固定化酶和细胞原理.ppt

第八章 固定化酶反应原理与技术,酶催化剂的优点：专一性强，反应条件温和，反应速度较快。弱点：溶液酶在反应后，分离困难，重复利用困难；溶液酶稳定性差，易失活。,1969出现了固定化酶技术。固定化酶就是把原来游离的水溶性酶，设法限制或固定于某一 局部的空间或者固定于载体上。,概述,图8-1 生物催化剂作用方式示意,固定化酶的发展史,什么是固定化酶？,水溶性酶,水不溶性载体,水不溶性酶（固定化酶）,固定化技术,二 固定化酶的优缺点 多次使用 可以装塔连续反应优点：纯化简单 提高产物质量 应用范围广缺点：首次投入成本高 大分子底物较困难,固定化酶的性质及其影响因素,一 影响固定化酶性质的因素二 固定化后酶性质的变化三 评价固定化酶的指标,一 影响固定化酶性质的因素,1 酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。,2 载体的影响（1）分配效应（2）空间障碍效应（3）扩散限制效应3.固定化方法的影响,二固定化后酶性质的变化,1 固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降,2 固定化对酶稳定性的影响（1）操作稳定性提高（2）贮存稳定性比游离酶大多数提高。(3)对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。(4)对分解酶的稳定性提高。（5）对变性剂的耐受力升高,2 固定化后酶稳定性提高的原因：,a.固定化后酶分子与载体多点连接。b.酶活力的释放是缓慢的。c.抑制自降解，提高了酶稳定性。,3 pH的变化,PH对酶活性的影响：（1）改变酶的空间构象（2）影响酶的催化基团的解离（3）影响酶的结合基团的解离（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。,1）载体带负电荷，pH向碱性方向移动。微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为宏观环境。,载体带正电荷，pH向酸性方向移动。（2）产物性质对pH的影响催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离酶的pH值高；反之则低,4 最适温度变化,一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。5 底物特异性变化作用于低分子底物的酶 特异性没有明显变化既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。,6 米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化,由于分配效应：=Si微环境/S宏观环境 Km=Km/(表观米氏常数)（1）载体与底物带相同电荷，SiKm固定化酶降低了酶的亲和力。（2）载体与底物电荷相反，静电作用，SiS，则1,KmKm,三 评价固定化酶的指标：,1 酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。计量单位2.酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力单位 品质的体现,三 评价固定化酶的指标：,1.固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。2.操作半衰期：衡量稳定性的指标。连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）,3.4.或称偶联效率，活力保留百分数。5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力,四 固定化酶的活力测定方法介绍,1.振荡测定法：称取一定量的固定化酶 加入一定量的底物溶液，一边振荡或搅拌，一边进行催化反应 取出一定量的反应液进行酶活力测定。2.酶柱测定法：将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱中 让底物溶液以一定的流速流过酶柱 收集流出的反应液 测定其中产物的生成量或底物的消耗量,3.连续测定法利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活力。,固定化酶的性质及其影响因素提要,影响固定化酶性质的因素固定化酶的性质评价固定化酶的指标,酶本身的变化载体的影响,固定化对酶活性的影响固定化对酶稳定性的影响最适pH的变化最适温度变化底物特异性与游离酶不同米氏常数Km的变化,评价指标活力测定方法,固定化酶的制备,一 一般方法及特点二 酶的固定化方法,一 一般方法及特点,关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进。1 四大类方法：吸附法（包括电吸附法）结合法（无机多孔材料）交联法（双功能试剂）包埋法（微胶囊法）,各类固定化方法的特点比较:,2 选择方法依据：,（1）酶的性质（2）载体的性质（3）制备方法的选择,3 固定化后酶的考察项目：,（1）测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率。（2）考察固定化酶稳定性（3）考察固定化酶最适反应条件,二 酶的固定化方法,（一）吸附法（二）结合法（三）交联法（四）包埋法（entrapping method）,酶和细胞固定化示意图,（一）吸附法,1 物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。,（一）吸附法,常用载体：无机载体：氧化铝、活性碳、皂土、硅藻土、金属氧化物、硅胶。一般吸附量1mg蛋白/克吸附剂有机载体：淀粉、白蛋白等。一般吸附量几十毫克蛋白/克吸附剂研究热点：大孔型合成树脂、陶瓷,（二）结合法,1 离子键结合法2 共价键结合法,1 离子键结合法,概念常用载体:DEAE-纤维素（功能团：二乙氨乙基），DEAE-葡聚糖凝胶使用注意：pH、离子强度、温度,2 共价键结合法,（1）概念（2）可以形成共价键的基团：游离氨基，游离羧基，巯基，咪唑基，酚基，羟基，甲硫基，吲哚基，二硫键（3）常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体,（4）载体活化的方法,A重氮法B叠氮法C烷基化反应法D硅烷化法E溴化氰法,A重氮法,反应示意式如下,目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等该方法需要载体具有芳香族氨基,反应式及原理,A重氮法例,5-磷酸二酯酶的固定化。此酶用来降解核酸，可分离得到四个5-单核苷酸（本成果荣获国家发明三等奖，中国科学院上海生化研究所袁中一等，我国第一个用于工业生产的固定化酶）,B 叠氮法,例用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶，步骤如下：酯化：CM-纤维素先洗涤干燥，然后悬于无水甲醇中，在冰浴中通入HCl气体，进行酯化反应；然后洗涤，空气干燥。肼解。把酯化后的CM-纤维素悬于甲醇中，再加入80%水合肼回流反应1小时，过滤，洗涤干燥。,叠氮化。肼解后的CM-纤维素（1g）加入150ml 2%HCl在冰浴中混合，搅拌滴加9ml 3%NaNO2反应20min，过滤用冷蒸馏水洗涤，同时加酶(4)偶联：经叠氮化后的载体加入0.05N pH 8.0 磷酸缓冲液（内含250-500mg酶），5搅拌2-3小时，过滤，用 0.001N HCl，水洗涤，即为固定化胰蛋白酶（冻干保存）,对含有羧机基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后于酶偶联,C烷基化反应法,D硅烷化法,多孔玻璃特点：机械强度好，表面积大。耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生，寿命长等。,一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。,E 溴化氰法,本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等.,（三）交联法,借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。,（三）交联法的形式,交联法有2种形式：酶直接交联法 酶辅助蛋白交联双重固定法（1）吸附交联法（2）交联包埋法,酶直接交联法,在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。,酶辅助蛋白交联,为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起酶失活，可使用第二个载体蛋白质.,（1）吸附交联法,先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。,（2）交联包埋法,把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。这样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好。,（四）包埋法（entrapping method）,定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。,包埋法分为网格型和微囊型1网格型2微囊型,1网格型,(1)概念 将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法,2微囊型包埋法,是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。,微囊化法制备固定化酶有两种方法,界面沉淀法界面聚合法,界面沉淀法,这是一种简单的物理法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。此法条件温和，酶失活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很麻烦。,界面聚合法,是用化学手段制备微囊的方法。利用油水界石上发生聚合反应形成聚合体而将酶包裹起来。,固定化酶方法研究热点,1 热处理法：2 结晶法：3 分散法：,固定化细胞的特点,所谓固定化细胞技术，就是将具有一定生理功能的生物细胞，例如微生物细胞、植物细胞或动物细胞等，用一定的方法将其固定，作为固体生物催化剂而加以利用的一门技术。固定化细胞与固定化酶技术一起组成了现代的固定化生物催化剂技术。,固定化细胞的优越性无需进行酶的分离和纯化，减少酶的活力损失，同时大大降低了成本；可进行多酶反应，且不需添加辅助因子，固定化细胞不仅可以作为单一的酶发挥作用，而且可以利用菌体中所含的复合酶系完成一系列的催化反应，对于这种多酶系统，辅助因子再生容易；对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的稳定性更高，对污染的抵抗力更强；细胞生长停滞时间短，细胞多，反应快等等。正是由于固定化细胞的这些无可比拟的优势，尽管其出现远远晚于固定化酶，但其应用范围比固定化酶更为广泛。,应用范围固定化细胞的应用范围极广，目前已遍及工业、医学、制药、化学分析、环境保护、能源开发等多种领域。在工业方面，如利用产葡萄糖异构酶的固定化细胞生产果葡糖浆；将糖化酶与含淀粉酶的细菌、霉菌或酵母细胞一起共固定，可以直接将淀粉转化成葡萄糖；利用涨澡酸钙或卡拉胶包埋酵母菌，通过批式或连续发酵方式生产啤酒；利用固定化酵母细胞生产酒精或葡萄酒；此外，还可利用固定化细胞大量生产氨基酸、有机酸、抗生素、生化药物和甾体激素等发酵产品。在医学方面，如将固定化的胰岛细胞制成微囊，能治疗糖尿病；用固定化细胞制成的生物传感器可用于医疗诊断。在化学分析方面，可制成各种固定化细胞传感器，除上述医疗诊断外，还可测定醋酸、乙醇、谷氨酸、氨等。此外，固定化细胞在环境保护、产能和生化研究等领域都有着重要的应用。,吸附法,它主要通过载体与细胞间的静电引力，即细胞表面与载体之间范德华作用力，离子键和氢键作用力，才使细胞固定在载体上的。,影响吸附法的主要因素,（1）Z-电位：Z-电位能近似地代表表面电荷密度的大小（2）细胞的性质和细胞壁的组成：细胞壁的电荷性质（3）载体的性质：特别是玻璃、陶瓷等无机材料,包埋固定法,包理法是在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情况下将其包埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固定化方法。包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内多酶系统的活力，可象游离细胞那样进行产物的发酵生产。,包埋法分类,常用载体：琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺常用凝胶包埋法,通过改变载体溶液参数包埋细胞,改变载体溶液、操作温度、盐浓度、pH值和溶剂等参数时，亦可使其转变为凝胶状态，将细胞包埋其中。,研究热点光交联树脂包埋法,例：相对分子量为1000-3000的光交联聚氨酯预聚物等，加入1%左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至50，然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用紫外照射3min，就可制得,固定化原生质体和辅酶,一 原生质体固定化的方法制备原生质体将原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中配成原生质体悬浮液包埋法固定化原生质体。关键：原生质体如何制备？,二 原生质体的制备,将对数生长期的细胞收集悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中去细胞壁分离纯化得到原生质体-活性鉴定,三 酶解注意要点,1 酶解前要预处理：主要是为了使酶渗透到细胞器中去。采取的策略：先加入物质抑制或阻止某种细胞壁的成分合成，可以使酶插入。一般加入：巯基乙醇，Triton-100,甘氨酸、青霉素。,2 酶系选择：溶菌酶蜗牛酶葡聚糖酶纤维素、半纤维素、和果胶酶3 酶浓度选择（0.5%-1%）,4 酶解温度和pH5 酶解终点确定,四 稳定剂（高渗溶液）要求,1 加入的化合物对细胞和原生质体无毒性2 不会影响水解酶的活性3 对代谢产物无不良影响,四 稳定剂加入操作注意点,1一定pH（酶和菌体活性最高）2一定的浓度（过高浓度原生质体易脱水皱缩）3种类：无机盐-对细菌 有机物糖和糖醇-酵母4易于渗入质膜、易于被原生质体和菌体分解的物质不宜作为稳定剂,五 原生质体细胞活性的检测,1 荧光素双醋酸盐（FDA)染色法2 酚藏花红染色法3 伊文思兰染色法,四 辅酶固定化,1 原因有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化反应(递氢、递电子或递某些化学基团的作用）有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生有机辅因子价格昂贵工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生,辅酶固定化的方法：,2 固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后固定在超滤器中。3 辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。策略：先在辅酶的一定部位进行修饰-引入功能团和间隔臂（形成辅酶衍生物）-再与水溶性高分子结合,辅酶的固定化,辅酶再生的形式：,辅酶和酶共固定与酶分子偶联成辅酶-酶复合物,固定化原生质体和辅酶的固定化,原生质体辅酶固定化,方法固定化要点,原因方法形式,酶反应器和固定化酶（细胞）的应用,酶反应器介绍 酶反应器的选择和应用 固定化酶和细胞的应用,生物催化反应器工程,通过反应器型式、操作方式的改变能否使生物催化反应效率最大化？将反应与传质紧密相关,一酶反应器。,分批搅拌反应器。搅拌罐型 连续流搅拌桶反应器。固定床型（填充床反应器）流化床反应器连续搅拌桶-超滤反应器循环反应器膜式反应器鼓泡塔型,分批搅拌反应器,反应器结构简单，不需要特殊装置，适与小规模试验,连续流搅拌桶反应器,连续搅拌釜式反应器,填充床反应器,旋转填充床,流化床反应器,与连续流搅拌桶式反应器类似，是让适量的颗粒状酶悬浮于反应床中，不用搅拌器，而是底物向上流过固定酶床，因此流速要适当控制。,循环反应器,高效内循环生物反应器（HCR）,连续搅拌桶-超滤反应器,膜式反应器,定义：由膜状或板状固定化酶或固定化微生物组装的反应器均称为膜式反应器。类型：直接接触式酶膜反应器、扩散型膜反应器和多相酶膜反应器。,采用聚砜中空纤维膜反应器固定淀粉酶可控制淀粉水解，制备糊精。,鼓泡塔型反应器,适用对象：反应中涉及气体的吸收或产生时适用。气体进入方式：与底物一起从底部进入，经过气体分散板分散。和循环液从底部以切线方向进入。,反应器选择,酶的形式：溶液酶 颗粒状或片状固定化酶 膜状和纤维状固定化酶底物的物理性质：溶解性、颗粒物质和胶体物质反应操作要求酶的稳定性应用和可塑性和成本,酶反应器的应用,控制酶反应器液态流动方式反应器中流动方式的改变会使酶与底物的接触不良，造成反应器生产能力降低。流动方式改变造成反混程度的变化，会发生程度不同的反应或副反应。物料粒子进入反应器后所经历的时间称为粒子的年龄。粒子离开反应器时的年龄称为停留时间。反应器内不同年龄的粒子间的混合称为反混。,酶反应器对底物恒定转化目的：反应器能平稳的进行工作，有利于实现自控操作方法：控制底物流速国外热点：将固定化酶反应器串联或并联操作。,保持酶反应器的稳定性：防止酶变性、中毒、自溶或载体磨损。防止酶反应器中微生物污染向底物中加入杀菌、抑菌物质，或有机溶剂底物物料预先除菌在45度以上环境中或酸、碱缓冲液中进行反应酶反应器每次用后消毒,二固定化酶（细胞）的应用,1 固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用2 固定化酶在医药治疗上的应用3 固定化酶在分析化学中应用4 固定化酶和亲和色谱5 固定化酶与环境保护6 新能源开发中的应用7 固定化酶在基础理论研究中应用,1 固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用,葡萄糖异构酶世界上生产规模最大的一种固定化酶。用吸附法、结合法、凝胶包埋法等进行固定化。葡萄糖异构酶葡萄糖 果糖 果葡糖浆,聚丙烯酰胺凝胶包埋含有延胡索酸酶的产氨短杆菌菌体，制得固定化延胡索酸酶。工业化生产L-苹果酸利用固定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶固定化酵母细胞等微生物可用于生产各种酒类,固定化原生质体的应用,研究中：固定后化枯草杆菌原生质体生产碱性磷酸酶，使原来存在于细胞中的碱性磷酸酶，全部分泌到发酵液中，提高产率36%，可连续使用37天。,2 固定化酶在医药治疗上的应用,例1固定化青霉素酰化酶，只要改变pH值等条件，就既可以催化青霉素或头孢菌素水解生成6-氨基青霉烷酸酸或7-氨基头孢霉烷酸也可以催化6-APA或7-ACA与其他的羧酸衍生物进行反应合成新的具有不同恻链基团的青霉素或头孢霉素,青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素,7-ACA as nucleus,青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素,7-ACCA or 7-ADCA as nucleus,酶促合成头孢类抗生素,工艺路线（1）大肠杆菌的培养 斜面培养基为普通肉汤琼脂培养基，发酵培养基的成分为蛋白胨、氯化钠、苯乙酸、自来水。用氢氧化钠调酸度为7.0，在55。16kP下灭菌30分后备用。在250毫升摇瓶中加入发酵液培养液30毫升，将斜面接种后培养18-30小时的大肠杆菌D816（产青霉素酰化酶），用15毫升无菌水制成菌细胞悬液，取1毫升悬浮液接种至装有30毫升发酵液培养基的摇瓶中，在摇床上28，170转每分振荡培养15小时，如此依次扩大培养，直至1000-2000升规模通气搅拌培养，培养结束后用高速管式离心机收集菌体，备用。,2）大肠杆菌固定化 取湿菌体100公斤，置于40度反应罐中，在搅拌下加入50升10%戊二醛5升，在转移至搪瓷盘中，使之成为3-5厘米厚的液层，室温放置2小时，再转移至4度冷库过夜，待形成固体凝胶后，通过粉碎和过筛，使其成为直径为2毫米左右的颗粒状固定化大肠杆菌细胞，用蒸馏水以酸度7.5和0.3摩尔每升磷酸缓冲液先后充分洗涤，抽干，备用。（3）固定化大肠杆菌反应堆制备 将上述充分洗涤后的固定化大肠杆菌细胞装填于带保温夹套的填充式反应器中，即成为固定化大肠杆菌反应堆，反应器规格为直径70*160厘米。,4）转化反应 取20公斤青霉素G钾盐，加入到1000升配料罐中，用0.03摩尔每升、pH7.5的磷酸缓冲液溶解并使青霉素G钾盐浓度为3%，用2摩尔每升氢氧化钠溶液调pH至7.5-7.8，然后将反应器及pH调节罐中反应液温度升刀0度，维持反应体系的酸度在7.5-7.8范围内，以70每分70升流速使青霉素G钾盐溶液通过固定化大肠杆菌反应堆进行循环转化，直至转化液酸度不变为止。循环时间一般为3-4小时，反应结束后，放出转化也8，再进入下一批反应。,（5）6-氨基青霉烷酸的提取 上述转化液经过滤澄清后，滤液用薄膜浓缩器减压浓缩至100升左右，冷却至室温后，于250升搅拌罐中加50升醋酸丁脂充分搅拌提取10-15分，取下层水相，加1%克每毫升活性炭于70度搅拌脱色30分，滤除活性炭，滤液用6摩尔每升盐酸调酸度至4左右，5度放置结晶过夜，次日滤取结晶，用少量冷水洗涤，抽干，115度烘2-3小时得成品6-氨基青霉烷酸，收率为70-80%。,例2：制造人工肾利用固定化脲酶透析液和活性炭一起制成的体外循环装置，大大提高了疗效。固定化脲酶由酶与离子交换树脂一起制成微小胶囊尿酶可分解尿素为NH3和CO2，NH3被树脂吸附，CO2可由肺部排出，活性炭用以吸附尿素以外的代谢废物。,例3 固定化酶法生产5复合单核苷酸 5复合单核苷酸可用于治疗白血球下降、血小板减少以及肝功能失调等疾病。核糖核酸经磷酸二脂酶作用，可分解为腺苷、胞苷、尿苷、鸟苷等一磷酸化合物，该磷酸二脂酶存在于桔青霉细胞、谷氨酸发酵菌细胞、麦芽根等生物材料中，本法以麦芽根为材料制备磷酸酶。,工艺路线：1、磷酸二脂酶的制备 取干麦芽根，加9-10倍体积的水，用2摩尔每升的盐酸调酸度至5.2，于30度条件下浸泡15-20小时，然后加压去渣，浸出液过滤，滤液冷却至5度，加入2.5倍体积的5度95%冷工业酒精，5度静置2-3小时后，吸去上层清夜，回收乙醇，下层离心收集沉淀，用少量丙酮以乙醚先后洗涤2-3次，真空干燥，粉碎得到磷酸二脂酶，备用。2、固定化磷酸二脂酶的制备 取上述磷酸二脂酶200克，用1.5%硫酸铵溶液溶解，过滤得到酶液。另取湿ABXE-纤维素40公斤，加入0-5度蒸馏水至80升，搅拌下先后加入1摩尔每升盐酸和5%亚硝酸钠溶液各10升，搅拌均匀，于0-5度下反应，150分，抽滤，滤饼迅速用预冷的0.05摩尔每升盐酸和蒸馏水各洗3次，抽干后，将滤饼投入上述磷酸二脂酶溶液中，搅拌均匀后用1摩尔每升碳酸钠溶液调pH8.0，搅拌反应30分，用冷水洗3-4次，抽干，得到固定化磷酸二脂酶，备用。,3、转化反应 取2公斤核酸，缓慢假如预热至60-70度的360升、pH5.00.001摩尔每升氯化锌溶液中，用摩尔每升氢氧化钠溶液调至pH5.0-5.5，滤除沉淀，将清液升温至70度，加入上述湿的固定化磷酸二脂酶40公斤，于67度维持pH5.0-5.5，搅拌反应1-2小时，根据增色效应，用紫外吸收法判断转化平衡点，转化完成后，滤出转化液，用于分离5单核苷酸，固定化酶再继续用于下一批转化反应,4、5复合单核苷酸的分离纯化 将上述转化液用6摩尔每升的盐酸调酸度至3，滤除沉淀，滤液用6摩尔每升氢氧化钠调酸度至7，进入已处理好的氯-型阴离子交换树脂柱，流速为2-2.5升每分，吸附后，用250-300升去离子水洗涤柱床，然后用3%氯化钠溶液以1-1.2升每分流速洗脱，当流出液pH达到7时开始部分收集，直至洗脱液中不含核苷酸为止，合并含核苷酸钠的洗脱液进行精制。,5、精制及灌封 上述核苷酸钠溶液用薄膜浓缩器浓缩后，测定核苷酸含量，再用无热源水稀释至20毫克每毫升，加入0.5-1.0%药用活性炭，煮沸10分，脱色和除热源，滤除活性炭，滤液经除6号菌漏斗或0.45微米孔径的微孔滤膜过滤除菌后灌封，即为5复合单核苷酸。,3固定化酶在分析化学中应用,酶柱和酶管，可与分光光度计、荧光计或电量计结合，形成酶电极，进行某些物质的自动分析。,固定化酶的应用及其发展前景,1固定化酶在食品工业中的应用 固定化酶在食品工业中主要被应用于制糖、酒类酿造、果汁加工、乳制品生产、茶叶烟叶加工等方面。固定化葡萄糖异构酶是世界上固定化酶应用于工业生产中规模最大的一种,它可以用来催化玉米糖浆和淀粉生产高甜度的高果糖糖浆。,自1972年这项技术产生以来,科学家已经固定了几种芽孢杆菌和链霉菌中提取的葡萄糖异构化酶,并大量应用于工业生产中。从目前的资料分析,不论是在我国还是在国际上,今后几十年中它还将是应用最广、市场份额最大的固定化酶。用淀粉生产高果糖浆包含3步:一是用淀粉酶液化淀粉;二是用糖化酶将其转化为葡萄糖,即糖化;三是用葡萄糖异构酶将葡萄糖异构为果糖。由此可得到含高果糖浆与蔗糖同等甜度时,其价格低10%20%,具有经济推动力。该固定化酶常用的制备技术是热处理法,将含葡萄糖异构酶的放线菌、芽孢杆菌或链霉菌等细胞用6065 热处理15 min,该酶就固定在菌体上制成固定化酶。,在啤酒酿造，果汁加工中，固定化酶都有极好的提高澄清度的作用。如采用吸附交联法,使胰蛋白酶先吸附于磁性胶体粒子表面,后用戊二醛双功能试剂交联,形成“酶网”裹着载体形成固定化酶,该磁性酶对啤酒澄清防止冷浑浊有明显效果。而我们在高中生物实验课上也学习过用固定化果胶酶来提高果汁的出汁率和澄清度。,乳糖酶亦称为-半乳糖苷酶,是工业中应用相当广泛的一种酶,较多地应用于乳制品加工中。实验表明固定化后的乳糖酶生产活性从原来的21%提高至40%，稳定性范围扩大,热稳定性提高,同时底物乳糖在凝胶中扩散不影响固定酶的反应速度。使用该固定化酶处理脱脂牛奶,可以在保持原有风味的条件下,增加甜度,饮用时可减少蔗糖用量。现在，多把固定化黑曲霉乳糖酶装成酶柱，让牛奶以一定的流速通过酶柱，以此生产脱乳糖的牛奶。,在茶叶中含有种类繁多的酶,如多酚氧化酶、过氧化酶、单宁酶、果胶酶等,其对茶叶的加工或深加工有重要的意义。对重要酶类的固定化研究,可有效地改善茶叶的品质、拓展茶叶深加工的领域和应用范围。而烟叶即使在处理后还是会有较高含量的淀粉残留，这会影响烟质，为此需要加酶来加速淀粉水解。同时,对固定化酶乳状液添加剂与水溶液酶添加剂降低低档次烟叶中淀粉的质量分数进行了研究,结果表明,固定化酶处理烟叶淀粉降解率为25%30%,优于水溶液酶的25%,特别在抽吸品质方面,前者处理明显优于后者处理。,2固定化酶在医疗保健中的应用 固定化酶在医疗保健应用可以分为治疗和诊断两部分。治疗的部分主要应用到的是生化制药，这其中最早生产的是氨基酸，之后还有抗生素、核酸、蛋白质抗体、高纯度的蛋白酶等。1973年在英国，首先应用固定化的青霉素酰化酶或称青霉素酰胺酶从青霉素G或青霉素v生产e一氨基青霉烷酸(6一APA)。现在全世界每年大约生产7500吨6-APA，主要是用固定化青霉素酰化酶使天然青霉素脱酰化。因其稳定性极高，反复使用次数可达上千次。而工业化出产L一天冬氨酸和L-苹果酸都用固定化酶从延胡索酸(反丁烯二酸)得到的。,而酶法诊断早因其灵敏、准确、快速、简便等优点被广泛应用。这其中有将酶固定在尼龙管内壁上，制成酶管，或者将固定化酶装填在柱内，制成酶柱。然后，将酶管或酶柱与测试仪器组合在一起，可以对样品中的目物质含量进行自动分析。也有将酶固定在薄膜（如醋酸纤维素薄膜）上，制成酶膜，然后将酶膜与离子选择性电极相结合，便制成了酶电极。例如：葡萄糖氧化酶电极测定血液、尿液中葡萄糖含量；脲酶电极测定血液、尿液中尿素含量；乳酸脱氢酶电极测定血液中乳酸含量。这些其实也可以叫做生物传感器,3固定化酶环境保护中的应用应用固定化酶可以净化污水。生活污水和工业废水中有害成分主要是氯酚,将过氧化物酶大量吸附在磁石上,可以保证其100%的活力,并且比粗酶有了20倍以上的净化效果。因为可以对水中的氯酚选择性吸附,所以该固定化酶对水中的氯酚基本上可以100%清除。,为了研究固定化酶在高浓度有机废水处理中的应用，有人做过如下实验：选用硅胶、活性炭、大孔树脂三种载体，在一定条件下用物理吸附法固定蛋白酶，三种载体固定的蛋白酶对含高浓度蛋白质的淀粉黄浆废水进行水解实验，确定水解最佳的pH值范围，并在此条件下研究三种不同载体上固定化酶的活性及其水解规律。结果表明：大孔树脂对蛋白酶的固定效果良好，并对含高浓度蛋白质的废水处理效果最好，其最佳反应pH值为55，反应进行05 h时酶的催化效果最好，氨基酸产生速度达到3082 mgmin，且在3h后该速度仅减少374 mgmin；6 h时对蛋白质的去除率达到 3993。同时酶电极也可以用于环境检测。目前，在监测水和空气中的有机磷农药浓度方面，乙酰胆碱酯酶电极已应用成功，其灵敏度可达0.1l/L。用活性污泥处理水，测定活性污泥中脱氢酶的活性，可以测出水中CN浓度。因为脱氢酶活性随CN增加而下降。,4固定化酶在能源开发中的应用纤维素本身并不能提供能量，但在其经过冷冻粉碎之后，利用固定化纤维素酶能够将其连续水解成葡萄糖。然后，用纤维素水解液为原料，通过固定化酵母的发酵作用，可连续产生乙醇。氢气作为安全清洁高效的新能源，怎样制备却是其无法得到广泛应用的重要因素之一。有些微生物或蓝藻含有氢化酶系，能产生氢。但氢化酶系极易失活，而将菌体固定化之后，可以提高氢化酶系稳定性。这也许可以为氢气制备提供一条新的途径。,