天然产物有效成分的毒理学安全性与功能性评价.ppt

第二章 天然产物有效成分的毒理学安全性和功能性评价,毒理学评价 安全性评价 功能性评价,毒理学(toxicology)是研究化学、物理和生物因素对机体的损害作用、生物学机制（biologic mechanisms）、危险度评价（risk assessment）和危险度管理（risk management）的科学。毒理学主要分为三个研究领域，即描述毒理学、机制毒理学和管理毒理学。卫生毒理学(health toxicology)是利用毒理学的概念和方法，从预防医学角度，研究人类生活和生产活动中可能接触到的外来化合物对机体的生物学作用，特别是损害作用，亦即毒性作用及其机理的科学。卫生毒理学属于预防医学的范畴，也是毒理学的一个分支学科。,一、毒理学安全性评价,外源化学物(xenobiotics)是在人类生活的外界环境中存在、可能与机体接触并进入机体，在体内呈现一定的生物学作用的一些化学物质，又称为“外源生物活性物质”。内源化学物 是指机体内原已存在的和代谢过程中所形成的产物或中间产物。毒理学研究外源化学物对机体的有害作用，而不是有益作用(如营养作用、治疗作用等)。,（一）毒理学概述,毒理学的目的 任何一种化学物质在一定条件下都可能是对机体有害的，毒理学的目的就在于研究外源化学物质的毒性和产生毒性作用的条件，阐明剂量一效应(反应)关系，为制订卫生标准及防治措施提供理论依据。,毒理学研究的三个主要研究领域：描述毒理学(descriptive toxicology)采用实验动物进行适当的毒性试验，获得用于 评价人群和环境特定化学物暴露的危险度信息。为化学物的毒作用机制提供重要线索，通过形成假设为发展机制毒理学作出贡献。,机制毒理学(mechanistic toxicology)证实与人类直接相关的实验动物中所观察到的损害作用（癌症、出生缺陷等）。验证可能与人类无关的发生于实验动物中的有害效应。设计和生产较为安全的化学物以及合理治疗化学中毒和临床疾病。进一步加深对基础生理学、药理学、细胞生物学和生物化学的了解。,管理毒理学(regulatory toxicology)根据描述和机制毒理学的研究资料进行科学决策，协助政府部门制定卫生标准、相关法规条例和管理措施并付诸实施，以确保化学物、药品、食品等进入市场足够安全，达到保护人民群众身心健康的目的。,古代与中世纪毒理学 毒理学一词源于希腊文字“toxikon”公元前2735年，神农编辑完成了40卷“本草”典籍 公元前2650年，黄帝撰写了内经 古埃及、古希腊及古罗马等有关文献中都有关于有毒植物和矿物的描述，积累了关于有毒物质及中毒的知识。,（二）毒理学简史,启蒙时代毒理学16世纪瑞士医生Paracelsus(14931541)意大利内科医生Ramazzini(16331714)1775年英国外科医生Pott(1714-1788)意大利内科医生Fontana(1720-1853)进一步发展了靶器官毒性概念。西班牙医生Orfila被认为是现代毒理学的奠基人，他是系统利用实验动物的第一个科学家，并发展了在组织和体液中鉴定毒物的化学分析方法。19世纪的Megendie、Bernard对依米丁、士的宁和箭毒、CO中毒的作用机制进行了研究。,现代毒理学1930年实验毒理学的第一本杂志创刊，同年在美国成立了NIH1937年引起急性肾衰竭和死亡的“磺胺事件”，促使了美国FDA的成立1955年，Lehman和他的同事共同出版了食品、药品和化妆品中化学物的安全性评价通过了许多新的法规，创办了许多新的杂志，成立了国际毒理学协会（1965）,重大公共卫生事件,中国上海甲肝暴发中国山西朔州毒酒事件 中国南京汤山中毒事件 中国河北自沟苯中毒事件日本O-157 事件 印度博帕尔灾难 德法荷比二恶英事件 英国疯牛病,上海甲肝暴发,自 1988 年 1 月 19 日起,上海市民中突然发生不明原因的发热、呕吐、反食、乏力和黄疸等症状的病例,数日内成倍增长,截止到当年的 3 月 18 日,共发生 29230 例。,山西朔州毒酒事件,1998 年春节前,山西文水县一不法分子用甲醇勾兑散装白酒,批发给外地个体户。从 1 月 26 日开始,先后发现数百名群众饮假酒中毒住院,其中近 30 人死亡。,南京汤山中毒事件,2002 年 9 月 14 日,南京汤山发生一起特大投毒案。犯罪分子陈正平将所携带的剧毒鼠药“毒鼠强”投放到“正武”面食店食品原料内,造成 395 人因食用有毒食品而中毒,死亡 42 人。,河北白沟苯中毒事件,2002 年初,在河北省高碑店市白沟镇箱包生 产加工企业打工的几名外地务工者,陆续出现了中毒症状,并有 6 人相继死亡,后经卫生部门调查确定为苯中毒事件。,日本 O-157 事件,日本 O-157 事件:自 1996 年 6 月从日本多所小学发生集体食物中毒事件而发现元凶为“O-157”大肠杆菌以来,日本全国至当年 8 月患者 已达 9000 多人。其中 7 人死亡,数百人住院治疗。,印度博帕尔灾难,1984 年 12 月 3 日,美国的跨国公司联合碳化物公司在印度中央联邦首府博帕尔开办的一家农药厂,发生了一起严重的毒气泄漏事故,给当地居民带来巨大 的灾难。据报道,共有3600多人死于 这次事故。,德法荷比二恶英事件,1999年，比利时、荷兰、法国、德国相继发生因二恶英污染导致畜禽类产品及乳制品含高浓度二恶英的事件。二恶英事件使当年比利时损失超过 10 亿欧元。,英国疯牛病,疯牛病在人类中的表现为新型克雅氏症，患者脑部会出现海绵状空洞，导致记忆丧失，身体功能失调，最终神经错乱甚至死亡。1997年，英国科学家曾经预计，在最糟糕的情况下，可能会有1000万人最终死于新型克雅氏症。2002年这一预计数字降为5万人。2000年7月，在英国有超过34 000个牧场的 17 万多头牛感染了疯牛病。,毒理学主要是借助于动物模型模拟引起人体中毒的各种条件，观察实验动物的毒性反应，再外推到人。由于动物，特别是哺乳动物和人体在解剖、生理和生化代谢过程方面有很多相似之处，这就是利用动物实验的结果可以外推到人的基础。毒理学实验可采用整体动物、游离的动物脏器、组织、细胞进行。根据所采用的方法不同，可分为体内试验(in vivo test)和体外试验(in vitro test)。毒理学还利用限定人体试验和流行病学调查直接研究外源化学物对人体和人群健康的影响。,（三）毒理学的研究方法,1.体内试验 也称为整体动物试验。可严格控制接触条件，测定多种类型的毒作用。实验多采用哺乳动物，例如大鼠、小鼠、脉鼠、家兔、仓鼠(hamster)、狗和猴等。在特殊需要情况下，也采用鱼类或其他水生生物、鸟类、昆虫等。检测外源化学物的一般毒性，多在整体动物进行，例如急性毒性试验，亚急性毒性试验、亚慢性毒性试验和慢性毒性试验等。哺乳动物体内试验是毒理学的基本研究方法，其结果原则上可外推到人；但体内试验影响因素较多，难以进行代谢和机制研究。,2.体外试验利用游离器官、培养的细胞或细胞器进行毒理学研究，多用于外源化学物对机体急性毒作用的初步筛检、作用机制和代谢转化过程的深入观察研究。体外试验系统缺乏整体毒物动力学过程，并且难以研究外源化学物的慢性毒作用。,(1)游离器官：利用器官灌流技术将特定的液体通过血管流经某一离体的脏器(肝脏、肾脏、肺、脑等)，借此可使离体脏器在一定时间内保持生活状态，与受试化学物接触，观察在该脏器出现有害作用，以及受试化学物在该脏器中的代谢情况。(2)细胞：利用从动物或人的脏器新分离的细胞(原代细胞，primary cell)或经传代培养的细胞如细胞株(cell strain)及细胞系(cell line)。(3)细胞器(organelle)：将细胞制作匀浆，进一步离心分离成为不同的细胞器或组分，例如线粒体、微粒体、核等，用于实验。体内试验和体外试验各有其优点和局限性，应主要根据实验研究的目的要求，采用最适当的方法，并且互相验证。,3.人体观察 通过中毒事故的处理或治疗，可以直接获得关于人体的毒理学资料，这是临床毒理学的主要研究内容。有时可设计一些不损害人体健康的受控的实验，但仅限于低浓度、短时间的接触，并且毒作用应有可逆性。,4.流行病学研究 对于在环境中已存在的外源化学物，可以用流行病学方法，将动物实验的结果进一步在人群调查中验证，可从对人群的直接观察中，取得动物实验所不能获得的资料，优点是接触条件真实，观察对象包括全部个体，可获得制订和修订卫生标准的资料，以及制定预防措施的依据。利用流行病学方法不仅可以研究已知环境因素(外源化学物)对人群健康的影响(从因到果)，而且还可对已知疾病的环境病因进行探索(从果到因)。但流行病学研究干扰因素多，测定的毒效应还不够深入，有关的生物学标志还有待于发展。,（四）安全毒理学评价试验的四个阶段与试验原则,1.试验的四个阶段第一阶段：急性毒性试验，包括经口急性毒性（LD50）和联合急性毒性。第二阶段：遗传毒性试验、传统致畸试验、短期喂养试验。第三阶段：亚慢性毒性试验（90天喂养试验）、繁殖试验和代谢试验。第四阶段：慢性毒性实验（包括致癌试验）,第一阶段：急性毒性试验目的：通过测定获得LD50（半致死剂量），了解受试物的毒性强度、性质和可能的靶器官，为进一步进行毒性试验的剂量和毒性判定指标的选择提供依据。试验内容：口急性毒性（LD50）试验、联合急性毒性试验。,第二阶段：遗传毒性试验、传统致畸试验、短期喂养试验,目的：（1）遗传毒性试验 对受试物的遗传毒性以及是否具有潜在致癌作用进行筛选。（2）传统致畸试验 了解受试物对胎仔是否具有致畸作用。（3）短期喂养试验 对只需进行第一、二阶段毒性试验的受试物，在急性毒性试验的基础上，通过短期（30d）喂养试验，进一步了解其毒性作用，并可初步估计最大无作用剂量。,试验内容：,（1）细菌致突变试验：鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验）为首选项目，必要时可另选和加选其他试验。（2）小鼠骨髓微核率测定或骨髓细胞染色体畸变分析（3）小鼠精子畸形分析和睾丸染色体畸变分析。,第三阶段：亚慢性毒性试验（90天喂养试验）、繁殖试验和代谢试验。,目的：观察受试物以不同剂量水平经较长期喂养后对动物的毒性作用性质和靶器官，并初步确定最大作用剂量；了解受试物对动物繁殖及对仔代的致畸作用，为慢性毒性和致癌试验的剂量选择提供依据。试验内容：90d喂养试验 繁殖试验：代谢试验：了解受试物在体内的吸收、分布和排泄速度以及蓄积性，寻找可能的靶器官；为选择慢性毒性试验的合适动物种系提供依据；了解有无毒性代谢产物的形成。,第四阶段：慢性毒性试验（包括致癌试验）,目的：了解经长期接触受试物后出现的毒性作用，尤其是进行性或不可逆的毒性作用以及致癌作用；最后确定最大无作用剂量，为受试物能否应用于食品的最终评价提供依据。,（五）食品毒理学试验结果的判定,1.急性毒性试验 如LD50剂量小于人的可能摄入量的10倍，则放弃该受试物用于食品，不再继续其他毒理学试验。如大于10倍者，可进入下一阶段毒理学试验。凡LD50在人的可能摄入量的10倍左右时，应进行重复试验，或用另一种方法进行验证。,2.遗传毒性试验,根据受试物的化学结构、理化性质以及对遗传物质作用终点的不同，并兼顾体外和体内试验以及体细胞和生殖细胞的原则。,鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验）小鼠骨髓微核率测定骨髓细胞染色体畸变分析小鼠精子畸形分析睾丸染色体畸变分析试验,选择四项试验,结果判断原则：,其中三项试验为阳性：则表示该受试物很可能具有遗传毒性作用和致癌作用，一般应放弃该受试物应用于食品；毋需进行其他项目的毒理学试验。其中两项试验为阳性：而且短期喂养试验显示该受试物具有显著的毒性作用，一般应放弃该受试物用于食品；如短期喂养试验显示有可疑的毒性作用，则经初步评价后，根据受试物的重要性和可能摄入量等，综合权衡利弊再作出决定。其中一项试验为阳性，则再选择V79/HGPRT基因突变试验、显性致死试验、果蝇伴性隐性致死试验，程序外DNA修复合成（UDS）试验中的两项遗传毒性试验。如再选的两项试验均为阳性，则无论短期喂养试验和传统致畸试验是否显示有毒性与致畸作用，均应放弃该受试物用于食品；如有一项为阳性，而在短期喂养试验和传统致畸试验中未见有明显毒性与致畸作用，则可进入第三阶段毒性试验。如四项试验均为阴性，则可进入第三阶段毒性试验。,3.短期喂养试验,在只要求进行两阶段毒性试验时，若短期喂养试验未发现有明显毒性作用，综合其他各项试验即可作出初步评价；若试验中发现有明显毒性作用，尤其是有剂量-反应关系时，则考虑进一步的毒性试验。,4.90d喂养试验、繁殖试验、传统致畸试验,根据三项试验中所采用的最敏感指标所得的最大无作用剂量进行评价，最大无作用剂量小于或等于人的可能摄入量的100倍者表示毒性较强，应放弃该受试物用于食品。最大无作用剂量大于100倍而小于300倍者，应进行毒性试验。大于或等于300倍者则不必进行慢性毒性试验，可进行安全性评价。,5.慢性毒性（包括致癌）试验,根据慢性毒性试验所得的最大无作用剂量进行评价，最大无作用剂量小于或等于人的可能摄入量的50倍者，表示毒性较强，应放弃该受试物用与食品。最大无作用剂量大于50倍而小于100倍者，经安全性评价后，决定该受试物可否用于食品。最大无作用剂量大于或等于100倍者，则可考虑允许使用于食品。新资源食品、复合配方的饮料等在试验中，若试样的最大加入量（一般不超过饲料的5%）或液体试样最大可能的浓缩物加入量仍不能达到最大无作用剂量为人的可能摄入量的规定倍数时，则可以综合其他的毒性试验结果和实际食用或饮用量进行安全性评价。,（六）食品安全性评价时需要考虑的因素,1.人的可能摄入量除一般人群的摄入量外，还应考虑特殊和敏感人群（如儿童、孕妇及高摄入量人群）。2.人体资料由于存在着动物与人之间的种族差异，在将动物试验结果推论到人时，应尽可能收集人群接触受试物后反应的资料，如职业性接触和意外事故接触等。志愿受试者体内的代谢资料对于将动物试验结果推论到人具有重要意义。在确保安全的条件下，可以考虑按照有关规定进行必要的人体试食试验。,4.安全系数,由动物毒性试验结果推论到人时，鉴于动物、人的种属和个体之间的生物特性差异，一般采用安全系数的方法，以确保对人的安全性。安全系数通常为100倍，但可根据受试物的理化性质、毒性大小、代谢特点、接触的人群范围、食品中的使用量及使用范围等因素，综合考虑增大或减小安全系数。,3.动物毒性试验和体外试验资料各项动物毒性试验和体外试验系统虽然仍有待完善，却是目前水平下所得到的最重要的资料，也是进行评价的主要依据。在试验得到阳性结果，而且结果的判定涉及到受试物能否应用于食品时，需要考虑结果的重要性和剂量-反应关系。,5.代谢试验的资料,代谢研究是对化学物质进行毒理学评价的一个重要方面，因为不同化学物质、剂量大小，在代谢方面的差别往往对毒性作用影响很大。在毒性试验中，原则上应尽量使用与人具有相同代谢途径和模式的动物种系来进行试验。研究受试物在实验动物和人体内吸收、分布、排泄和生物转化方面的差别，对于将动物试验结果比较正确地推论到人具有重要意义。,6.综合评价,在进行最后评价时，必须在受试物可能对人体健康造成的危害以及其可能的有益作用之间进行权衡。评价的依据不仅是科学试验资料，而且与当时的科学水平、技术条件，以及社会因素有关。因此，随着时间的推移，很可能结论也不同。随着情况的不断改变，科学技术的进步和研究工作的不断进展，对已通过评价的化学物质需进行重新评价，作出新的结论。,（一）功能学评价的基本要求,1.对受试样品的要求化学性质（包括化学结构、纯度、稳定性等）有关资料。受试样品必须是规格化的定型产品，即符合既定的配方、生产工艺及质量标准。提供受试样品的安全性毒理学评价的资料以及卫生学检验报告，受试样品必须是已经过食品安全性毒理学评价确认为安全的食品。功能学评价的样品与安全性毒理学评价、卫生学检验的样品必须为同一批次（安全性毒理学评价和功能学评价实验周期超过受试样品保质期的除外）。应提供功效成分或特征成分、营养成分的名称及含量。如需提供受试样品违禁药物检测报告时，应提交与功能学评价同一批次样品的违禁药物检测报告。,二、功能性评价,2.对实验动物的要求,根据各项实验的具体要求，合理选择实验动物。常用大鼠和小鼠，品系不限，推荐使用近交系动物。动物的性别、年龄依实验需要进行选择。实验动物的数量要求为小鼠每组1015只（单一性别），大鼠每组812只（单一性别）。动物应符合国家对实验动物的有关规定。,3.对给受试样品剂量及时间的要求,各种动物实验至少应设3组，必要时可设阳性对照组或空白对照组。剂量选择应合理，尽可能找出最低有效剂量。在3个剂量组中，其中一个剂量应相当于人体推荐摄入量（折算为每公斤体重的剂量）的5倍（大鼠）或10倍（小鼠），且最高剂量不得超过人体推荐摄入量的30 倍（特殊情况除外），受试样品的功能实验剂量必须在毒理学评价确定的安全剂量范围之内。给受试样品的时间应根据具体实验而定，一般为30天。当给予受试样品的时间已达30天而实验结果仍为阴性时，则可终止实验。,4.对受试样品处理的要求,受试样品推荐量较大，超过实验动物的灌胃量、掺入饲料的承受量等情况时，可适当减少受试样品的非功效成分的含量。对于含乙醇的受试样品，原则上应使用其定型的产品进行功能实验，其三个剂量组的乙醇含量与定型产品相同。如受试样品的推荐量较大，超过动物最大灌胃量时，允许将其进行浓缩，但最终的浓缩液体应恢复原乙醇含量，如乙醇含量超过15，允许将其含量降至15。调整受试样品乙醇含量应使用原产品的酒基。,液体受试样品需要浓缩时，应尽可能选择不破坏其功效成分的方法。一般可选择6070减压进行浓缩。浓缩的倍数依具体实验要求而定。对于以冲泡形式饮用的受试样品（如袋泡剂），可使用该受试样品的水提取物进行功能实验，提取的方式应与产品推荐饮用的方式相同。如产品无特殊推荐饮用方式，则采用下述提取的条件：常压，温度8090，时间3060分钟，水量为受试样品体积的10倍以上，提取2次，将其合并浓缩至所需浓度。,5.对给受试样品方式的要求 必须经口给予受试样品，首选灌胃。如无法灌胃则加入饮水或掺入饲料中，计算受试样品的给予量。6.对合理设置对照组的要求 以载体和功效成分（或原料）组成的受试样品，当载体本身可能具有相同功能时，应将该载体作为对照。,7.人体试食试验规程,评价食品保健作用时要考虑的因素人的可能摄入量 除一般人群的摄入量外，还应考虑特殊的和敏感的人群(如儿童、孕妇及高摄入量人群)。人体资料 由于存在动物与人之间的种属差异、在将动物试验结果外推到人时，应尽可能收集人群服用受试物的效应资料，若体外或体内动物试验未观察到或不易观察到食品的保健效应或观察到不同效应，而有关资料提示对人有保健作用时，在保证安全的前提下，应进行必要的人体试食试验。结果的重复性和剂量反应关系 在将评价程序所列试验的阳性结果用于评价食品的保健作用时，应考虑结果的重复性和剂量反应关系，并由此找出其最小有作用剂量。,（二）试验项目、试验原则及结果判定,1.免疫调节作用（1）试验项目:动物试验脏器/体重比值:a.胸腺/体重比值b.脾脏/体重比值细胞免疫功能测定a.小鼠脾淋巴细胞转化实验；b.迟发型变态反应体液免疫功能测定a.抗体生成细胞检测；b.血清溶血素测定单核巨噬细胞功能测定：a.小鼠碳廓清试验；b.小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验 NK细胞活性测定,人体试验,细胞免疫功能测定外周血淋巴细胞转化试验 体液免疫功能试验单向免疫扩散法测定IgG、IgA、IgM 非特异性免疫功能测定，吞噬与杀菌试验 NK细胞活性测定,（2）试验原则,要求选择一组能够全面反映免疫系统各方面功能的试验，其中细胞免疫、体液免疫和单核巨噬细胞功能三个方面至少各选择1种试验，在确保安全的前提下尽可能进行人体试食试验。,（3）结果判定,在一组试验中，受试物对免疫系统某方面的试验具有增强作用而对其他试验无抑制作用，可以判定该受试物具有该方面的免疫调节效应；对任何一项免疫试验具有抑制作用可判定该受试物具有免疫抑制效应。在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核巨噬细胞功能及NK细胞功能检测中，如有两个以上(含两个)功能检测结果阳性，即可判定该受试物具有免疫调节作用。,2.延缓衰老作用,（1）试验项目动物试验生存试验 a.小鼠生存试验 b.大鼠生存试验 c.果蝇生存试验过氧化脂质含量测定a.血(或组织)中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)含量测定 组织中脂褐质含量测定抗氧化活力测定 a.血(或组织)中超氧化物歧化酶(SOD)活力测定 b.血(或组织)中谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)活力测定,血中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)含量测定血中超氧化物歧化酶(SOD)活力测定丙二醛（MDA）是氧自由基攻击生物膜的不饱和脂肪酸的终产物，间接反映机体细胞受自由基损伤的程度，超氧化物歧化酶（SOD）是一种存在于细胞液中的抗氧化酶，它可清除超氧阴离子，保护机体免受超氧阴离子的损伤，因而SOD活性的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力.因此氧自由基对机体的损伤程度可以通过检测MDA含量的变化及内源性抗氧化酶（SOD）活性间接评定.,人体试验,（2）试验原则,衰老机制比较复杂，迄今尚无一种公认的衰老机制学说，因而无单一、简便、实用的衰老指标可供应用，应采用尽可能多的试验方法，以保证试验结果的可信性。动物试验，除上述生存试验，过氧化脂质含量测定、抗氧化酶活力测定3个方面各选一项必做外，可能时应多选择一些指标(如脑、肝组织中单胺氧化酶(MAO-B)活力测定等)加以辅助。生存试验是最直观、最可靠的实验方法，果蝇具有自下而上期短，繁殖快，饲养简便等优点，通常多选果蝇作生存试验，但果蝇种系分类地位与人较远，故必须辅助过氧化脂质含量测定及抗氧化活力测定才能判断是否具有延缓衰老作用。生化指标测定应选用老龄鼠，除设老龄对照外，最好同时增设少龄对照，以比较受试物抗氧化的程度，必要时可将动物试验与人体试食试验相结合综合评价。,（3）结果判定,若大鼠或小鼠生存试验为阳性，即可判定该受试物具有延缓衰老的作用。若果蝇生存试验、过氧化脂质和抗氧化酶三项指标均为阳性，即可判定该受试物具有延缓衰老的作用。若过氧化脂质和抗氧化酶两项为阳性，可判定该受试物具有抗氧化作用，并提示可能具有延缓衰老作用。,3.改善记忆作用,（1）试验项目动物试验 跳台试验 避暗试验 穿梭箱试验 水迷宫试验人体试验 韦氏记忆量表 临床记忆量表,（2）试验原则,试验应通过训练前、训练后及重测验前3种不同的给予受试物方法观察其对记忆全过程的影响。应采用一组(2个以上)行为学试验方法，以保证实验结果的可靠性。人体试食试验为必做项目，并应在动物试验有效的前提下进行。除上述试验项目外，还可以选用嗅觉厌恶试验、味觉厌恶试验、操作式条件反射试验，连续强化程序试验、比率程序试验、间隔程序试验。,（3）结果判定,动物试验2项或2项以上的指标为阳性，且2次或2次以上的重复测试结果一致，可以认为该受试物具有改善该类动物记忆作用；人体试食试验结果阳性，则可认为该受试物具有改善人体记忆作用。,4.促进生长发育作用,（1）试验项目本功能试验研究是以动物学试验为研究基础胎仔情况 包括活胎数、雌雄比例、死胎数、分娩胎仔总数。体重及食物利用率 记录出生时及生后4、7、14、21、30、60d幼鼠的体重，计算断乳后幼鼠的食物利用率。生理发育指标 记录耳廓分离、门齿萌出、开眼、长毛时间、阴道开放、睾丸下降时间。神经反射指标 平面翻正、前肢抓力、悬崖回避、嗅觉定位、听觉警戒、负趋地性、回旋运动、视觉发育、空中翻正、游泳发育。,（2）试验原则,给受试物的时间可根据具体情况选择在母鼠孕期或哺乳期至成年期。在神经反射指标中应选择一组(5个以上)的行为学试验方法，以保证结果的可靠性。,（3）结果判定,在胎仔情况、体重及食物利用率、生理发育、神经反射4类指标中有3类以上(含3类)指标为阳性，可认为受试物有促进生长发育的作用。,5.抗疲劳作用,本功能试验研究是以动物学试验为研究基础（1）试验项目运动试验 a.负重游泳试验 b.爬杆试验（2）生物化学指标测定 a.血乳酸含量 b.血清尿素氮含量 c.肝/肌糖原比值测定,（2）试验原则运动试验与生化指标检测相结合。在进行游泳或爬杆试验前，动物应进行初筛。除以上生化指标外，还可检测血糖、乳酸脱氢酶、血红蛋白以及磷酸肌酸等指标。（3）结果判定若1项以上(含1项)运动试验和2项以上(含2 项)生化指标为阳性，即可以判断该受试物具有抗疲劳作用。,6.减肥作用,（1）减肥原则减除体现人多余的脂肪，不单纯以减轻体重为标准。每日营养素的摄入量应基本保证机体正常生命活动的要求。对机体健康无明显损害。,（2）试验项目,动物试验（首先建立动物肥胖模型）体重测定体内脂肪重量测定人体试食试验 主要测定指标：体重、体重指数、腰围、腹围、臀围、体内脂肪含量。,（3）试验原则,在进行减肥试验时，除上述指标必测外，还应进行机体营养状况检测，运动耐力测试以及与健康有关的其它指标的观察。该功能的人体试食试验为必做项目，动物试验与人体试食试验相结合，综合进行评价。,（4）结果判定,在动物试验中，体重及体内脂肪重量2个指标均阳性，并且对机体健康无明显损害，即可初步判定该受试物具有减肥作用。在人体试食试验中，体内脂肪量显著减少，且对机体健康无明显损害，可判定该受试物具有减肥作用。,7.耐缺氧作用,本功能试验研究是以动物学试验为研究基础（1）试验项目小鼠常压耐缺氧实验（2）结果判定耐缺氧实验阳性，说明该受试物具有耐缺氧作用。,8.抗辐射作用,本功能试验研究是以动物学试验为研究基础（1）试验项目亚急性试验 30天存活率或平均存活时间 白细胞总数亚慢性或慢性试验 小鼠睾丸染色体畸变试验 小鼠骨髓细胞微核试验,（2）试验原则,较高剂量一次辐射，选择亚急性试验；小剂量多次辐射，选择亚慢性或慢性试验。,（3）结果判定,亚急性试验项目中2项结果为阳性，则可判定该受试物对较高剂量一次辐射有拮抗作用。亚慢性或慢性试验中2项结果为阳性，则可判定该受试物对小剂量多次辐射有拮抗作用。,9.抗突变作用,（1）试验项目Ames试验或V79细胞基因突变试验小鼠骨髓细胞微核试验小鼠睾丸染色体畸变试验,（2）试验原则Ames试验与V79细胞基因突变试验任选一项，采用体内与体外试验相结合的原则。（3）结果判定抗突变三项试验中有两项为阳性时，则可判定该受试物具有抗突变作用。,10.抑制肿瘤作用,（1）试验项目动物诱发性肿瘤试验动物移植性肿瘤试验免疫功能试验 NK细胞活性测定单核巨噬细胞功能测定,（2）试验原则动物诱发性肿瘤试验及动物移植性肿瘤试验两项中任选一项，同时必做2项免疫功能试验（3）结果判定 动物诱发性肿瘤试验及动物移植性肿瘤试验两项试验中有一项为阳性，并且对免疫功能无抑制作用，则可判定该受试物具有抑制肿瘤的作用。,11.调节血脂作用,（1）试验项目动物实验体重血清总胆固醇甘油三酯高密度脂蛋白胆固醇人体试验血清总胆固醇甘油三酯高密度脂蛋白胆固醇,人体试食试验,血清总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇三项指标检测中，血清总胆固醇和甘油三酯二项指标阳性，可判定该受试样品具有辅助降血脂作用；血清总胆固醇、甘油三酯两项指标中任一项指标阳性，同时高密度脂蛋白胆固醇结果阳性，可判定该受试样品具有辅助降低血清总胆固醇或辅助降低甘油三酯作用。,（2）试验原则,动物实验和人体试食试验所列指标均为必测项目。动物实验选用脂代谢紊乱模型法，预防性或治疗性任选一种。用高胆固醇和脂类饲料喂养动物可形成酯代谢紊乱动物模型，再给予动物受试样品或同时给予受试样品，可检测受试样品对高脂血症的影响，并可判定受试样品对脂质的吸收、脂蛋白的形成、脂质的降解或排泄产生的影响。,在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察后进行。选择单纯血脂异常的人群，保持平常饮食，半年内采血2次，如两次血清总胆固醇（TC）均为5.26.24mmol/L或血清甘油三酯（TG）1.652.2mmol/L，均可作为备选对象，受试者最好为非住院的高血脂症患者，自愿参加试验。受试期间保持平日的生活和饮食习惯，空腹取血测定各项指标。但年龄在18岁以下或65岁以上者、妊娠或哺乳期妇女、对功能食品过敏者、合并有心、肝、肾和造血系统等严重疾病、精神病患者、短期内服用与受试功能有关的物品，影响到对结果的判断者、未按规定食用受试样品，无法判定功效或资料不全影响功效或安全性判断者不可作为人体试食试验对象。,（3）结果判定,动物实验 辅助降血脂结果判定 检测中血清总胆固醇和甘油三酯二项指标阳性，可判定该受试样品辅助降血脂动物实验结果阳性。辅助降低甘油三酯结果判定 甘油三酯二个剂量组结果阳性；甘油三酯一个剂量组结果阳性，同时高密度脂蛋白胆固醇结果阳性，可判定该受试样品辅助降低甘油三酯动物实验结果阳性。辅助降低血清总胆固醇结果判定 血清总胆固醇二个剂量组结果阳性；血清总胆固醇一个剂量组结果阳性，同时高密度脂蛋白胆固醇结果阳性，可判定该受试样品辅助降低血清总胆固醇动物实验结果阳性。,12.改善性功能作用,（1）试验项目交配试验有大鼠交配试验，小鼠交配试验；勃起试验。（2）试验原则评价改善性功能作用，应主要观察是否增强性功能及阴茎勃起功能。考虑到影响性功能的因素很多，而睾酮对性功能的维持具有重要意义，必要时可对血清睾酮水平进行测定。,（2）试验原则,动物实验和人体试食试验所列指标均为必测项目。动物实验选用脂代谢紊乱模型法，预防性或治疗性任选一种。用高胆固醇和脂类饲料喂养动物可形成酯代谢紊乱动物模型，再给予动物受试样品或同时给予受试样品，可检测受试样品对高脂血症的影响，并可判定受试样品对脂质的吸收、脂蛋白的形成、脂质的降解或排泄产生的影响。,（3）结果判定,交配试验和勃起试验中有一项试验结果为阳性，即可判定该受试物具有改善性功能的作用。,（三）影响因素,人的可能摄入量，除一般人群的摄入量外，还应考虑特殊的和敏感的人群（儿童、孕妇及高摄入量人群）。由于存在着动物与人之间的种属差异，在将动物试验结果外推到人时，应尽可能收集人群服用受试物后的效应资料，若体外或体内动物试验未观察到或不易观察到食品的保健效应或观察到不同效应，而有关资料提示对人有保健作用时，在保证安全的前提下，应按照有关规定进行必要的人体试食试验。在将本程序所列试验的阳性结果用于评价食品的保健作用时，应考虑结果的重复性和剂量反应关系，并由此找出其最小作用剂量。食品保健作用的检测及评价应由卫生部认定的保健食品功能学检验机构承担。,