尿液蛋白质葡萄糖与酮体检测.ppt

尿液蛋白质、葡萄糖与酮体检测,长沙医学院临检教研室 陈丽华,目的要求,掌握：尿蛋白、尿糖定性试验和尿酮体Rothera改良法。熟悉：尿蛋白形成机制与分类、尿蛋白测定的质量控制。了解：尿酮体的产生。重点：尿蛋白、尿糖定性试验和尿酮体Rothera改良法。难点：质量控制,肾单位是肾的基本功能单位，由肾小体和肾小管组成。肾单位与集合管共同完成泌尿功能。,肾单位示意图,肾小球滤过膜有筛孔屏障和电荷屏障。葡萄糖可完全滤过，白蛋白难于滤过。,肾小球滤过膜示意图,影响肾小球滤过的因素：肾小球毛细血管血压。囊内压。血浆胶体渗透压。肾血流量。,近球小管重吸收葡萄糖示意图,重吸收葡萄糖的部位仅限于近球小管。近球小管重吸收葡萄糖有一定的限度。正常情况下葡萄糖被全部重吸收入血。,Na,G,脂肪酸 乙酰辅酶A,乙酰乙酸,丙酮,羟丁酸,酮体在肝细胞中的生成,羟丁酸,乙酰乙酸,乙酰乙酰CoA,丙酮,自肺、肾排出,乙酰CoA,酮体的氧化示意图,酮体肝内生成肝外利用,尿液蛋白质检查,一、概述,1.历史：1673年，弗雷德里克.德克斯(Frederick Dekkers)用加热醋酸酸化尿液方法测定尿液中的蛋白。1790年，弗兰西斯.贺母（Fancis Home）用硝酸法检测水肿患者尿液中的蛋白。1827年，理查德.伯瑞特（Richard Bright）用加热的方法检测肾病患者尿液中的蛋白,2.正常尿蛋白的含量和组成：尿蛋白总量为30130 mg/24h，一次随机尿为080mg/L。蛋白定性试验：阴性。主要成分是相对分子质量小的蛋白如2微球蛋白、2微球蛋白、溶菌酶等。3.蛋白尿：尿蛋白总量超过150mg/24h或100mg/L，蛋白定性试验：阳性。,二、病理性蛋白尿分类及原因,1、肾小球性蛋白尿：最常见（1）选择性蛋白尿：当肾小球损伤较轻时,以49万的相对分子质量中等的清蛋白为主，可伴抗凝血酶、转铁蛋白、糖蛋白及少量小相对分子质量的2M、Fc片断等。Pro:+-+.Pro大于3.5g/24h.最典型的是肾病综合症。,（2）非选择性蛋白尿,反映肾小球毛细血管壁有严重破裂损伤。以分子量较大和中等的蛋白质同时存在为主，Pro：。定量0.53g/L。多见于原发或继发肾小球疾病。,2.肾小管性蛋白尿:,感染、中毒引起。小分子蛋白质尿，Pro：。定量12g/L。常见于肾小管疾病。,3、混合性蛋白尿：肾小管和肾小球同时损伤，大中小Pro均增多。4、溢出性蛋白尿：指血液循环中，出现了以中、小相对分子质量为主的异常蛋白质，如：游离Hb、肌红蛋白、溶菌酶、本周蛋白等增多，经肾小球滤出，超过了肾小管的重吸收最大能力，而大量出现在尿中。Pro：。常见于MM。5、组织性蛋白尿：肾组织代谢产生、组织破坏分解的、炎症或药物刺激泌尿系统分泌的蛋白质等。Pro：；多为TH糖蛋白,三、生理性蛋白尿,1.功能性蛋白尿：剧烈运动、发热、寒冷刺激、精神紧张、交感神经兴奋等，多见与青少年。2.体位性蛋白尿：又称直立性蛋白尿，特点：卧位时尿蛋白阴性，起床活动或久立后，尿蛋白阳性，平卧后又阴性。多见于发育期少年。3.偶然性蛋白尿：又称假性蛋白尿，混入多量血液、脓液、粘液或生殖系统分泌物，如：白带、月经血、精液、前列腺液等。,尿蛋白,血浆蛋白,组织蛋白,肾小球性,肾小管性,混合性,溢出性,组织性,泌尿系统、泌尿外系统,肾病综合征、肾病性蛋白尿,原发、继发肾小球疾病,肾小管间质病变、中毒性肾病,浆细胞病、血管内溶血、肌肉损伤,肾脏疾病、炎症、中毒、泌尿道结石,泌尿道、生殖道炎症、出血、排泌物污染,四、蛋白质定性检测方法,（一）加热乙酸法1.原理：加热煮沸使蛋白变性、凝固，然后加酸使尿液pH接近尿蛋白质等电点，在含有适量无机盐状况下，蛋白质更易于变性沉淀。加酸还可溶解因加热析出的磷酸盐或碳酸盐结晶所致的混浊。2、材料：酒精灯、试管、试管夹、滴管3、试剂：醋酸,（一）加热乙酸法,4.操作：（1）取大试管1支，用试管夹夹住管底部，加尿液至试管2/3处。（2）斜持试管下端，在酒精灯上加热下1/3处，煮沸即止。（3）加5%乙酸23滴，再煮沸后立即观察结果。（4）结果判断如下：,实验结果 结果判断 相当含量（g/L）清晰透明无-0改变黑色背景下，0.10.15极轻度混浊明显白色雾状，+0.20.5 但无颗粒明显混浊，+0.62.0出现颗粒大量絮状沉淀+2.05.0但无凝块严重混浊，+5.0 有大凝块,5.注意事项,（1）操作程序要对：加热 加酸 再加热。（2）加入醋酸量要适当，pH9或pH3可以产生假阴性。（3）加热时使底部受热，上部好作对照。（4）加热时管口勿对别人。,加尿液1ml,判断结果,（二）磺基水杨酸法,1.原理：在酸性条件下，磺基水杨酸的阴离子和蛋白质氨基酸阳离子结合，形成不溶性蛋白盐沉淀。2.操作：,加尿液1ml,加磺硫酸2滴,1分钟内判断结果,同加热乙酸法,3.注意事项本试验方法灵敏度高，极微浑浊无意义。判断结果需及时。尿酸盐和尿酸过多，可出现假阳性。尿内含碘造影剂、大剂量青霉素等可使反应呈假阳性。,（三）试带法,原理：pH指示剂的蛋白误差原理试剂模块中含有酸碱指示剂溴酚蓝,pH阈值3.0(黄色）4.6（蓝紫色）。pH3.2时，溴酚蓝产生阴离子，与带阳离子的蛋白质（清蛋白）结合形成复合物，发生颜色变化。从淡黄色变成绿色甚至是蓝色。根据颜色变化可目测也可用尿液分析仪判读结果。,五、蛋白质定性检查参考值：阴性,1、加热醋酸法：（1）特异性强，干扰因素少，能同时检出A、G，但敏感性较低，一般在0.15g/L左右；（2）为蛋白定性确证实验。,六、蛋白质定性检查方法学评价,（3）加热乙酸法干扰因素及控制：,尿液偏碱（pH9）或偏酸（pH3）时呈假阴性，故试验前应先将尿液pH值调至56.尿液离子强度低（无盐或低盐饮食者）时，可呈假阴性。可在标本中滴加饱和NaCl溶液12滴后再进行试验。尿中混有生殖系统分泌物时，可出现假阳性，故用中段尿或离心后取上清液检测。加热加酸再加热后，立即判读结果。,2、磺基水杨酸法,（1）操作简单，反应灵敏、结果显示快，灵敏度可达0.050.1g/L。（2）A、G、TH糖蛋白和本周氏蛋白均呈阳性发应；（3）适于蛋白尿筛选试验，为干化学法的参考方法。（4）本法阴性可靠，阳性需进一步鉴别。,（5）磺基水杨酸法干扰因素及质量控制,尿液pH值9或pH3时呈假阴性，故试验前应先将尿液pH值调至56.大剂量青霉素钾盐、庆大霉素、磺胺、含碘造影剂时可出现假阳性。尿中混有生殖系统分泌物时，可出现假阳性，故用中段尿或离心后取上清液检测。判断结果应于1分钟内。,3.试带法,（1）本法快速、简便、易于标准化，可肉眼观察结果，也可用于尿液自动分析。（2）对A敏感，对G不敏感，可漏检本周氏蛋白。（3）适于健康普查或临床筛检，不适用于肾病疗效观察及预后判断和泌尿系统其他疾病的筛选。,（4）试带法干扰因素和质量控制,pH影响：pH9时，呈假阳性；pH3时，呈假阴性。故试验前应先将尿液pH值调至56.食物因素：检验前一天宜均衡饮食。药物因素：假阳性：奎宁、嘧啶或尿中含磷酸盐、季胺盐等。假阴性：青霉素、庆大霉素、磺胺、含碘造影剂。操作：试带浸渍时间过长，假阳性；过短或太长以至模块中试剂消失，假阴性。,小结：一些干扰因素的影响,加热乙酸法 磺基水杨酸法 试带法pH9 假阴性 假阴性 假阳性 pH3 假阴性 假阴性 假阴性 青霉素 假阳性 假阴性,七、临床意义,1、生理性蛋白尿 定性试验：不超过；定量试验：小于0。5g/L（1）功能性蛋白尿：（4）偶然性蛋白尿：（2）直立性蛋白尿：（5）老年性蛋白尿：（3）摄入性蛋白尿：（6）妊娠性蛋白尿：,2.病理性蛋白尿,（1）肾前性蛋白尿：浆细胞病；血管内溶血；大面积肌肉损伤；酶类增多等。（2）肾性蛋白尿：1）肾小球性蛋白尿：肾病综合症；原发性肾小球肾炎；继发性肾小球肾炎。2）肾小管性蛋白尿：肾小管间质病变；重金属中毒；药物中毒；器官移植等。（3）肾后性蛋白尿：泌尿、生殖系统炎症；泌尿系统结石、结核、肿瘤等；泌尿系统邻近器官疾病；其他病理性蛋白尿等。,尿葡萄糖检测,一、概述,1.糖尿:尿糖定性试验呈阳性的尿液。主要指葡萄糖。2.是否出现糖尿取决于3个因素:动脉血液中葡萄糖浓度每分钟流经肾小球的血浆量近端肾小管上皮细胞重吸收葡萄糖的能力,二、尿葡萄糖测定的方法,（一）班氏法（Benedict法）1.原理 含有醛基的葡萄糖具有还原性，在高热及碱性溶液中能将蓝色的硫酸铜还原为黄色的氢氧化亚铜及红色氧化亚铜，出现黄色至砖红色沉淀物。葡萄糖+硫酸铜 氢氧化亚铜 氧化亚铜2.试剂 班氏定性试剂3.操作 如下,OH-,-CHO-,黄色,红棕色,蓝色,加班氏试剂1ml,加热,取尿液0.1ml加入上述试剂中,再加热,冷却,判断结果,4.尿糖定性结果判断:实验结果 结果判断 相当含量（g/L）仍呈蓝色-蓝绿色，无沉淀 0.1 绿色，有少量+0.10.5绿黄色沉淀黄绿色，有较多+0.51.0沉淀土黄色，有大量+1.02.0沉淀砖红色沉淀，上+2.0清液无色,5.注意事项,（1）试剂：尿液的比例为10:1,改变比例将影响灵敏度和结果。（2）糖尿病患者应于空腹或餐后2小时留尿标本检验。（3）存在大量尿酸盐时，煮沸后可呈绿色但久置后不变黄而呈灰蓝色，因此必须冷后观察结果。,5.注意事项,（4）尿中非糖还原性物质过多，如链霉素、青霉素、水杨酸、水化氯醛、VitC、中药大黄、黄岑等可呈阳性反应。所以应停3天后留标本检测，如静注VitC 5天内不宜做尿糖测定。（5）蛋白含量过高，可影响尿糖定性测定，应用加热乙酸法除去蛋白后再进行检验。,6.方法学评价,为非特异性试验，可测定尿中所有的还原性物质，因此，尿中其它糖如果糖、乳糖和戊糖和一些还原性药物如氯醛、氨基比林、阿斯匹林、VitC和青霉素等都可出现假阳性。已逐渐被葡萄糖氧化酶试带法取代。7.参考值：阴性,（二）干化学试带法,采用葡萄糖氧化酶法原理进行。1.原理：,葡萄糖氧化酶试带法：葡萄糖+H2O+O2 葡萄糖氧化酶 葡萄糖酸+H2O2 H2O2+色原剂 过氧化物酶 有色物质（常用的色源剂有邻联甲苯胺、碘化钾、氨基比林）,2.方法学评价（1）特异性强，灵敏度高，方法简单快捷可用于目视比色和自动化分析（2）干扰因素：假阳性：a.尿标本容器残留强氧化性物质如漂白粉等；b.尿比密过低；假阴性：a.标本久置葡萄糖分解；b.尿酮体浓度过高。c.VitC、L-多巴、水杨酸、氟化钠。,（三）薄层层析法,1.原理：在层析法中有固定相和流动相，两相间可做相对流动。当样品中各种糖随流动相通过固定相时，即反复发生吸附、脱附、解析或其他亲和作用，由于各种糖在上述性能上的差异而产生移动速度的差异，而相互分离。2.方法学评价：可作为确证试验。是鉴定非葡萄糖的还原性糖的首选方法。操作繁杂、费时，成本高，多用于临床和基础研究。,三、质量控制,1.检测前：容器、标本、消除VitC干扰。2.检测中：做好室内质控，严格遵循标准化操作规程。3.检测后：报告审核，与临床联系。,氧化酶试纸法阴性，班氏试剂（还原）实验法阳性 试纸质量问题 葡萄糖以外的其他还原糖 尿液中含有较高浓度的还原性物质 存在少量葡萄糖伴有高浓度的还原物质氧化酶试纸法阳性，还原实验法阴性 尿液标本被过氧化物或者次氯酸盐污染,四、尿糖测定结果分析：,五、临床意义,1.血糖增高性糖尿：糖尿病性糖尿。其他内分泌异常：如甲亢。应激状态：脑血管意外、突然情绪紧张。饮食因素：一次性摄食过多糖。2.血糖正常性糖尿：即肾性糖尿。见于慢性肾小球肾炎、肾病综合征、新生儿糖尿等及妊娠晚期。3.其他糖尿：乳糖、半乳糖、果糖、戊糖等。,尿糖检查的临床意义,糖尿,非葡萄糖尿,葡萄糖尿,胰岛外性糖尿,生理性糖尿,摄食性糖尿,妊娠性糖尿,神经精神性糖尿,病理性糖尿,真性糖尿,半乳糖尿,果糖尿,戊糖尿,其他糖尿,尿液酮体检查,酮体：脂肪酸分解代谢的中间产物 丙酮 2%乙酰乙酸 20%-羟丁酸 78%酮血症酮尿,一、尿液酮体检测原理,（一）亚硝基铁氰化钠法原理 尿中丙酮和乙酰乙酸在碱性溶液中与亚硝基铁氰化钠反应生成紫色化合物（注：不与酮体中-羟丁酸检测)。,基于亚硝基铁氰化钠法原理的尿酮体检测,1.试带法 2.Lange法（朗格法）3.Rothera法4.改良Rothera法（酮体粉法）5.片剂法,改良Rothera法（酮体粉法）,试剂酮体粉：亚硝基铁氰化钠0.5g（粉红色颗粒），无水碳酸钠10g，硫酸铵10g，混合并研磨均匀，密闭于棕色磨口瓶内，严防受潮。操作 向玻片或试管中加1小勺酮体粉。滴加尿液于酮体粉上，至完全浸润。结果观察：5分钟内出现紫色为阳性。结果判定如下表：,表 尿酮体定性结果判断标准,反应表现 结果 报告方式立即出现深紫色 强阳性 3+4+立即出现淡紫色 阳性 2+逐渐出现淡紫色 弱阳性+5分钟内无颜色改变 阴性-参考值 阴性,注意事项,标本应新鲜：由于尿酮体中的丙酮和乙酰乙酸都具有挥发性，乙酰乙酸更易受热分解成丙酮；尿液被细菌污染后，酮体消失，因此尿液必须新鲜，及时送检，以免因酮体的挥发或分解出现假阴性结果或结果偏低。,注意事项,不同方法灵敏度的差异：干学法与酮体粉法灵敏度存在差异，故同一病理标本两种方法可能出现结果的差异，分析结果时应特别注意。,注意事项,根据病程分析结果：早期，主要酮体成分羟丁酸，很少或缺乏乙酰乙酸，此时测得结果可导致对总酮体量估计不足。在糖尿病酮症酸中毒症状缓解之后，-羟丁酸转变为乙酰乙酸，反而使乙酰乙酸含量比初始急性期增高，易对病情估计过重。因此检验人员必须注意病程发展，与临床医生共同分析实验结果。,方法学评价,1.灵敏度：不同方法对各种成分灵敏度不一致。本法与乙酰乙酸发生强反应，与丙酮发生弱反应，与-羟丁酸不反应。2.干扰因素（1）假阳性：尿中含多量肌酐、肌酸，高色素尿，尿中含酞、苯丙酮、左旋多巴代谢物等。,方法学评价,（2）假阴性：标本收集和保存不当，亚硝基铁氰化钠失效，大量维生素C，糖尿病酮症酸中毒者肾功能严重受损而肾阈值升高时，尿酮体可减少，出现加阴性。乙酰乙酸和丙酮不稳定，易分解或挥发导致假阴性。,（二）Gerhardt法：尿中乙酰乙酸的检测：试验原理：尿液中的乙酰乙酸与氯化高铁作用形成赭红色（酒红色）乙酰乙酸铁化合物。该法对乙酰乙酸测定的敏感度为700mg/L，尿液久置后乙酰乙酸可转变为丙酮，使结果偏低。尿液中的酚类、安替比林、水杨酸盐和重碳酸钠等药物可呈假阳性反应。,附：-羟丁酸检测(分光光度法）：-羟丁酸+NAD 乙酰乙酸+NADH(烟碱辅酶腺嘌呤二核苷酸)在乳酸脱氢酶抑制剂存在下，加入-羟丁酸脱氢酶和NAD，测定340nm NADH增加的速度。,-羟丁酸 脱氢酶,意义：-羟丁酸的肾阈值比较高，如尿中出现较多-羟丁酸。表明酮血症加重。,二、临床意义,1.糖尿病酮症酸中毒。早期诊断 治疗监测。新生儿：出现尿酮体强阳性，应怀疑为遗传性疾病。2.非糖尿病性酮症者：（1）碳水化合物摄入不足（2）碳水化合物丢失 3中毒：（1）如氯仿、乙醚麻醉后、磷中毒等（2）服用双胍类降糖药（如降糖灵）等。4.其他：应激状态，感染性疾病如肺炎、伤寒、败血症、结核等发热期，严重腹泻、呕吐包括妊娠反应性、全身麻醉后等均可出现酮尿。,当一些原因引起肾糖阈下降时，尿中也可出现尿糖。这些原因包括：1.30%的孕妇会出现生理性肾糖阈下降；2.另外肾小管病变也可导致肾糖阈下降（如家庭性肾性糖尿、范可尼综合症、肾小管酸中毒，葡萄糖重吸收障碍，肾病综合症时有糖尿）；3.由于进食过多的半乳糖、甘露糖、果糖、乳糖以及一些糖，在体内代谢失常时可出现相应的糖尿。颅脑外伤、脑血管意外、急性心肌梗塞等，由于肾上腺素释放出现应激性糖尿。4.尿酸、维生素C、葡萄糖醛酸，或一些随尿排泄的药物，异烟肼、青霉素、强心甙、噻嗪类利尿剂，在尿中浓度升高时，使尿糖假阳性。,