核酸提取技术(CDC培训).ppt

核 酸 提 取 技 术,四川大学华西公共卫生学院王国庆,前 言,核酸是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。在生物的生长、发育和繁殖等生命活动中起着十分重要的作用。,因此无论是进行核酸结构与功能的研究，还是进行基因工程、蛋白质工程，首先需要对核酸进行分离和纯化，核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。,DNA和RNA都是极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。,真核生物中，DNA主要存在于细胞核的染色体中，RNA则主要存在于细胞质中；原核生物中，DNA主要存在于核质区，RNA则主要存在于细胞质中；而非细胞形式存在的病毒和噬菌体，往往只含DAN或只含RNA。,主要内容,核酸提取的目的意义核酸提取的一般程序微生物核酸提取的方法原理核酸提取质量的鉴定核酸提取的注意事项,核酸提取的意义,从生物材料中分离制备核酸，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，揭示生命现象的本质有重大意义。,医学检验需要：是分析标本中包含的分子信息的前提条件，对于精确诊断疾病具有重要意义。,基因工程的需要：基因工程疫苗和药物。,核酸提取的一般程序,核酸的提取一般分为两个阶段：,分离纯化：使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离。,裂解细胞：使样品中的核酸游离在裂解体系中。,细胞的裂解,分离提取核酸，首先要求核酸从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢生物活性。因此应选择适当的方法将组织和细胞破碎。但若材料是体液（如血）或生物体分泌到体外的分泌物，则不必进行组织细胞的破碎,一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。,细胞的裂解方法：,细菌有坚硬的细胞壁，裂解细胞有三种方法：,机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；,化学试剂法：用SDS处理细胞；,酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，可使细胞壁破碎。,细胞裂解后，核酸与大量杂质在一起，必须进行分离纯化。,关键：蛋白质的去除,核酸的分离纯化,蛋白质的去除可以选择酶法、去污剂法或有机溶剂法或联合运用上述方法。,微生物核酸提取的方法原理,1.阴离子表面活性剂法,原理：利用SDS等阴离子表面活性剂与蛋白质带正电荷的侧链结合，从而使核酸与蛋白质分开。然后加入浓醋酸钾溶液，使SDS-蛋白质复合物沉淀，并使多余的SDS转化为溶解度小的钾盐而同时沉淀,微生物核酸提取的方法原理,2.有机溶剂法,原理：利用酚、氯仿的混合液与含核酸和蛋白质的水溶液一起振摇时形成乳状液，蛋白质因充分接触酚和氯仿而变性，与核酸分开。离心后可分为两相，一般上层为含核酸的水相，下层为有机相，交界处是变性凝聚的蛋白质层。,原理：利用蛋白酶消化降解蛋白质，达到去除蛋白质的目的。,微生物核酸提取的方法原理,3.酶法,核酸提取质量的鉴定,纯度,浓度,完整性,1.9，RNA污染1.6，蛋白、酚污染,DNA,核酸提取质量的鉴定,纯度,浓度,完整性,2.0，异硫氰酸残留1.7，蛋白、酚污染,RNA,核酸提取的注意事项,为了确保核酸的完整性，实验应注意：,温度不宜过高；控制一定的pH值范围（pH59），过酸或过碱均能破坏核酸链中磷酸二酯键；保持一定的离子强度，有助于维持核酸的空间构型；减少物理因素对核酸的降解机械剪切力，如强力高速振荡、搅拌、样品反复冻贮等。,DNA提取的方法,基因组DNA的提取,CTAB法SDS法其它,非基因组DNA的提取质粒DNA,碱裂解法 煮沸法,基因组DNA CTAB法,原理,CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。,原理,基因组DNASDS法,SDS在高温（5565）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。,SDS法流程图,基因组DNASDS法,基因组DNA其它方法,物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式：酶法,根据细胞裂解方式的不同有：,基因组DNA其它方法,吸附材料结合法：,根据核酸分离纯化方式的不同有：,硅质材料,高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。,低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。,阴离子交 换树脂,基因组DNA其它方法,浓盐法：有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：,利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离,有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用,利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物,质粒DNA碱裂解法,原理,在pH 12.012.6环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。将pH调至中性并在高盐浓度的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。,质粒DNA碱裂解法流程,对数期菌体,溶液III中和,溶液I充分重悬,溶液II裂解,上清液,抽提,离心洗涤,酒精沉淀,干燥溶解,沉淀,质粒DNA溶液,质粒DNA煮沸法,煮沸法原理,染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,DNA提取的基本步骤,I.材料准备II.破碎细胞或包膜内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中,材料准备,最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）,细胞裂解,材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻珠高温温浴时，定时轻柔振荡,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,菌体量适当培养基去除干净，同时保证菌体充分悬浮变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染G菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁,核酸分离、纯化,采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,核酸分离、纯化,蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤蛋白酶处理,多糖的去除：,核酸分离、纯化,高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加1/2体积的氯苯（与多糖的羟基作用去除多糖）。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入200l 20%PEG8000(含1.2 M NaCl)，冰浴20min。,多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合,核酸分离、纯化,盐离子的去除：70的乙醇洗涤,核酸沉淀、溶解,当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,含有蛋白、多糖、多酚类杂质有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应有金属离子残留,重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质重新沉淀DNA，让酒精充分挥发增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）,DNA提取常见问题,问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。,原因,对策,材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染反复冻融,尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融,DNA提取常见问题,问题二：DNA降解。,对策,原因,实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗涤时DNA丢失,尽量选用新鲜的材料G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁高温裂解时，时间适当延长（细菌可增加PK的用量）延长低温沉淀时间加辅助物，促进沉淀洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒,DNA提取常见问题,问题三：DNA提取量少,对策,原因,RNA提取的通用方法,异硫氰酸胍/苯酚法,原理：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放的DNA和RNA在特定pH下分别位于体系的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。,步骤:,材料准备：尽量新鲜。裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。洗涤：70乙醇。沉淀：异丙醇、无水乙醇。乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。,影响RNA提取的因素,材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于-70或-20保存如要多次提取，请分成多份保存液氮长期保存，-70短期保存,影响RNA提取的因素,样品破碎及裂解：,根据不同材料选择不同的处理方法：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻样品量适当，保证充分裂解为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量,纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成 RNA 降解；柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。,影响RNA提取的因素,RNA提取常见问题,RNA 的降解 OD260/OD280 比值偏低 电泳带型异常 下游实验效果不佳,RNA降解,新鲜细胞或组织：,裂解液的质量、用量不足外源RNase的污染另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等)，很难避免 RNA 的降解。,建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。,RNA降解,样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70冰箱保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。,冷冻样品：,OD260/OD280 比值偏低,蛋白质污染：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚残留：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。,抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75%乙醇。解决办法:再沉淀一次后，溶解。设备限制：测定OD260 及OD280 数值时，要使OD260 读数在 0.10 0.50 之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测 OD 时，对照及样品稀释液请使用 10 mM Tris，pH 7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。,OD260/OD280 比值偏低,电泳带型异常,非变性电泳：上样量超过 3ug，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致条带分不开。变性电泳条带变淡：EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；甲醛的质量不高。,下游实验效果不佳,RNA 降解 抽提试剂的残留 75%乙醇洗涤 样品中杂质的残留 多糖等杂质，再次沉淀 DNA 污染 使用RNase-Free 的 DNase I 消化抽提RNA,