蛋白质组研究技术.ppt
第三章 蛋白质组研究方法 Chapter 3 Research Methods in Proteomics,主 要 内 容,蛋白质研究方法的概述大规模的蛋白质分离技术高通量蛋白质鉴定技术,第一节 概述,一、蛋白质组的研究远比基因组的研究要复杂的多蛋白质的数目远大于基因的数目：基因的拼接和翻译后修饰蛋白质是动态/基因是相对静态的氨基酸种类远多于核苷酸种类技术手段上：基因研究有PCR、DNA自动测序技术、DNA微阵列技术等；蛋白质没有相匹配的技术,DNA分析（cDNA微阵列）与蛋白质分析（2-DE与质谱）方法的比较,二、蛋白质研究技术的发展双向电泳技术：1975年，OFarrel建立的；是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，一般能分离1000 3000个蛋白质点图像分析与大规模数据处理软件两种软电离质谱技术基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）与电喷雾电离质谱（electro-spray ionization mass spectrometry,ESI-MS）：可精确测定生物大分子的相对分子质量及多肽序列，使得微量快速的蛋白质鉴定得以实现双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术、质谱技术-蛋白质组研究的三大基本支撑技术。,三、蛋白质组研究步骤,2-D电泳高效柱层析分离蛋白质氨基酸组成分析、C-端或N-端氨基酸序列分析及MS鉴定所分离的蛋白质生物信息学数据库对鉴定结果进行存储、处理、对比和分析,蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离,蛋白质组研究策略,蛋白质组研究的基本技术路线,凝胶中的蛋白胶上原位酶切,四、新的蛋白质组研究技术定量蛋白质组学研究：同位素编码亲和标签技术（isotope-coded affinity tags,ICAT）和双色荧光技术等蛋白质相互作用：酵母双杂交技术、蛋白质复合物免疫分离与质谱鉴定技术；蛋白质分离于鉴定：多维色谱质谱联用技术翻译后修饰：蛋白质图谱展示与检测技术蛋白质表达：蛋白质芯片技术,第二节 大规模的蛋白质分离技术,蛋白质组学的目的：实现对一个基因组所编码的全部蛋白质及其相互作用的研究首要问题：蛋白质的有效分离理想的蛋白质分离方法：超高分辨率；可针对不同类型的蛋白质,一、二维凝胶电泳,1.2-DE的介绍：是目前唯一能够将数千种蛋白同时分离与展示的技术1.1 在2-DE中，蛋白质首先根据等电点的不同，在一向等电聚焦电泳中分离，接着被转移到二向SDS-聚丙稀酰胺凝胶上，再根据相对分子质量大小不同被分离1.2 固相化pH梯度（immobilized pH gradient,IPG）等电聚焦电泳技术；微量鉴定技术以及质谱技术灵敏度的提高1.3 不足：膜蛋白、碱性蛋白、低丰度蛋白的分离与检测；重复性以及规模化和自动化的问题等1.4 改进：2-DE样品的前处理；2-DE后的蛋白点的检测研究等,第一向进行等电聚焦（isoelectric focusing,IEF）,由于蛋白质具有两性解离和等电点特性，将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，会向与其所带电荷相反的电极方向移动。移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，并随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白迁移至其等电点pH位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚焦在一个很窄的pH梯度介质区域内。目前常使用预制胶条（IPG）用于蛋白质的等电聚焦分离，将聚焦好的IPG胶条在含有SDS的缓冲液中平衡第二向是将在IPG胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到SDS-PAGE凝胶上，根据蛋白质的相对质量或分子量大小与第一向相垂直的分离。样品经过电荷和质量两次分离后，得到等电点和分子量的信息,2.低丰度蛋白、膜蛋白的检测与样品预分离2.1 低丰度蛋白大部分的蛋白质是低丰度的蛋白质，而低丰度的蛋白质往往是执行重要生物功能的蛋白质密码子偏性（codon bias）:指生物体中编码同一种氨基酸的同义密码子的非均衡使用现象。密码子偏性系数（codon bias index）:CBI小于0.2的基因编码的蛋白质为低丰度蛋白质。酵母中2500个编码基因的CBI小于0.1。,一步法（one-extract-one-gel）：一步提取的细胞总蛋白在一块胶上进行电泳分离；高丰度蛋白加大上样量，但有限制窄范围的IPG胶条（2-3个pH单位）、非常窄范围的IPG胶条（约1个pH单位）：可以增加电泳胶的分辨率，加大样品的负载量，但存在超出pH范围的蛋白去除高丰度的蛋白质,蛋白质的检出限预染色方法、起始加样量的关系,以6107个细胞得到1mg可溶酵母蛋白计算。,2.2 膜蛋白膜蛋白是一些疏水性的蛋白质，在常规2-DE的提取液中的溶解度低，另外因聚焦而产生浓缩、聚集，从而使得膜蛋白很难融解并进入二向SDS-PAGE电泳，因此很难被检测到,2.3 样品预分离（pre-fractionation)2.3.1 分步提取法（sequential extraction）原理：蛋白质的溶解度差异采用3种不同的提取液进行分步提取和分别电泳；实际上是增加了融解性能不同的第三维分离,2.3.2 多间隔电离法（multi-compartment electrolyser）实质上是一种制备等电聚焦的方法。电泳装置由中间的聚焦室和两端的电极室组成。聚焦室由隔膜分成多个样品室。电极室内装电极，由阴阳离子交换膜将电解质与样品分开。操作时，将预分离的蛋白质混合物放进聚焦室中，随着等电聚焦电泳的进行，混合物中的蛋白质根据各自的等电点不同而聚焦到相应的样品室中并被分别收集,多间隔电离法示意图,3.碱性蛋白质的分离与检测3.1 很难被分开：商业化的IPG胶条的pH范围通常在3-10，等电点超过10的蛋白质很难被分开。目前已经有pH范围到12的IPG胶条，从而得到了部分的解决3.2 大部分的细胞提取物是酸性蛋白质：去除酸性蛋白质改善碱性蛋白质的分离与检测。可以采用刚才介绍的方法，制备等电聚焦预分离，将碱性蛋白质富集，再采用碱性pH梯度胶进行分离,4.IPG胶条的改进4.1 胶条的pH范围在不断变窄：改善了2-DE的分辨率，增加了上样量，从而提高了蛋白质的检出，而且可以针对不同样品选择不同的胶条4.2 胶条的pH范围也在不断扩大：改善了碱性蛋白质的分离4.3 不同长度的胶条：通常采用的是18cm的胶条，可以达到2000种以上蛋白质点的分辨率；24cm、40cm,5.高通量与自动化5.1 蛋白质组研究的高通量需要研究体系的自动化：集中在2-DE后的样品处理和蛋白质的识别5.2 自动点切割仪，自动样品处理机等：减少了手工操作，缩短了时间，提高了效率；提高了样品处理的重复性，避免了手工操作易产生的污染5.3 可同时运行12块胶的二向SDS-PAGE电泳槽已经研制成功并商品化,蛋白质识别过程的自动化流程,5.4 分子扫描（molecular scanner）：将一个固相化了胰蛋白酶的PVDF膜插入2-DE电泳胶和另一个PVDF膜之间，后一个PVDF膜作为收集膜。当对上述体系进行电转印时，胶上的蛋白质在向第一个PVDF膜迁移的过程中被胰蛋白酶酶切，酶切肽段穿过带有固相化胰酶的PVDF膜，被第二个PVDF膜收集。收集膜可直接用于MALDI-TOF-MS做肽质量指纹谱分析。实现了2-DE后的样品处理与质谱分析一体化；肽段数目低，使蛋白质特别是翻译后修饰蛋白质的识别与鉴定效率受到影响。,6.2-DE的局限性实验设计：样本间的异质性以及组织中多种细胞的并存，将影响实验结果的可靠性。激光捕获显微切割的方法（laser-capture microdissection,LCM）：单一细胞重复性：是2-DE方法存在的主要问题动态范围：有限的动态范围与低拷贝蛋白质的难以检测也是2-DE目前尚未完全解决的问题。放射性同位素标记,激光捕获显微切割示意图,蛋白质的丢失：疏水性蛋白质、分子质量大于100kDa的蛋白质通量和自动化：图像分析仍然是瓶颈,二、色谱质谱技术,1.二维色谱串连质谱技术（2D-HPLC-MS-MS）1.1 二维色谱分离蛋白质和多肽,2-DE与2D-HPLC的比较,二维色谱分离蛋白质的优势：快速；可分离各种蛋白质；样品在液相，馏分易收集；易于自动化；可做样品制备或浓缩二维色谱分离蛋白质有多种组合模式：第一维色谱一般是离子交换色谱/凝胶过滤色谱，第二维通常是反相色谱,scx阳离子交换柱,2D-HPLC分离体系示意图,缓冲液,废液,样品,反相柱,检测器,洗液流动相,反相柱1,反相柱2,流动相,废液,10通道切换阀,1.2 二维色谱串连质谱分离鉴定细胞蛋白质采用二维色谱串连质谱技术可以对蛋白质混合物进行直接分离与鉴定。样本蛋白质混合物-蛋白酶裂解-二维色谱分离-质谱分析鉴定蛋白质,色谱反相柱,质谱仪串连质谱测序,数据库检索匹配 蛋白质鉴定,蛋白质混合物二维色谱/质谱分析流程,样品,优势：识别和鉴定低丰度蛋白、膜蛋白、酸性蛋白、碱性蛋白以及相对分子质量大的蛋白质不足：通过蛋白质直接酶切得到的肽段混合物过于复杂，较难实现对细胞全部蛋白质的识别与鉴定,2.同位素标记（ICAT）-亲和色谱-质谱技术ICAT，isotope-coded affinity tagging：不但可以实现对细胞差异表达蛋白质的定量分析，而且可以大大简化被分析样品的复杂性ICAT方法的关键是ICAT试剂的应用：半胱氨酸,ICAT试剂示意图,方法：蛋白质进行ICAT试剂标记-蛋白酶切-亲和色谱分离（只有被同位素标记的肽段能被色谱柱保留）-进入质谱进行鉴定通过比较标记重链和轻链试剂肽段在质谱图中信号的强度，可以实现对差异表达蛋白质的定量分析，采用串连质谱技术测定肽段的序列，可以实现蛋白质的定性鉴定,ICAT亲和色谱质谱技术流程图,优势：可以实现对不同条件处理的细胞差异蛋白质的定量分析，而且大大简化了被分离样品的复杂程度不足：无法分析和鉴定不含半胱氨酸的蛋白质；试剂的高价位,三、一维电泳（色谱）质谱技术,1.一维SDS-PAGE电泳（色谱）质谱分离鉴定蛋白质复合物蛋白质复合物的分离与鉴定是功能蛋白质组研究的核心内容SDS-PAGE电泳结合MALDI-TOF-MS技术，或者蛋白酶切结合LC-MS-MS技术直接分离和鉴定蛋白质复合物被证明是一种有效的方法,蛋白质复合物一维电泳（色谱）质谱分析流程图,蛋白质复合物电泳（色谱）质谱分析流程图,2.一维IEF电泳质谱分离鉴定蛋白质与质谱方法相比，SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量误差大，分辨率差，更重要的是，很难获得翻译后修饰蛋白质相对分子质量变化的准确信息精确测定全细胞蛋白质的相对分子质量一维IEF电泳质谱：采用IPG胶条进行等电聚焦电泳，MALDI-TOF-MS对胶条进行表面直接分析。将一向IEF电泳与准确、灵敏、高分辨率的相对分子质量测定技术相结合，误差0.1-0.2,第三节 高通量蛋白质鉴定技术,一、生物质谱技术1.质谱技术：一百多年的历程，早期的质谱技术分析对象主要是小分子化合物，质量范围在几千以下2.20世纪80年代末期，产生了两项软电离质谱技术ESI和MALDI-TOF，具有高灵敏度（pmol）和高质量检测范围（几万到几十万Da）3.ESI：采用四级杆质量飞行器，所构成的仪器成为电喷雾（四级杆）质谱仪；其特点之一是可以和液相色谱、毛细管电泳等高效分离手段联用，因而可以实现复杂化合物分离与鉴定的联机操作,4.MALDI-TOF：常用飞行时间质量分析器，所构成的仪器成为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪；特点是对盐和填加物的耐受能力强，且操作简单，测定速度快，易于实现高通量，谱峰与样品成分的质量有一一对应关系，图谱容易解析5.离子阱（ion trap）质谱仪和傅立叶变换离子回旋共振（fourier transform ion cyclotron resonance,FTICR）质谱6.电喷雾四极杆飞行时间质谱仪：大大提高了仪器的分辨率和灵敏度7.带有串连质谱功能的MALDI-TOF质谱仪：引进了源后裂解或碰撞诱导解离装置，可进行肽序列测定,二、2-DE胶上蛋白质识别与鉴定技术,2-DE电泳,已知蛋白,蛋白质胶上原位酶切,MALDI-TOF-MS分析,肽质量指纹谱数据库检索,蛋白质鉴定,ESI-MS-MS分析,蛋白质鉴定,肽序列标签数据库检索,蛋白质从头测序,新蛋白,已知蛋白,易于实现高通量,特异性高，可实现分离、鉴定一体化操作,2-DE胶上蛋白质鉴定流程图,5060,2030,MALDI-TOF-MS：优点是易于实现高通量，适合于胶上蛋白质的高通量、大规模识别与鉴定；但不适合分析蛋白质混合样品或新蛋白，且准确度要求较高,ESI-MS-MS：优点是特异性高，且适合混合样品的蛋白识别与鉴定；与液相色谱相连可实现分离、鉴定一体化操作；但分析速度慢且操作复杂,三、生物质谱新技术带MALDI源的四极杆飞行时间质谱仪(MALDI QqTOF)将MALDI离子源与四极杆飞行时间串连质谱仪连接，从而实现了样品靶上的同一个样品在同一台质谱仪上的肽质量指纹谱分析与肽序列标签分析同时进行。已经成功用于2DE胶上蛋白质的鉴定,2.MALDI-TOF-TOF质谱仪该仪器将MALDI-TOF肽质量指纹谱分析的高通量与碰撞诱导解离（collision-induced dissociation,CID）获得的丰富碎片信息相结合，对同一样品相进行肽质量指纹谱分析，接着进行串连质谱分析，使得在微量样品水平上对蛋白质的鉴定在数秒内完成,四、结语,蛋白质组学的研究开辟了功能基因组学研究的新领域。一方面，蛋白质组研究为探索生生命的奥妙提供了崭新的思路和手段；另一方面，蛋白质组研究期待着新的技术方法的突破。随着基因组学与生物信息学技术的发展，政府投资与商业投入的加大，蛋白质组学研究必将在21世纪取得突破性的进展。,
