。是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。,4,核酸的分类：DNA 核内染色体 DNA。核外也有少量DNA，如线粒体DNA，叶绿体DNA。质粒DNA。RNA存在于细胞质中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。,5,主要内容,1.核酸分离与纯化的原则及要求2.核酸制备的基本步骤3.核酸的鉴定和保存4.核酸提取方法简介,6,1.核酸分离与纯化的原则及要求,1.1 核酸分离与纯化的一般原则(1)保持核酸分子一级结构的完整性，是核酸结构和功能研究的最基本要求。(2)排除其他分子的污染，保证核酸的纯度。,7,1.2 核酸分离与纯化的要求(1)为保证核酸的完整性，（防止降解），在实验中应注意：尽量简化步骤，缩短提取时间，减少各种有害因素对核酸的破坏。减少化学因素对核酸的降解，pH5-9。,化学因素？生物因素？物理因素？,8,防止核酸的生物降解（细胞内或外的各种核酸酶水解）。所用器械和一些试剂需高压灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。操作温度为04。DNA酶需要金属离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等；阴离子表面活性剂SDS。RNA酶分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）浸泡，器械180干烤8h。,9,减少物理因素对核酸的降解，主要是机械剪切力，其次是高温。机械剪切力包括强力高速的振荡、突然暴露于低渗液、样品反复冻融等。高温，如长时间的煮沸。,10,(2)核酸纯度的要求：非核酸生物大分子的污染降低到最低程度，如蛋白质、多糖和脂类分子；排除其它核酸分子的污染，如制备RNA时，DNA分子是污染物；去除对后续实验有影响的物质，如有机溶剂和过高浓度的金属离子。,11,2.核酸制备的基本步骤,12,2.1 破碎细胞,(1)玻璃匀浆器匀浆,(2)液氮研磨法多用于坚硬植物材料，研磨时常加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨剂，以提高研磨效果,肝、肾等 冰上 少量,13,(3)高速组织捣碎机捣碎(4)超声波处理法,(5)化学处理法(SDS、吐温80（油酸酯）等）(6)生化法（溶菌酶、纤维素酶等）,14,2.2 核酸分离，去除蛋白,核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。,15,（1）加入SDS SDS除有破膜和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；（2）加入浓盐溶液（如NaCl）核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；,16,（3）酚/氯仿抽提酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醇=25：24：1）。,17,(1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。(2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。,使用酚时应注意,18,2.3 沉淀核酸,重新调整核酸的浓度，起到浓缩核酸的作用；去除溶液中某些盐离子与杂质；改变核酸的溶解缓冲液。,DNA纯化柱,核酸提取（离心柱型）利用硅胶膜特异吸附核酸,19,2.3.1 核酸的有机溶液沉淀法,当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离子状态。钾、钠、镁、锂及铵根等阳离子形成的盐，通过屏蔽带负电的磷酸基团使DNA分子聚结在一起而不溶于许多有机溶剂。,启示什么？,20,核酸沉淀的盐类及浓度,21,乙醇优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。缺点：需要量大，一般要求低温操作。,常用的有机沉淀剂,22,异丙醇优点：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。缺点：易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，最后用70乙醇漂洗数次。,23,聚乙二醇（PEG）,优点：可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。注意：PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10 mmol/L的MgCl2。,24,精胺,精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。原理是：精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的。,25,2.3.2 核酸沉淀的温度和时间,一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。但时间过长，易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验。一般使用0冰水，10-15min，DNA样品足可达到实验要求。,26,3.核酸的浓度和纯度的测定,3.1 紫外分光光度法鉴定核酸 3.2 荧光光度法鉴定核酸,27,3.1 紫外分光光度法鉴定核酸,3.1.1 紫外分光光度法测DNA和RNA的含量 前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 g/ml。,结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50 g/ml；单链DNA为37 g/ml；RNA为40 ug/ml。,28,紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤,a分光光度计先用一定量的水校正零点。b吸取一定量的DNA样品或RNA样品，加入到盛有一定体积水的石英比色杯中。,29,c测定待测样品在230nm、260nm和280nm的OD值d计算浓度。双链DNA样品浓度(g/l)=OD260核酸稀释倍数 50/1000；RNA样品浓度(g/l)=OD260核酸稀释倍数40/1000。e分析纯度。,核酸定量仪可直接获得浓度，不用计算。,小分子杂质,核酸,蛋白质,30,核酸的紫外吸收光谱,超微量核酸定量仪更加方便,31,A：测DNA：纯的DNA样品OD260/OD280=1.8（1.71.9）OD260/OD2302.01)OD260/OD2801.9,RNA污染。2)OD260/OD2801.6，存在蛋白质或酚污染；3)OD260/OD2302.0，溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸等。注：可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况。,3.1.2 紫外分光光度法分析纯度,32,B：测RNA 纯的RNA样品OD260OD280=2.0(1.72.0)OD260/OD2302.01）OD260/OD280比值太小，蛋白质或酚的污染；2）OD260/OD2802.0，可能被异硫氰酸胍等污染；3）OD260/OD2302.0，表明有小分子及盐存在。,33,3.2 荧光光度法鉴定核酸,测定核酸含量：原理：DNA、RNA在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA、RNA样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液浓度。注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。,常用的荧光染料还有:golden view,gel red,sybr green,34,3.2.2 荧光光度法鉴定核酸纯度原理：溴化乙锭(EB)等荧光染料示踪的核酸电泳结果。,35,核酸鉴定实际常用操作程序,核酸定量仪测定浓度，OD260/OD280及OD260/OD230比值。,琼脂糖电泳，UV下观察验证纯度及判断是否降解,36,(1)对DNA DNA样品溶于pH8.0的TE，4 或-20 保存；长期保存样品中可加入1滴氯仿。(2)对RNA RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc(pH5.2)可以沉淀形式贮于乙醇，可在-20 中长期保存;最常用无RNase水或高压后的DEPC水溶解RNA，冻贮于-70-80。,3.3 核酸的保存,TE：Tris-Cl,EDTA,37,4、核酸提取方法简单介绍,4.1 基因组DNA的提取方法4.2 质粒的提取和纯化4.3 Trizol法提取总RNA,38,4.1 基因组DNA的提取方法,4.1.1 酚抽提法,以含EDTA、SDS及RNase的裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提。,（DNA）,39,原理：在正常情况下，核酸表面覆盖了一层由水分子组成的亲水薄膜，以维持其水溶性。高浓度盐离子的加入破坏了核酸表面亲水薄膜的相对有序排列，形成了疏水环境。在此环境中，核酸与硅胶膜能有效结合，而蛋白质、代谢产物和其他污染物则不能结合。特点：不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。快速，简捷。,4.1.2 基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）,常用的试剂盒：Qiagen,40,甲酰胺解聚法：细胞裂解步骤与酚抽提法一致，但以高浓度甲酰胺裂解液裂解DNA与蛋白质复合体，再以透析除去杂质玻璃棒缠绕法：将基因组DNA沉淀缠绕于带钩玻璃棒上带出，溶于pH8.0的TE异丙醇沉淀法玻璃珠吸附法,4.1.3 其他的基因组DNA提取方法,41,离心柱型基因组DNA提取步骤,42,透析，沉淀，电泳，选择性沉淀,4.1.4 DNA样品的进一步纯化,4.1.5 DNA片段的回收,原则：提高回收率，去除杂质污染从琼脂糖凝胶中回收：DEAE纤维素膜插片电泳法，电泳洗脱法 冷冻挤压法从聚丙烯酰胺凝胶中回收：压碎与浸泡,43,4.2 质粒的提取和纯化,质粒的结构：超螺旋，半开环，线性DNA理化性质：与一般核酸相似，但抗切割和抗变性能力更强所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)。选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求。,44,4.2.1 质粒提取原理,45,4.2.2 质粒DNA的纯化与回收,纯化CsCl-EB法聚乙二醇沉淀法柱层析法回收：与基因组DNA类似,46,4.3 RNA的分离和纯化,RNA易被RNase水解，RNase除细胞内还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中RNase分子结构中的二硫键使其生物学活性非常稳定排除RNase的污染是RNA制备成功与否的关键,47,4.3.1 RNA制备的条件与环境,洁净的实验室操作人员带口罩，勤换手套玻璃器皿（如匀浆器）、镊子180干烤8 h或更长时间枪头、EP管0.1%DEPC水浸泡过夜，再高压；或直接购买无RNase的枪头和EP管冰上匀浆，4 离心,48,Trizol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性。Trizol中还加入了8羟基喹啉、异硫氰酸胍、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。,4.3.2 Trizol法提取总RNA,49,Trizol法提取总RNA步骤,Chloroform,首选Invitrogen,50,Trizol法提取RNA步骤,1、每50-100mg 组织加入1ml Trizol，用匀浆器匀浆处理，室温放置5min，使其充分裂解。12,000rpm 离心5min，弃沉淀。2、加入氯仿200微升每管，剧烈振荡15s，室温放置2-3 min。12000g,4，离心15 min 3、吸取上层水相(约400微升），至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。4、每使用1ml Trizol 加入0.5 ml 异丙醇，室温10min。12000g，4，10 min,弃上清，RNA沉于管底。5、加入1 mL75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。12000g,4,5min。，尽量弃上清。6、室温晾干或真空干燥5-10min。加入20微升无RNase 水溶解RNA 沉淀。,51,除血红蛋白及某些组蛋白外，绝大多数mRNA在其3末端带有1个长短不一的多聚核苷酸的结构，即poly（A）尾巴olig（dT）-纤维素柱层析法olig（dT）-纤维素液相结合离心法其他方法：磁珠法 生物素标记的oligo（dT）结合poly（A）尾，再结合亲和素标记的磁珠,4.3.3 mRNA的分离和纯化,
