基因工程药物蛋白的分离纯化与质量控制.ppt

重组基因工程药物的分离纯化及质量控制,基因工程药物制造的一般流程：（1）获得目的基因；（2）组建重组质粒；（3）构建基因工程菌；（4）培养工程菌；（5）产物分离纯化；（6）除菌过滤；（7）半成品检定；（8）包装,基因工程药物特点:(1)目的产物在初始原料中的含量较低;(2)含目的产物的初始物料组成复杂,除了目的产物外,还有大量的细胞、代谢、残留培养基、无机盐等，特 别是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大；,(3)目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对 pH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表 面张力等十分敏感，容易是其失活、变性；种类繁多，包括大、中、小分子、结构简单或 复杂的有机化合物，以及结构复杂又性质各异 的生物活性物质；应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求 无菌、无热源。,目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定。,产 物 特 性 作 用,等电点 决定离子交换种类及条件相对分子量 选择不同孔径的介质疏水性 与疏水、反相介质结合的程度生物特异性 决定亲和配基溶解性 决定分离体系及蛋白浓度稳定性 决定工艺采用温度及流程时间,建立分离纯化工艺的根据,建立分离纯化工艺的根据 1、含目的产物的起始物料的特点 利用基因工程菌进行发酵生产的产物，其上游过程中的各种因素均对分离纯化技术和工艺有直接影响。（1）菌种类型及其代谢特性：包括菌种的生物学性质，产物和副产物种类、产物在细胞内所处的位置，表达方式（胞内、胞外、包含体），代谢物种类、产物类似物、毒素和能降解产物的酶类等；（2）原材料和培养基的来源及其质量；,（3）生产工艺和条件：包括灭菌方式和条件，生产方式（连续、批式、半连续），生产周期，生产能力，工 艺控制条件因素几方式等；（4）初始物料的物理、化学和生物学特性：包括产物浓 度、主要杂质种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解 度、pH、黏度、流体力学性质和热力学性质。2、物料中杂质的种类和性质 物料中杂质的含量、性质、结构、相对分子质量、电荷性质及数量、生物学特性、稳定性、溶解度、分配系数、挥发性、吸附性能等。,3、目的产物特性 产物的化学、物理和生物学特性，包括化学组成、相对分子质量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性、疏水性、扩散性、扩散系数、分配系数、吸附性能、生物学活性、亲和性、配基种类、表面活性等。4、产品质量的要求 产品质量标准和用途对产品纯度、生物活性、比活的要求。包括允许的杂质种类和最大允许含量，特殊杂质的种类和最大允许量，以及杂质对使用的影响，产品剂型、贮存稳定性等。,特别注意3类可能存在的非蛋白质类杂质：（1）DNA的去除：在利用离子交换时，控制样液的pH值，使DNA不被吸附，而蛋白质可以被吸附；或利用亲和层析；,（2）病毒的去除：成品中必须检查是否含有病毒。病毒最大的来源是由宿主细胞带入。经过色谱分离，一般能将病毒除去，必要时也可以用紫外线照射使病毒失活，或用过滤法将病毒去除。,（2）热原的去除：热原主要是肠科杆菌科所产生的细胞内毒素，在细菌生长或细胞溶解时会释放出来，主要是细胞壁成份脂多糖，其性质相当稳定，即使经高压灭菌也不失活。注射用药必须无热原。从蛋白质溶液中除去内毒素比较困难，最好的办法是防止产生热原，整个生产过程要在无菌条件下进行，所有层析介质在使用前都要先除去热原，在28下进行操作。洗脱液需先经过无菌处理，流出的蛋白质溶液也应无菌处理，即经过0.2m滤膜过滤。脂多糖带负电，可以用阴离子交换层析法去除；是疏水的，也可以用疏水层析法。,基因工程药物分离纯化的一般流程,发酵液,细胞分离,胞内产物,胞外产物,细胞破碎,固液分离,包涵体,细胞碎片分离,变 性,复 性,浓 缩,初步分离,高度纯化,制 剂,产 品,A 重组基因工程药物分离纯化方法选择的基因原则,针对不同的产物表达形式采取不同的策略,针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型,多种分离纯化技术的联合运用,合适分离纯化介质的选择,分离纯化过程的规模化,针对不同的产物表达形式采取不同的策略,采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；,采用融合型战略表达重组蛋白，拟首先选用亲和层析进行纯化表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。,针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型,等电点处于极端区域（pI5 或 pI8）的重组蛋白应首选离子交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；,重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是亲合层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应合适的范围内（10-8-10-4 mol/L）；,径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的一种复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性。,疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的；凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；,多种分离纯化技术的联合运用,在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种技术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：,应选择不同分离纯化机理的方法联合使用,应首先选择能除去含量最多杂质的方法,应尽量选择高效的分离方法,应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段,合适分离纯化介质的选择,常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Sepharose。理想的分离纯化介质应具有下列性质：,对目标蛋白具有较高的分离效率,对目标蛋白不会造成变性,化学性能和机械性能稳定，重复性好,价格低廉,分离纯化过程的规模化,蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程未必合适，如：,实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）,实验室方法在大规模生产中可能成本过高(超速离心）,因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。,分离纯化技术要求：（1）技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性；（2）选择性要好，能从复杂的混合物中有效的地将目的产物分离出来，达到较高纯化倍数；（3）收率要高；（4）两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整，这样可减少工艺步骤；（5）整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。,一是破碎抽提，即把蛋白从材料转入溶剂中制成蛋白质溶液；二是纯化，即把杂质从蛋白质溶液中除掉或从蛋白质溶液中把蛋白质分离出来；三是制剂，即将蛋白质制成各种剂型。根据蛋白本身的特性，在分离纯化工作中必须注意下列问题:(1)要注意防止蛋白的变性失活.(2)蛋白的分离纯化的目的是将目标蛋白以外的所有杂质尽可能的除去，因此，在不破坏所需蛋白的条件下，可使用各种“激烈”的手段。,重组蛋白的分离提纯包括三个基本环节：,蛋白的纯化过程，约可分为三个阶段：(1)粗蛋白质(crude protein):采样 均质打破细胞 抽出全蛋白.(2)部分纯化(partially purified):初步的纯化，使用各钟 柱层析法。(3)均质蛋白(homogeneous):目标蛋白的进一步精制纯化，可用制备式电泳 或 HPLC。,蛋白分离纯化不同阶段,细胞结构与蛋白分布,细胞壁的组成和破碎阻力,细胞壁的组成和破碎阻力,细菌：肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力来自于肽聚糖的网状结构。酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质，主要阻力来自于壁结构交换的紧密程度和厚度。真菌：多糖，蛋白质，脂类，葡聚糖，几丁质，主要阻力来自于壁强度和聚合物网状结构。,1 细胞破碎许多蛋白存在于细胞内。为了提取这些胞内蛋白，首先需要对细胞进行破碎处理。1）机械破碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎,JY92-II D超声波细胞粉碎机,细胞破碎珠,高压细胞破碎机,DY89-I型 电动玻璃匀浆机,机械破碎,捣碎法研磨法匀浆法,物理破碎,温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法,化学破碎,有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween,酶促破碎,自溶法外加酶制剂法,通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。,通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。,通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎,通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎,细胞破碎方法及其原理,细胞破碎机理图,常用细胞破碎技术和设备,机械法：研磨，匀浆器，组织捣碎法，压榨器物理处理法：超声波化学法：酶解法：,机械法 机械法主要是利用高压、研磨或超声波等手段在细胞壁上产生的剪切力达到破碎目的.包括珠磨法,高压匀浆法和超声破碎法,WSK卧式高效全能珠磨机,高速珠磨机(high spced bead mill)研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。在工业规模的破碎中常采用高速珠磨机,砂磨机,高速珠磨机,高压匀浆器影响匀浆破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆器阀的次数。高压匀浆法的适用范围较广，在微生物细胞和植物细胞的大规模处理中常采用.,高压匀浆器,高压匀浆法适用的范围,大规模细胞破碎的常用方法高压匀浆法适用的范围：酵母和大多数细菌细胞的破碎；料液细胞浓度可以很高，20%左右。不宜使用高压匀浆法。易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌，含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）,撞击破碎器,超声波破碎器超声波处理细胞悬浮液时，破碎作用受许多因素的影响，通常声强和振幅影响很大，但强度太高易使蛋白质变性，频率的变化影响不明显：此外介质的离子强度、pH值、菌体的种类和浓度也有很大的影响.超声波振荡过程中遇到的最大问题就是产生的热量不容易驱散，所以影响了它在大规模工业上的应用，但在实验室和小规模生产中是一种很好的方法,JY92-II D超声波细胞粉碎机,酶解法 是利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破碎目的。酶解法可以在细胞悬浮液中加入特定的酶，也可以采用自溶作用。酶解法的优点是发生酶解的条件温和、能选择性地释放产物、胞内核酸等泄出量少、细胞外形较完整、便于后步分离等；但酶水解价格高，故小规模应用较广.,1）外加酶法,外加酶法,酶解法的特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。溶菌酶（lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂EDTA一起使用。放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶，酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。,外加酶法,有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。,酶解法的特点,优点：发生酶解的条件温和能选择性地释放产物胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整,缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶)产物抑制的存在。,酶解-自溶作用,自溶作用是酶解的另一种方法，利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。自溶作用：改变其生长环境（温度、缓冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。,渗透压冲击法冻融法化学法:采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂。,某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。,化学渗透法（Chemical permeation）,该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。,酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。成本低，反应激烈，不具选择性。,（1）酸、碱处理法,细胞破碎常用的表面活性剂：十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）；。非离子型如Triton X-100和吐温（Tween）等对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。,（2）表面活性剂,无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用，能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解,2 浓缩 提取液或发酵液的蛋白浓度一 般很低，如发酵液中蛋白浓度一般为0.1一1.因此，在分离纯化过程中，蛋白溶液往往需要浓缩。浓缩的方法很多，如：盐析或溶剂沉淀法、超过滤法、离子交换树脂法等。这些方法既是浓缩的方法，又是分离纯化的手段(我们将在下节中介绍)再如真空浓缩、冷冻浓缩法、蒸发法、凝胶吸水法、聚乙二醇吸水法等。,2.1冷冻干燥法 将蛋白溶液冻成固体后抽真空，使水分子直接从表面升华，最后蛋白呈干粉状。采用这种方法能使多种蛋白活性长期保存。但操作需注意几个问题：:首先被冻的最好是蛋白的水溶液。如果混有有机溶剂，会降低水的冰点，在干燥时样品融化而起泡导致蛋白变性，同时，会使真空泵失效。:其次，如果混有磷酸盐，在冷冻干燥时会引起pH的变化，例如,pH 7的磷酸盐在冷冻时由于磷酸二氢钠会结晶析出，在溶液完全冷冻以前，pH便变成3.5左右。因此，在冷冻前，需将蛋白溶液脱盐。,2.2蒸发法 通常采用的减压蒸发法和实验室常用的超蒸发法，都因效率低、费时等在工业上很少应用。目前，工业上应用较多的是薄膜蒸发法。薄膜蒸发法，即将待浓缩的蛋白溶液在高度真空下转变成极薄的液膜，液膜通过加热而急速汽化，经旋风汽液分离器，将蒸汽分离、冷凝而达到浓缩目的。薄膜蒸发器有：升膜式、降膜式、刮膜式、离心式等多种。根据物料不同而加以选择。,2.3超滤 超滤是在加压的条件下，将蛋白溶液通过一层只允许小分子物质选择透过微孔半透膜而目的蛋白等大分子物质被截留，从而达到浓缩的目的。如果采用不同孔径的膜，同时又具有分级分离的作用.这种方法具有下列优点：不需加热，更适用于热敏物浓缩；无相变化、设备简单、操作方便；能在广泛的pH条件下操作等，因此，近年来发展很快。,借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。膜分离所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。有时也可以采用动物膜等。膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。膜的孔径有多种规格可供使用时选择。,膜分离,加压膜分离,微滤超滤反渗透,电场膜分离,电渗析 离子交换膜电渗析,扩散膜分离,透析,膜分离技术,过滤的分类及其特性(根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同),透 析(Dialysis)法：过程：将蛋白溶液装入透析袋中，放入蒸馏水或稀缓冲液中，小分子物质通过透析袋进入水或缓冲液中，而蛋白质被截留在透析袋中；透析袋类型：有两种，再生纤维素膜透析袋和纤维素酯透析袋。有多种型号和规格，主要参数是分子量截留值（1102D）；商品名为spectrapor等。透析袋的预处理：干燥的透析袋在制备过程中曾用10%甘油处理过，只要浸泡湿润和蒸馏水洗涤即可使用；必要时可用10mmol/L 碳酸氢钠，50%乙醇和10mmol/L EDTA处理后，再用蒸馏水洗涤。,透 析,按照分子大小进行分离。分离取决于透析袋截留的分子量。,透析液,浓缩的蛋白混合样品,透析袋,开始透析,处于平衡状态,All-Glass Filter Holder,常见的微滤装置,33 mm Millex Filter Units,常见的微滤装置,Centriprep Centrifugal Filter Units,常见的超滤装置,Solvent-Resistant Stirred Cells,常见的超滤装置,Pellicon XL 50 Ultrafiltration Devices,常见的超滤装置,4 蛋白的纯化方法,1、沉淀分离,2、层析分离,3、电泳分离,4、萃取分离,产 物 特 性 作 用 等电点 决定离子交换种类及条件相对分子量 选择不同孔径的介质疏水性 与疏水、反相介质结合的程度生物特异性 决定亲和配基溶解性 决定分离体系及蛋白浓度稳定性 决定工艺采用温度及流程时间,产物的特性在分离纯化中的作用,1、沉淀分离,沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使蛋白的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。,在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。,在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。,在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度表示。,有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20时水的介电常数为80，而82乙醇水溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。,常用于蛋白的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等,2、层析分离,层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。,2.层析分离方法,仪器设备简介,离子交换全套装置,多柱组合层析高通量蛋白质分离设备,CX型全自动层析分离机组,2.1、吸附法（吸附交换分离法）：根据吸附机制的不同可分为3种：物理吸附法，羟基磷灰石法和离子交换吸附法；都是利用样品中不同分子与吸附剂之间的吸附和解吸性质不同而达到分离的目的；操作方式有静态吸附和柱层析两种方式；操作过程包括：吸附剂的平衡与活化，加样吸附，洗涤和洗脱。（1）物理吸附法：常用的吸附剂有硅藻土，活性氧化铝，淀粉和活性炭等；预先洗涤和活化后，在低盐，弱酸或近中性条件下加样吸附，再在弱减条件下进行洗脱。常采用静态方式进行。,（2）羟基磷灰石法：羟基磷灰石是一种微晶型磷酸钙；一般认为其表面的钙离子和磷酸根离子与蛋白质带相反电荷的基团发生相互作用；也是在低盐和弱酸或中性条件下进行吸附；洗脱时提高离子强度；多采用柱层析方式进行。,2.2离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。,离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。,一.离子交换介质的基本性质,阴离子交换剂：强碱型和弱碱型,可电离的基团磺酸基（-SO3H）,离子交换剂的分类,磷酸基（-PO3H2）,羧酸基（-COOH）,酚羟基（-OH）,阳离子交换剂：强酸型和弱酸型,可电离的基团伯胺基（-NH2）,仲胺基（-NHCH3）,叔胺基（-N(CH3)2）,季胺基（-N+(CH3)3）,带正电荷多蛋白紧密结合,带负电荷多蛋白流过层析柱,阳离子交换树脂工作示意图,离子交换介质的基本性质,常用的离子交换剂,离子交换树脂：,最常见的离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物,离子交换树脂的优点是：流速快，对小分子物质的交换容量大，因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化,离子交换介质的基本性质,常用的离子交换剂,离子交换纤维素：,离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大,阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM纤维素）等阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤维素）,离子交换介质的基本性质,常用的离子交换剂,离子交换葡聚糖：,离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物（Sephadex G）,Sephadex的优点如下：,亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小电离基团在母体上取代程度高，交换容量大，装柱方便，流速快,既有离子交换作用，又有分子筛效应因而Sephadex是一类广泛应用的色谱分离介质,离子交换介质的基本性质,常用的离子交换剂,离子交换葡聚糖：,常用的离子交换葡聚糖包括：,阳离子交换剂CM-Sephadex C-25，CM-Sephadex C-50,Sephadex C-25，Sephadex C-50,阴离子交换剂DEAE-Sephadex A-25，DEAE-Sephadex A-50,QAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-50,离子交换介质的基本性质,常用的离子交换剂,离子交换琼脂糖：,离子交换琼脂糖是携带DEAE或CM基团的Sepharose CL-6BDEAE-Sepharose（阴离子型）和CM-Sepharose（阳离子型）的离子交换介质具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点尤其是介质受pH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因此具有稳定的外形体积,离子交换介质的选择原则,一般而言：,酸性物质用 阴离子交换剂分离,氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质，可根据其pI值及离子化曲线来选择,碱性物质用 阳离子交换剂分离,离子交换介质的选择原则,1,2,3,4,6,7,8,9,10,5,pH,+,-,蛋白质净电荷,等电点,吸附阴离子交换剂,吸附阳离子交换剂,pH pI（-）,对pI=5的某酸性蛋白质,在的范围内，,当蛋白质为阴离子时，,应首选DEAE纤维素；,在的范围内，,当蛋白质为阳离子时，,应首选CM纤维素,缓冲液离子组成的选择,缓冲液离子的pK值要接近所用的pH，采用阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液，如：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐采用阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液，如：Tris缓冲液离子不影响被分离物的活性、测定、溶解度。,缓冲液离子强度的选择,起始缓冲液能使样品中有效成分与离子交换剂结合，一般小于0.1mol/L。洗脱液能使有效成分从离子交换剂上解离下来，一般0.15mol/L（或采用pH洗脱）。,离子交换拄层析操作方式,一、离子交换剂的处理、转型和再生二、分离物质的交换三、物质的洗脱与收集,一、离子交换剂的处理和转型,一般程序：水泡，悬浮，酸或碱浸泡，洗涤至中性疏水性离子交换剂 用2-4倍的2mol/L NaOH或2mol/L HCl溶液处理 亲水性离子交换剂 用0.5mol/LNa0H或0.5mol/LHCl溶液处理；转型与再生：由一种反离子转到另一种反离子的过程。欲使阳离子交换剂转成钠型时，则需用NaOH处理；欲使其转成氢型时，则需用HCl处理；欲使其带铵离子时，则需用NH4OH或NH4C1处理。,目的：使离子交换剂带上所希望的离子或基团,二、分离物质的交换,分批法柱层析法实际交换量只能按理论交换量的25-50计算。,分批法,柱层析系统的组装,柱层析系统的连接,三、物质的洗脱与收集,梯度混合器及形成的梯度变化离子强度梯度洗脱pH值梯度洗脱,离子交换层析的基本操作,样品洗脱,恒定洗脱,阶段洗脱,梯度洗脱,10,20,30,40,50,60,70,80,90,分子浓度,离子强度,pH值,产生梯度溶液的三种装置及形成的梯度变化,C=CB-（CB-CA）（1-V2/V1）B1/A1 CA、CB 梯度混合器A瓶、B瓶的浓度；A1、B1 A瓶、B瓶的横切面积；V2流经层析柱的体积，V1梯度洗脱液的总体积。,线性和阶梯式梯度溶液分离牛血清白蛋白的图谱,4、凝胶过滤法：原理：又称分子筛层析，在层析柱中填充凝胶介质，加入待分离的蛋白溶液，然后用适当的缓冲液洗脱，样品自上而下扩展，大于凝胶孔径的分子不能进入胶粒内部而从胶粒间空隙扩展，下移速度较快，而小于凝胶孔径的分子进入胶粒内部，下移速度较慢，经过一定时间后不同大小分子按先大后小的顺序从层析柱中流出。,凝胶的类型与选择：葡聚糖凝胶 Sephadex G:是葡聚糖微网状结构的干胶，有SephadexG-10G-200共8种型号；G后面的数字是表示不同的交联度，数字越大，交联度越小，吸水量越大，其数值越为吸水量的10倍；pH稳定范围为2-11；分子量分级范围为8105；亲水性强。聚丙烯酰胺葡聚糖Sephacryl S：有Sephacryl S-100HRS-600HR共6个型号；机械性能，分辨率，分离速度，化学稳定性均高于葡聚糖凝胶；可用0.5mol/L NaOH在位清洗；中性时可以高压灭菌；对所有常用的缓冲液均稳定；pH稳定范围3-11；有效分子量分离范围11032 107或108。,聚丙烯酰胺凝胶Bio-Gel P：有Bio-Gel P 2 Bio-Gel P 300共10个型号；P后面的数字乘以1000表示其分离的最大分子量（排阻分子量）；过酸或过碱时不稳定；在 时可以高压灭菌；在大多数缓冲液中都可使用；pH稳定范围为2-10；分级范围为11026 104。琼脂糖凝胶:有Sepharose,Superose和 Bio-Gel A三种，每种又有各种不同的型号；凝胶的孔径大小是通过琼脂糖浓度来控制的；分级范围很宽；但对温度要求严格（2-300C），40oC以上时易融化，低于0oC时易堵塞。,凝胶柱层析的基本过程与要求 包括凝胶的吸水平衡，装柱，加样，洗脱，流出液活性检测和部分收集。层析结果常以洗脱曲线来表示（图4-3），即以洗脱液中蛋白质含量（A280）或酶活力对洗脱体积（Ve)作图。衡量分离效果的标准是：分辨率高，回收率高，稀释倍数小，流速快。分辨率Rs=两峰间距离/峰宽；要求Rs 1.2；Rs 与柱长L有关，Rs 与 L 呈正比。流速f=p.r2/L(p为压强，r为柱内半径）；一般要求 r：L=1：4020或1：10050。,A280,0.4,0.3,0.2,0.1,酶活力,蛋白质酶活力,800 900 1000 1100 洗脱体积Ve（ml）,图3-3 凝胶过滤洗脱曲线,5.亲和色谱 亲和色谱 1、原理亲和色谱(Affinity Chromatography AC)又叫功能色谱(Function Chromatography)，它的原理是填料上的配基与生物大分子特异结合，用特殊的洗脱条件把被吸附的生物分子洗脱下来。一种亲和色谱填料只能用于一种或有限的一类生物分子。,2、活化方法1.溴化氰活化法溴化氰活化及配基偶联的反应如下图所示。对新活化的琼脂糖凝胶偶联分析表明，80%配基是由氰酸酯偶联的，20%由亚氨碳酸盐偶联。缺点：偶联后形成的酰胺键不稳定，容易降解而使配基脱落。,溴化氰活化及配基偶联的原理,根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为：,共价亲和层析疏水层析金属离子亲和层析免疫亲和层析染料亲和层析凝集素亲和层析,金属离子亲和层析,3、亲和色谱的应用1 金属螯合色谱纯化带His标签蛋白金属螯合亲和色谱(MetalChelateAffinity Chromatography)，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是利用蛋白表面的一些氨基酸，例如组氨酸等能与多种过渡金属离子如Cu 2+，Zn 2+，Ni 2+，Co 2+，Fe 3+发生特殊的相互作用，利用这个原理对蛋白进行分离。因此螯合了金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性的吸附那些含有组氨酸的蛋白和对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子产生吸附作用，但这种吸附力要远小于组氨酸残基与金属离子的吸附作用。,1.螯合金属离子的影响常用的有Ni 2+、Cu 2+、Zn 2+、Co 2+和Ca 2+。其中Cu 2+、Ni 2+对蛋白吸附力强，Co 2+，Zn 2+比较弱。2.缓冲液的影响缓冲液中最好没有EDTA，EGTA和氨盐，在缓冲液中加入适量的表面活性剂或者减少盐浓度可以降低非特异的疏水吸附。3.样品的影响1.样品通常溶解在的缓冲液中，pH高，载量也高。2.缓冲液的pH不能小于5.5，否则金属离子会脱落。3.样品不能含EDTA，EGTA和氨盐等,5、电泳分离,带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。,颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。此外，还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。,3.5 蛋白的组合分离纯化策略,设计分离纯化工艺的基本要求,纯化实例:重组EPO的纯化,临床应用重组人促红细胞生成素可治疗慢性肾衰竭合并贫血症，慢性肾功能衰竭（CRF）贫血，骨髓增生异常综合症贫血（Myelodys-plastic Syndrom,MDS），AIDS病人的伴生贫血，（非髓性）肿瘤伴生贫血及肿瘤化疗贫血，地中海贫血,镰刀形贫血,早产儿贫血等.也可用于外科手术中的自体输血、骨髓移植等。,EPO理化性质,疏水性极强酸性糖蛋白pI 3.75-4.15:原因是EPO的糖基化程度的微小差异而造成空间构象和分子大小不同。MW 30-39kD,其中糖链约占39%两个链内二硫键rhEPO和天然EPO结构极为相似，仅在唾液酸连接上有细微差别,三步纯化基本流程,第一步：反相柱色谱 样品浓缩约96.7%透析第二步：DEAE-离子交换色谱第三步：分子筛色谱 总回收率 30%比活 1.5*108U/g蛋白,培养方法简介：冻存细胞 扩增培养 0.025%胰蛋白酶消化 接种 堆积床反应器 1*10 7 无血清培养基灌流培养,第一步：反相色谱,C6 反相柱（2cm*2cm）流程：上样 50ml/min（柱结合量约5mg蛋白/ml介质）去离子水平衡至检测基线 10%-80%乙醇胍线性梯度洗脱 检测并收集含EPO主峰 ELISA测定结果：60%乙醇-1mol/L盐酸胍洗出EPO,透析,透析液：10倍体积的10mmol/L Tris.HCl(pH 7.5)-2%蔗糖缓冲液透析次数：2时间：5-6h,第二步：离子交换柱,DEAE型离子交换柱流程：10mmol/L Tris.HCl(pH7.5)缓冲液平衡 上样 20ml/min（柱结合量20mg/ml）10mmol/L Tris.HCl(pH7.5)缓冲液平衡至基线 添加NaCl入缓冲液，进行截状梯度洗脱（NaCl浓度分别为：50，70，125mmol/L）结果：ELISA检测盒表明75mmol/L洗脱峰中含EPO,分析,Epo的pI偏低，所以多采用阴离子交换柱层析，尤其是DEAE离子柱层析如DEAE-sephacel,DEAE-sephadex,DEAE-agarose。离子交换柱结合量大，洗脱体积小，纯化，浓缩倍数较高。天然，重组EPO原始粗制品中均含有一定浓度的盐分，直接上柱层析往往不能很好吸附，需要预处理。,流动相采用了低浓度阳离子缓冲液，pH在7.5，洗脱时采用了改变离子强度的策略。总的看来，EPO不是一种离子化程度很高的物质，离子强度变化比较小即可使其从柱上解离。一般使用50mmol/L-125mmol/L的NaCl缓冲液即可将EPO从DEAE柱上洗脱下来。,第三步：分子筛色谱,Sephacryl S-200 色谱分析流程：上样体积 80ml 流速 2ml/min 流动相 20mmol/L 柠檬酸钠-100mmol/L NaCl 缓冲液结果：收集的rHuEPO保留时间约为45min 比活性约为1.5*108U/g蛋白；纯度 98%（SDS-PAGE检测）免疫原性检测：Western blot,3.6 蛋白干燥与结晶,干燥是蛋白与溶剂（通常是水）分离的过程。在蛋白的分离纯化过程中是一个重要的环节。,离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分，也可以达到浓缩效果。蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。由于蛋白在高温条件下不稳定，容易变性失活，故蛋白液的浓缩通常采用真空浓缩。即在一定的真空条件下，使蛋白液在60以下进行浓缩。,在重组蛋白的生产过程中，为了提高蛋白的稳定性，便于保存、运输和使用，一般都必须进行干燥。常用的干燥方法有：,真空干燥冷冻干燥喷雾干燥气流干燥吸附干燥,结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。蛋白的结晶是酶分离纯化的一种手段。它不仅为蛋白的结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而且为较高纯度的蛋白的获得和应用创造了条件。,蛋白在结晶之前，蛋白液必须经过纯化达到一定的纯度。如果蛋白液纯度太低，不能进行结晶。通常蛋白的纯度应当在50%以上，方能进行结晶。总的趋势是蛋白的纯度越高，越容易进行结晶。要说明的是，不同的蛋白对结晶时的纯度要求不同。有些蛋白在纯度达到50%时就可能结晶，而有些蛋白在纯度很高的条件下也无法析出结晶。所以蛋白的结晶并非达到绝对纯化，只是达到相当的纯度而已。,盐析结晶有机溶剂结晶透析平衡结晶 等电点结晶,包涵体的纯化与变复性,概述,大肠杆菌表达体系因其具有低廉性、高效性和稳定性等优点在科研生产中被广泛应用。然而,当外源蛋白质在大肠杆菌中高效表达时常形成不可溶、无生物活性的聚集体(aggregation)又称包涵体(inclusion body),包涵体必须经过变性、复性才能获得生物学功能,而这种变性/复性是在体外环境中进行,缺乏辅助肽链折叠的酶系和分子,造成重组蛋白质在复性过程中形成大量的很难再溶解的蛋白质聚集体,使以包涵体形式存在的高效表达产物大部分成为“看得见,拿不到”的废品,聚集是造成重组蛋白质复性产率低下的主要因素。,1、包涵体的形成原因,目前的研究认为,包涵体的形成有如下原因:表达蛋白的速率过快、浓度过高,生成的蛋白质没有足够的时间和空间折叠形成正确结构;蛋白在折叠过程中疏水区暴露于溶液中,分子间的相互作用形成错误折叠导致凝集;表达环境的细胞内部还原性过高,使蛋白质中二硫键稳定性下降,出现错配或多余的二硫键;培养温度、pH 值、某些金属离子等因素影响包涵体动力学的稳定;原核系统缺乏真核系统对真核生物蛋白的加工和修饰功能。,图1 蛋白质的合成、折叠与聚集示意图,2、包涵体的制备,包涵体具有很高的密度（-1.3g/ml），在细胞裂解后可通过5000-20000g/min,15min的低速离心获得。这些沉淀一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、膜蛋白、质粒,DNA以及磷脂、脂多糖等。为除去这些杂质还需要使用洗涤液洗涤包涵体，这些洗涤液通常由去污剂triton X-100，脱氧胆酸盐和非变性浓度的变性剂如尿素、盐酸胍等充分洗涤去除杂质，达到初步纯化的目的。,3、包涵体的溶解,经过洗涤后的包涵体使用强变性剂，如8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍，以改变蛋白质疏水区域水分子结构的顺序，而减少蛋白质分子间和分子内的疏水作用。通常盐酸胍溶解蛋白质的作用要强于尿素。此外还可使用去污剂,如SDS(十二烷基硫酸钠)、CTAC(十六烷基三甲基氯化铵)、CAPS(N-十二烷基肌氨酸)以及极端pH(24)酸性缓冲液。对含有半胱