生化工程-4代谢与培养基.ppt

,单细胞微生物，体积有限，要维持全面的功能，要面对复杂的外部环境，运作不同的代谢途径，处理不同的底物，需要其代谢调节具有极大的灵活性和应变能力。,操纵子学说：基因表达和控制的一个完整单元，其中包括结构基因，调节基因，操作基因和启动基因。,是不是只要培养环境中有乳糖，就可以打开打通乳糖操纵子，合成出相关酶类？如果体系中除了乳糖，还有葡萄糖，微生物如何选择？如何运作？为什么呢？这种选择对于发酵工业意味着什么?,诱导型操纵子：效应物存在导致基因表达。阻遏型操纵子：效应物存在导致基因表达的关闭。,代谢的分类,分解代谢（异化作用）合成代谢（同化作用）,初级代谢和次级代谢 初级代谢：与生物生存有关的，涉及能量产生和能量消耗的代谢类型。产物都是有机体生存必不可少的物质，如单糖、核苷酸、脂肪酸，以及蛋白质、核酸、多糖、脂类等。次级代谢：是指微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该微生物本身无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。但有利于生存的代谢类型，通常是在生长后期产生。产物种类很多，最著名的是抗生素。,次级代谢产物的类型,1，根据产物合成途径区分 根据产物合成途径可以分为五种类型：（1）与糖代谢有关的类型（2）与脂肪酸代谢有关的类型（3）与萜烯和甾体化合物有关的类型（4）与TCA环有关的类型（5）与氨基酸代谢有关的类型,2，根据产物的作用区分类型 抗生素、激素、生物碱、毒素、色素及维生素等类型。,次级代谢与初级代谢的关系 1.从代谢方面分析：许多次级代谢产物的基本结构是由少数几种初级代谢产物构成的，所以次级产物是以初级产物为母体衍生出来的，次级代谢途径并不是独立的，而是与初级代谢途径有密切联系的。某些糖代谢的中间体，即可以来合成初级代谢产物，又可以来合成次级代谢产物，这种中间体叫分叉中间体，如丙二酰Co。G 乙酰 Co 丙二酰 CoA 脂肪酸（初级）四环素或其他抗生素（次级）,初级代谢和次级代谢的分叉中间体,分叉中间体初级终点产物次级终点产物氨基己二糖 赖氨酸 青霉素,头孢酶素丙二酰Co脂肪酸 四环素族,利福霉素族乙酰Co 大环内酯族,多烯族抗生素莽草酸 对氨基苯丙氨酸氯霉素,绿脓菌素苯丙氨酸,酪氨酸新生霉素,由初级代谢产物衍生的次级代谢产物的途径有七种：葡萄糖碳架掺入途径、莽草酸途径、与核苷有关的途径、聚酮糖途径、由氨基酸衍生的途径、甲羟戊酸途径、其它复合途径。,2.从遗传方面分析：初级产物和次级产物同样都受到核内DNA的调节控制的。所不同的是次级代谢产物还受到“与初级代谢产物合成无关的遗传物质”的控制，即受核内遗传物质（染色体遗传物质）和核外遗传物质（质粒）的控制。有一部分代谢产物的形成，取决于由质粒信息产生的酶所控制的代谢途径，这类物质称为质粒产物。当然也有只由染色体DNA控制的抗生素。因此，两者在遗传上既有相同的部分，又有不同的部分。,初级代谢可以为次级代谢产物合成提供前体物和为次级代谢产物合成提供所需要的能量，而次级代谢则是初级代谢在特定条件下的继续和发展。,次级代谢物的生物合成,1.养分的摄入2.通过中枢代谢途径转化为中间体3.前体的合成与修饰4.前体进入次级代谢产物合成途径，并最终形成产物,前体的来源：前体大多数源自初级代谢途径的产物或中间体，所以，中间体的走向是前体合成的关键。,次级代谢的特点1，次级代谢以初级代谢产物为前体，并受初级代谢的调节,当初级代谢和次级代谢具有共同的合成途径时，初级代谢的终产物过量，往往会抑制次级代谢的合成，这是因为这些终产物抑制了在次级代谢产物合成中重要的分叉中间体的合成。如赖氨酸和青霉素的生物合成过程中有共同中间体-氨基己二酸，当培养液中赖氨酸过量时，则抑制-氨基己二酸的合成，进而影响到青霉素的合成。,2，次级代谢产物一般在菌体生长后期合成 次级代谢产物发酵经历两个阶段，即营养增殖期和产物形成期。如在菌体活跃增殖阶段几乎不产生抗生素。待到细胞停止生长，进入到恒定期才开始活跃地合成抗生素，成为生产期。,3、生产能力受微量金属离子（Fe2+、Fe3+、Mn2+、Co2+、Zn2+）和 磷酸盐等无机离子的影响。4、次级代谢酶的底物特异性较广。可同时产生结构上类似的多种副组分。若提供底物结构类似物，则可得到与天然物不同的次级代谢物。,微生物次级代谢的调节,碳代谢物的调节,一般情况下，凡是能被微生物快速利用、促进产生菌快速生长的碳源，对次级代谢产物的生物合成都表现出抑制作用。这种阻遏作用是由于菌体在生长阶段，速效碳源（如葡萄糖和柠檬酸等）的分解产物阻遏了次级代谢过程中酶系的合成，只有当这类碳源耗尽时，才能解除其对参与次级代谢的酶的阻遏，菌体才能转入次级代谢产物的合成阶段。,氮代谢物的调节,许多次级代谢产物的生物合成同样受到氮分解产物的影响。对不同氮源的研究发现，黄豆饼粉等利用较慢的氮源，可以防止和减弱氮代谢物的阻遏作用，有利于次级代谢产物的合成；而以无机氮或简单的有机氮等容易利用的氮作为氮源（铵盐、硝酸盐、某些氨基酸）时，能促进菌体的生长，却不利于次级代谢产物的合成。例如，易利用的铵盐有利于灰色链霉菌迅速生长，但对链霉素合成则是最差的氮源。,磷酸盐的调节,磷酸盐是菌体生长的主要限制性营养成分，还是调节次级代谢产物生物合成的重要因素。过量的磷酸盐也象葡萄糖一样抑制次级代谢产物的合成，这种抑制作用被称为磷酸盐调节。,磷酸盐浓度的高低还能调节次级代谢产物合成期出现的早晚，当磷酸盐接近耗尽时，才开始进入次级代谢产物的合成期。磷酸盐起始浓度高，耗尽时间长，合成期就向后拖延。磷酸盐还能使处于非生长状态的、产抗生素的菌体逆转成生长状态的、不产抗生素的菌体。,细胞膜通透性调节,菌体吸收外界营养物质或分泌细胞内的代谢物都必须经过细胞质膜的运输。如果细胞对某种物质不能运输，或是运输功能发生了障碍，将导致细胞内合成代谢的产物不能分泌出去，影响发酵产物的生成和收获；或者是细胞外的营养物质不能进入菌体或进入很少，从而影响产生菌的生长和产物的合成，造成产量下降。,金属离子和溶解氧的调节,在多数情况下，微量的金属离子是参与次级代谢产物合成酶的活化因子，甚至有时在转录和转译水平上起作用。如，Mg 2+可增加卡那霉素合成中的卡那霉素乙酰化酶、乙酰卡那霉素胺基化酶和弗氏链霉菌的碱性磷酸酶的活力，促进这些酶的合成。,思考题为什么次级代谢相关合成酶多是诱导酶？为什么初级代谢产物合成的酶专一性强，催化次级代谢产物合成的酶专一性不强？,培养基,培养基是人工配制的供微生物或动植物细胞生长繁殖和合成各种代谢产物所需要的、一定比例的多种营养物质的混合物，同时培养基也为微生物等提供除营养外的其他生长所必须的环境条件。发酵培养基必须提供微生物生长繁殖和产物合成所需的碳源、氮源、无机元素、生长因子、水和氧气等。大规模发酵生产中还必须重视培养基原料的价格和来源。,工业微生物发酵培养基应具有的特点,1、单位培养基能产生尽量多的产物2、目的产物的合成速度尽量快3、副产物尽量少4、质量稳定，价格低廉，易于长期获得5、尽量不影响发酵过程中的操作和产物的后处理等,一、培养基的类型和用途,根据来源分：根据 状态分：根据生产工业的要求分：,培养基成分,碳源：培养基的主要成分之一，为微生物提供生长繁殖所需的能源，及合成菌体和目的产物的原料。1）碳水化合物：葡萄糖，乳糖，淀粉，糖蜜，糊精，玉米粉等。2）脂肪：比糖类释放更多能量，需要更多溶解氧。3）有机酸，烃和醇类等石油化工产品。,糖蜜：制糖工业的副产品，是一种粘稠、黑褐色、呈半流动的液体，组成因制糖原料、加工条件的不同而有差异，其中主要含有大量可发酵糖(主要是蔗糖)，是很好的发酵原料。,发酵培养基所用的碳源很多都是粮食和油料原料，所以节约用粮是发酵生产的重要环节，所以一方面要促进发酵的高产和转化率，一方面要从原料的节约和代用上着手，如改善培养基配比，开拓新的培养基资源，使用废弃资源代替粮食等。,发酵碳源原料的前处理,淀粉的前处理：淀粉多数情况下不能作为培养基直接利用，需将其水解为葡萄糖才能使用。制备方法：1.酸解法 2.酶解法 3.酸酶结合法,糖蜜的前处理：糖蜜的浓度很大，杂质较多，发酵前需进行预处理，包括稀释、通风、酸化、澄清、灭菌等过程。,培养基成分,氮源：构成菌体组分和含氮代谢物1）有机氮源：黄豆饼粉，玉米浆，花生饼粉，蛋白胨，酵母膏，鱼粉等。有机氮源除了作为菌体生长繁殖的营养外，有的还是产物的前体，如缬氨酸可作为红霉素的前体。尿素也是常用的有机氮源，但成分单一，不具有其他有机氮源的特点。,2）无机氮源：铵盐，硝酸盐和氨水等，微生物对无机氮源的利用非常快，所以也称为速效氮源，会导致分解代谢物阻遏。氨水是抗生素生产中常用的无机氮源，如合成1mol链霉素需要7mol的NH3，使用氨水要注意除菌。,生理酸性物质和生理碱性物质 硫酸铵：(NH4)2SO4 硝酸钠：NaNO3 可用于补充氮源并调节pH值。,无机盐及微量元素,无机盐是微生物活动不可缺少的物质。其主要功能是构成菌体成分、作为酶的组成部分、酶的激活剂或抑制剂、调节培养渗透压、调节pH值等。微生物对无机盐的需要量很少，但无机盐含量对菌体生长和产物的生成影响很大。,磷酸盐：磷是某些蛋白质和核酸的组成成分。有利于糖代谢，可以促进菌体生长，但过量时会抑制产物合成。磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用。工业上常用K3PO43H2O、K3PO4和Na2HPO412H2O、NaH2PO42H2O等磷酸盐。,镁：处于离子状态时，是许多重要的酶（己糖磷酸化酶，柠檬酸脱氢酶、羧化酶等）的激活剂；影响基质的氧化，蛋白质的合成，能提高一些氨基糖苷类抗生素产生菌对自身产生的抗生素的耐受能力，如卡那霉素、链霉素等。硫：对于蛋白质的活性和构成有重要作用。,钠、钾、钙等与细胞渗透压和通透性有关，是许多酶的激活剂，促进糖代谢。铁：菌体有氧氧化的必须元素，铁制发酵罐可以提供。但青霉素产生菌对铁敏感，所以需对发酵罐预处理。Zn、Co、Mn、Cu等元素大部分作为酶的辅基和激活剂；一般作为碳、氮源的农副产品天然原料中，本身就含有某些微量元素，不必另加。,生长因子,从广义来说，凡是微生物不可缺少的微量有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称为生长因子。其功能是构成细胞的组成分，促进生命活动的进行。生长因子不是所有微生物都必需的，它只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物。有机氮源是生长因子的重要来源，如玉米浆中含有丰富的氨基酸，微量元素和生长素，是多数发酵产品的良好氮源,前体,前体是指能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去的物质，其自身的结构并无太大变化，但产物的合成却能有较大提升，如玉米浆中的苯乙胺，能大幅提升青霉素G的产量，而加入苯氧乙酸作为前体则可以增加青霉素V的产量。很多前体对微生物的生长是有毒性的，所以添加的过程应少量多次添加。,诱导剂，刺激剂，促进剂和抑制剂,指一些并非菌体必须的，但能显著改变产物产量的物质，其机理是多种多样的,表面活性剂洗净剂（脂肪酰胺磺酸钠）、吐温80、植酸等二乙胺四乙酸大豆油抽提物黄血盐甲醇,起生长因素的作用；可推迟菌体的自溶；抑制某些合成其他产物的途径而使之向所需产物的途径转化；降低了生产菌的呼吸，使之有利于产物的合成；改变发酵液的物理性质，改善通气效果；可与抗生素形成复盐，降低发酵液中抗生素的浓度和促进抗生素的合成等。,水,水是培养基主要成分，也是生物体的主要成分，水是简单的，但也是十分重要的。,培养基的配制原则,根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基，注意菌种的同化能力注意速效碳（氮）源和缓效碳（氮）源的配合使用，发挥各自的优势营养成分的恰当配比（C/N一般取100:0.22.0）,4.渗透压，营养物质要有合适的浓度5.合适的pH值（注意生理酸性盐、生理碱性盐和缓冲剂的加入）6.考虑营养成分的加入顺序，避免生产沉淀7.原材料的来源，价格和稳定性等,菌种的需求和同化能力 微生物的代谢过程是在细胞能进行，一般只有小分子能顺利进入细胞内，所以小分子的营养物质往往能被高效快速的利用。同时还应注意速效营养物质所引发的分解代谢物阻遏现象，即葡萄糖效应,合适的碳氮比,氮源过多，菌体繁殖旺盛，不利于代谢产物的积累；氮源不足，菌体繁殖量少，影响产量。碳源过多，容易形成较低的pH值；碳源不足，菌体衰老和自溶。C/N不当影响菌体按比例吸收营养物质，直接影响菌体生长和产物形成。,培养基的优化,理论转化率：加入的培养物质完全转化为产物时的转化率，事实上是做不到的.,培养基试验设计,参照前人所使用的较适合于某一类菌种培养基的经验配方结合所用菌种和产品的特性采用摇瓶、玻璃瓶等小型发酵设备，对碳、氮、无机盐和前体等进行逐个单因子试验观察这些因子对菌体生长和产物合成量的影响综合考虑各因素的影响得到一个适合该菌种的培养基配方以得到高产,单因素实验,正交试验设计,对于单因素或两因素试验，因其因素少，试验的设计、实施与分析都比较简单。但在实际工作中，常常需要同时考察 3个或3个以上的试验因素，若进行全面试验，则试验的规模将很大，往往因试验条件的限制而难于实施。正交试验设计就是安排多因素试验、寻求最优水平组合的一种高效率试验设计方法。,全面试验方案,表10-1,3 因 素 3 水 平 的 全 面试验水平组合数为33=27，4 因素3水平的全面试验水平组合数为34=81，5因素3水平的全面试验水平组合数为35=243，这在科学试验中是很难做到的。,正交试验设计的基本特点是：用部分试验来代替全面试验，通过对部分试验结果的分析，了解全面试验的情况。正因为正交试验是用部分试验来代替全面试验的，它不可能像全面试验那样对各因素效应、交互作用一一分析；当交互作用存在时，有可能出现交互作用的混杂。虽然正交试验设计有上述不足，但它能通过部分试验找到最优水平组合，因 而 很 受实际工作者青睐。,正交试验设计：体系中每个因素的每个条件与其他因素的每个条件均结合衡量一次，正交表安排的试验，具有均衡分散和整齐可比的特点。所谓均衡分散，是指用正交表挑选出来的各因素水平组合在全部水平组合中的分布是均匀的。,整齐可比是指每一个因素的各水平间具有可比性。因为正交表中每一因素的任一水平下都均衡地包含着另外因素的各个水平，当比较某因素不同水平时，其它 因素的效应都彼此抵消。,在这9个水平组合中，A因素各水平下包括了B、C因素的3个水平，虽然搭配方式不同，但B、C皆处于同等地位，当比较A因素不同水平时，B因素不同水平的效应相互抵消，C因素不同水平的效应也相互抵消。所以A因素3个水平间具有综合可比性。同样，B、C因素3个水平间亦具有综合可比性。,试验结果分析,分清各因素及其交互作用的主次顺序，分清哪个是主要因素，哪个是次要因素；判断因素对试验指标影响的显著程度；找出试验因素的最优水平和试验范围内的最优组合，即试验因素各取什么水平时，试验指标最好；分析因素与试验指标之间的关系，即当因素变化时，试验指标是如何变化的。找出指标随因素变化的规律和趋势，为进一步试验指明方向；了解各因素之间的交互作用情况；,微生物培养基的作用和地位,根据实际试验生产的要求，培养基在不同的阶段有不同的侧重点。在菌体生长时期，要保证菌株能充分生长，而在产物合成阶段，培养基成分要宜于产物的形成，二者是有区别的。,培养基的影响因素,原材料的品质，来源和预处理培养基的设计与放大培养基的灭菌,