分子生物学-定点诱变与蛋白质工程.ppt

第九章 定点诱变与蛋白质工程,蛋白质在生命现象中具有重要作用，在医药、轻工等行业也具有重要作用，如胰岛素、枯草杆菌蛋白酶等；天然生物材料中蛋白质含量较少；基因克隆技术克隆基因，在宿主细胞中可表达特定蛋白质（重组蛋白）；多数天然蛋白质的理化特性不能适应于工业用途;利用现代分子生物学技术，改变克隆基因中的特定基因，即可表达出适合于商业用途的蛋白质。,在体外，通过碱基取代、插入或缺失的方法，使基因DNA序列中的某个特定碱基发生改变，从而改变蛋白质的结构，称为蛋白质工程。通过蛋白质工程，人们可以随心所欲地改变蛋白质的结构及其理化性质和生物学功能。例如，我们可以利用蛋白质工程改变酶的Km、Vmax，酶促反应的最适温度、最适pH值、酶促反应的特异性以及酶蛋白的稳定性等。蛋白质工程的主要技术之一是定点诱变技术.,第一节 定点诱变,一、定点诱变的概念,利用分子生物学技术，在体外通过碱基取代、插入或缺失可以使基因DNA序列中任何一个特定的碱基发生改变。这种体外特异性改变某个碱基的技术，称谓定点诱变（site directed mutagenesis）。定点诱变具有简单易行、重复性高等优点，现已发展成为基因操作的一种技术。这种技术不仅适用于基因结构与功能的研究，还可通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质。,二、基因定点诱变的意义,用于研究基因的结构与功能；通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质，使其更符合人们的需要。如酶蛋白的改造以及新型疫苗或药物的开发。,如枯草杆菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是由于催化部位的丝氨酸(Ser221)邻近的甲硫氨酸(Met222)易被氧化成硫氢化物，若以其他氨基酸取代Met222，则可提高酶的氧化稳定性而又不影响其催化活性。这是结构分析和定点突变改造蛋白质的成功范例。枯草杆菌蛋白酶可作为洗涤剂的添加剂，但由于其只能水解苯丙氨酸(Phe)羧基所形成的肽键，底物作用范围过窄而限制了洗涤剂的高效性，若用带正电荷的赖氨酸(Lys)取代位于活性中心166位的甘氨酸(Gly)，所获得的突变酶不仅能水解苯丙氨酸(Phe)羧基所形成的肽键，而且可以水解酸性氨基酸谷氨酸(Glu)所形成的肽键，使其底物作用范围拓宽，因而可能成为最高效的洗涤剂添加酶，这是定点诱变改变蛋白质生物学活性的成功例子。N端-笨丙-天冬-谷-甘-C端 多肽链,三、定点诱变的原理,定点诱变原理示意图,The Nobel Prize in Chemistry 1993,for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry,for his invention of the polymerase chain reaction(PCR)method,for his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based,site-directed mutagenesis and its development for protein studies,Kary B.Mullis,1/2 of the prize USA 1/2 of the prize Canada,Michael Smith,四、定点诱变的常用方法,（一）M13DNA寡核苷酸诱变,基因工程中,噬菌体是一种常用的基因载体,其中又以M13 和为最常用。M13噬菌体是一种环形DNA，基因组大小为6.4kb，在颗粒中包装的仅是正链的DNA，有时也称为感染型单链DNA(single stranded DNA,ssDNA)。当感染型单链M13噬菌体感染大肠杆菌后，在菌体内借助宿主的酶系统先把ssDNA复制为双链（dsDNA），称为复制型（replication form,RF）M13（RF-M13）。广泛用于DNA序列分析和噬菌体表面展示系统（phage display)和单链核酸的制备。,单链丝状噬菌体(M13噬菌体),1.基本原理：,寡核苷酸定点诱变技术所依据的原理是:首先制备单链核酸,即按体外DNA重组技术，将待诱变的目的基因插入到M13噬菌体上，制备此种含有目的基因的M13单链DNA，即正链DNA。再使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段作引物，启动M13单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为新合成的DNA子链的一个组成部分。因此所产生的新链便具有已发生突变的碱基序列,将其转入细胞后,经过不断复制,即可获得突变的DNA分子,再经表达即可获得改造后蛋白质.为了使目的基因的特定位点发生突变，所设计的寡核苷酸引物的序列除了所需的突变碱基外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补。,2.诱变过程,1)合成含有目的基因的正链DNA；2)合成含有特殊突变碱基的引物；3）制备异源双链DNA（右图）；4）富集和转化双链DNA分子；5）筛选突变体并鉴定,（二）Kunkel定点诱变法,体外DNA合成往往是不完全的，所以部分合成的DNA分子必须通过蔗糖密度梯度离心除去,获得纯化的突变DNA。理论上来说，DNA是半保留复制的，应用寡核苷酸定点诱变时，所形成的噬菌体中携带突变基因的应为一半。但实际上，由于技术上的原因通常只有1-5%的噬菌斑含有突变基因的噬菌体。,因此，为了获得更多含有突变噬菌体的噬菌斑，必须提高突变体的比率。目前已有多种改良的寡核苷酸定点诱变方法，此处将Kunkel 1985年建立的方法做以简单介绍。,基本原理：Kunkel定点诱变法是一种通过筛除含有尿嘧啶(U)的DNA模板链进行的寡核苷酸定点诱变法。它的基本原理是:将待突变的基因克隆入RF-M13 DNA载体上，导入含有dUTP酶（dut）和N-尿嘧啶脱糖苷酶（ung）双缺陷的大肠杆菌（dut-，ung-）菌株中。(细胞内的dUTP酶能将细胞内的dUTP降解,使其含量减少;ung能将误入DNA新生链中的dUTP切除.在dut和ung双缺陷的大肠杆菌中,新合成的DNA链中含有U.)dut缺陷导致细胞内dUTP水平上升，并在DNA复制时，部分取代dTTP进入DNA新生链中。又由于ung缺陷使掺入DNA的dUTP残基不能除去。由这种大肠杆菌菌株产生的M13单链DNA大约有1%的T被U所取代，然后 以其为模板体外合成DNA的另一条链(不含U)，双链DNA导入正常的大肠杆菌中，其N-尿嘧啶脱糖苷酶切去DNA链上的尿嘧啶碱基。结果原来的M13模板链被降解。只有突变链因不含U，被保留下来。这种方法产生的M13噬菌体中含有突变DNA的比例大大增加。,Kunkel定点诱变示意图,（三）PCR定点诱变,Polymerase Chain Reaction（PCR）是一种体外酶促合成特定DNA片断的技术，是根据人类的需要对复杂生命过程的一种简单化的模拟。PCR技术的原理是DNA半保留复制。Kari.B.Mullis首创。,PCR原理简介,The principle：以待扩增的DNA分子为模板，DNA变性后，以一对分别与模板5末端和3末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。反应体系的基本成分模板DNA、特异性引物、耐热性DNA聚合酶、dNTP、含Mg2+的缓冲液。,包括如下基本反应步骤：变性(denaturation:Heat to 95 to melt strands)，将反应系统加热至95，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除；退火(annealling:Cool to55 to anneal primers with template strand)，将温度下降至适宜温度（55左右）使引物与模板DNA退火结合；延伸(extension:Extend primers with Taq polymerase)，将温度升至72，DNA聚合酶以dNTP为底物摧化DNA的合成反应。上述三个步骤称为一个循环，新合成的DNA分子继续作为下一轮合成的模板，经多次循环（25-30次）后即可达到扩增DNA片段的目的。,5.AAGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA.33.TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT CACGT.5 变性 退火(杂交)5.AAGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA.3 ATTCGT 5 引物 5 AGGCTT3.T TCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT CACGT.5 延伸5AAGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA.3 TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT 5 5 AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA.3.T TCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGTCACGT.5,5AAGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA.3 TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT 5 5AAGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA.3 ATTCGT 5 5 AGGCTT TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT 5 5AAGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA.3 TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT 5 5 AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA 3 TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT 5,5 AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA 3 3 TCCGAAACGGCTATCCGGT ATTCGT 5 变性 退火5 AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA 3 ATTCGT 55 AGGCTT3 TCCGAAACGGCTATCCGGT ATTCGT 5 延伸5 AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA 3 3 TCCGAAACGGCTATCCGGT ATTCGT 55 AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA 3 3 TCCGAAACGGCTATCCGGT ATTCGT 5,PCR定点诱变又称为PCR寡核苷酸定点诱变，该法具有简单、快捷的特点，其基本原理及操作程序如下：将待诱变靶基因克隆到质粒载体上，并分装到两个反应管中；在每一个反应管中加入两种特定的引物，其中引物1和3均含有错配核苷酸，但两个引物分别与质粒DNA的不同链不完全互补，引物2和4均不含有错配核苷酸，二者分别与质粒DNA的引物1和3杂交链的互补链完全互补；进行PCR扩增获得含有突变碱基的线型质粒DNA；将两个反应管中的线型质粒DNA混合，再经过变性和复性，一个反应管中的一条链和另一个反映管中的互补链杂交，通过两个粘性末端形成带有缺口的环状DNA分子；转化入大肠杆菌，环状DNA分子的缺口可被大肠杆菌修复。如果同一反应管中的两个互补链又互相杂交，则继续形成线状DNA分子，在大肠杆菌中不稳定，易被降解。该方法把特异突变点导入克隆基因，无需把基因插入M13中，即可在大肠杆菌中进行表达。,PCR进行寡核苷酸定点诱变的示意图,第二节 蛋白质工程,一、蛋白质工程概论,基因工程诞生10周年之际著名科学家Kevin M.Ulmer于1983年在SCIENCE(VOL.219)发表了论文Protein Engineering,该文的摘要是:The prospects for protein engineering,including the roles of x-ray crystallography,chemical synthesis of DNA,and puter modeling of protein structure and folding,are discussed.It is now possible to attempt to modify many different properties of proteins by bining information on crystal structure and protein chemistry with artificial gene synthesis.Such techniques offer the potential for altering protein structure and function in ways not possible by any other method.该文的发表标志着作为生物工程三大技术之一的蛋白质工程诞生了。,（一）蛋白质工程的概念 Protein Engineering,蛋白质工程是在重组DNA技术应用于蛋白质结构与功能研究之后发展起来的一门新兴学科。所谓蛋白质工程，就是通过对蛋白质已知结构和功能的了解，借助计算机辅助设计，利用基因定点诱变等技术，特异性地对蛋白质结构基因进行改造，产生具有新的特性的蛋白质的技术，并由此深入研究蛋白质的结构与功能的关系。蛋白质工程是在遗传工程取得的成就的基础上，融合蛋白质结晶学、蛋白质动力学、计算机辅助设计和蛋白质化学等学科而迅速发展起来的一个新兴研究领域，它开创了按照人类意愿设计制造符合人类需要的蛋白质的新时期，因此，被誉为第二代遗传工程。蛋白质工程的出现，为认识和改造蛋白质分子提供了强有力的手段。,（二）蛋白质工程的理论基础,1.工、农业以及医药卫生事业的高速发 展为蛋白质工程的开展开拓了广阔应用前景2.蛋白质结构与功能关系研究技术的建立推动了蛋白质结构与功能关系的研究，从而为蛋白质改造提供了理论依据3.基因工程理论和技术的发展，为蛋白质的改造和生产提供了必要的技术手段,1.工、农业以及医药卫生事业的高速发展 为蛋白质工程的开展开拓了广阔应用前景,酶的专一性强，在温和条件下能有效地催化化学反应的能力，使酶的应用日益广泛。药品、化学、食品工业及分析服务行业是酶开发的重要领地。妨碍酶开发利用的原因主要有：生物材料中酶含量甚少，用传统方法分离纯化酶蛋白成本太高；酶蛋白分子结构的稳定性差，过酸、过碱、高温、氧化等因素可破坏其结构，使其丧失生物活性，因而在工业加工条件下，酶的半衰期短，利用率低；酶催化活性的最适pH值及底物专一性的范围较窄，与工业应用的要求有较大差距。因此，要想扩大酶蛋白的开发利用，需要建立适当的方法，以改善酶蛋白的生物特性，使之适合于工业应用的需求。,2.蛋白质结构与功能关系研究技术的建立推动了蛋白质结构与功能关系的研究，从而为蛋白质改造提供了理论依据,蛋白质工程的重要目标之一，是通过改造蛋白质的结构来提高其开发利用的价值。这就是说，蛋白质的结构改变了，其生物学功能不能变。蛋白质结构与功能关系的研究表明，蛋白质功能部位的几个氨基酸残基决定着蛋白质的功能，但是这几个负责功能的氨基酸残基必须处于一个极其精密的空间状态下才能发挥功能。只要能维持蛋白质结构域的必须氨基酸及其空间构象不变，其功能域的生物学活性就会保持不变。,因此在对蛋白质进行改造之前必需对其结构与功能的关系进行充分地研究，了解影响蛋白质特性的氨基酸或氨基酸序列是哪些？改变这个（些）氨基酸是否会影响蛋白质的功能？因此阐明蛋白质的三维结构，进而研究其与生物学功能的关系已成为了解生命现象的关键，并成为蛋白质工程的基础。蛋白质结构与功能关系研究技术主要包括蛋白质晶体学、蛋白质动力学、生物信息学等。,3.基因工程理论和技术的发展，为蛋白质的改造和生产提供了必要的技术手段,随着基因工程理论和技术的发展，人们已经能克隆特异蛋白质的基因，并令其在适宜宿主菌中表达，使蛋白质的产量大大提高，因而降低蛋白质纯化成本的问题已基本解决。重要的问题是提高酶蛋白的稳定性，改良其生物学特性。,稳定蛋白质空间构象的主要因素是蛋白质分子众多基团间的相互作用，如肽键和侧链间的氢键、带有不同电菏的侧链间的静电作用、极性氨基酸残基侧链间的偶极作用、疏水残基间的疏水作用以及分子内的二硫键等。蛋白质结构与功能研究表明，上述稳定蛋白质空间构象的因素是由蛋白质一级结构中某一个或某一段氨基酸序列决定的，人工改变或修饰这些氨基酸残基，有可能增加蛋白质的稳定性，又不影响其生物学活性。如野生型枯草杆菌蛋白酶的218位天冬酰胺(Asn)是酶活性部位有关的氨基酸残基，若将其变成丝氨酸(Ser)，用65的失活半衰期衡量，从59分钟增到223分钟，酶的稳定性显著增加。再如氧化失活使枯草杆菌蛋白酶在工业上的应用受到严重限制。很早就有人证实枯草杆菌蛋白酶在少量H2O2作用下很快失活是由于埋藏在催化部位Ser221邻近的蛋氨酸(Met222)氧化成硫氢化物的原因。1985年Wells证明若用其他氨基酸取代Met222，可以提高酶的氧化稳定性而又保持高催化活性。,目前我们已经能对蛋白质的结构进行改造，甚至于能制造出全新的蛋白质，这得益于分子生物学理论与技术的发展。20世纪70年代初期，DNA重组技术诞生，并成功地应用于基因操作，从而产生了基因工程(73年)。而基因工程的诞生，特别是DNA重组技术和定点诱变技术的建立，使我们有可能从基因水平改造蛋白质分子中氨基酸的序列，为蛋白质工程的诞生(83年)，奠定了技术基础。,(三)蛋白质工程的研究内容,1.利用已知蛋白质一级结构的信息作为应用研究2.定量研究蛋白质结构与功能的关系3.根据已知结构-功能的关系人工改造蛋白质,1.利用已知蛋白质一级结构的信息作为应用研究,蛋白质的结构决定蛋白质的功能和理化性质，而蛋白质功能区的某个或某些氨基酸残基可能在维持蛋白质的结构、功能、理化性质中起重要作用。因此，定点改变这些氨基酸序列，即可能改变蛋白质的功能和特性，使之更适合于工业化生产的要求。如前所述枯草杆菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是由于催化部位的Ser221邻近的Met222易被氧化成硫氢化物，若以其他氨基酸取代Met222，则可提高酶的氧化稳定性而又不影响其催化活性。这是结构分析和定点突变改造蛋白质的成功范例。,2.定量研究蛋白质结构与功能的关系,这是目前蛋白质工程研究的主体。这一类研究的课题很广泛，包括蛋白质三维结构模型的建立，配体结合和酶催化的性质，蛋白质折叠和稳定性研究，蛋白质变异等等。这类研究看起来偏重理论，但对于指导实际工程意义重大。,3.根据已知结构-功能关系人工改造蛋白质,根据蛋白质结构和功能的关系，采用基因定点诱变技术，人工改造蛋白质则是蛋白质工程的主要研究内容之一。其主要研究内容如下：通过改变蛋白质的活性部位，提高其生物功效及独立工作的能力；通过改变蛋白质的结构顺序，提高其在极端条件（如酸、碱、热等）下的稳定性；通过改变蛋白质的结构顺序使其便于分离纯化。这项研究虽然难度较大，但随着人类基因组研究、后基因组研究的不断深入和完善，随着蛋白质工程研究技术和手段的不断发展，该项研究必将获得丰硕的成果。,蛋白质工程的程序分离纯化0.11.0mg纯蛋白质，测定其部分肽段一段结构，根据编码原则合成相应同位素标记的寡苷酸探针;以此从基因库中分离编码该蛋白质的克隆化基因，转入噬菌体M13系统，用双脱氧末端终止法进行DNA序列分析;通过表达载体获得较大量(0.11.0克)该蛋白质用于空间结构测定及结构与功能研究，借助计算机提出分子预测性质及改造方案;通过寡核苷酸M13系统定点诱变并分离其突变体，引入表达载体生产并纯化多量突变性蛋白质，分析其性质指导进一步分子设计，以最终获得所预期性质的分子。,二、定点诱变在蛋白质工程中的应用的举例,（一）加入二硫键增加蛋白质的稳定性,蛋白质分子中两个半胱氨酸残基上的巯基（SH）之间氧化脱氢即形成二硫键（）。二硫键的数量与蛋白质的稳定性有关，增加蛋白质分子中的二硫键，可提高蛋白质分子的热稳定性、有机溶剂稳定性和酸碱稳定性。在一项研究中，通过寡核苷酸定点诱变构建了T4溶菌酶的六种变异体,比较了它们的活性.,表41 T4溶菌酶和6种设计的变体特性酶 氨基酸的位置 二硫键的数目 相对活性 Tm 3 9 21 54 97 142 164(%)()wt Ile Ile Thr Cys Cys Thr Leu 0 100 41.9pwt Ile Ile Thr Thr Ala Thr Leu 0 100 41.9A Cys Ile Thr Thr Cys Thr Leu 1 96 46.7B Ile Cys Thr Thr Ala Thr Cys 1 106 48.3C Ile Ile Cys Thr Ala Cys Leu 1 0 52.9D Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys 2 95 57.6E Ile Cys Cys Thr Ala Cys Cys 2 0 58.9F Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys 3 0 65.9wt：野生型T4溶菌酶；pwt:假野生型酶；AF：六种设计的半胱氨酸变体；Tm:熔点温度,（二）将天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)转换成其他氨基酸,当蛋白质暴露于高温时:天冬酰胺（Asn）天冬氨酸(Asp)+NH3谷氨酰胺(Gln)谷氨酸(Glu)+NH3导致肽链折叠的局部的改变,可能影响其活性。如酵母的丙糖磷酸异构酶是由两个相同的亚基组成的二聚体，每个亚基都含有两个Asn残基，均位于两个亚基相互接触的表面上，可能与该酶的热稳定性有关。若将两个Asn全部换成Asp，则变体酶即使在常温下也不稳定，而且酶活性也大为降低；而将2个Asn分别换为苏氨酸(Thr)和异亮氨酸(Ile)，其半衰期则延长。,表43 酵母菌磷酸丙糖异构酶及其变体的热稳定性 氨基酸位点酶 14 78 半衰期（min）野生型 Asn Asn 13变体A Asn Thr 17变体B Asn Ile 16变体C Thr Ile 25变体D Asp Asn 11 酶的稳定性以在100时半衰期或者失活率来表示。半衰期越长酶越稳定,（三）减少游离Cys残基的数目,在利用DNA重组技术表达外源基因时，常常会遇到这种情况：外源蛋白的表达量很大，但其生物活性却很低，即外源蛋白的比活性很低。利用蛋白质工程技术减少游离的半胱氨酸（Cys）残基数目，以减少蛋白错误折叠的可能性，从而可以提高蛋白质的生物活性。,例如：当人-干扰素基因（-IFN）在大肠杆菌中表达时，尽管其表达量很高，但其比活性只及天然蛋白质的10%。DNA序列分析显示，-IFN所编码的蛋白质有三个Cys残基，其中2个形成分子内二硫键，而另一个游离的Cys可能涉及到-IFN分子间二硫键的形成，导致二聚体的产生，使单聚体含量减少，活性降底。将-IFN分子中的游离Cys残基用Ser来取代，因为Cys与Ser分子结构相似，前者有一个S原子，而后者是一个O原子，减少了二聚体的形成，提高了活性蛋白质的得率。,（四）增加酶的活性,用定点诱变技术不仅可以提高蛋白质的稳定性，还可以提高酶的活性。要改变酶的活性，需要一个详细描述了酶的活性位点的图谱。有了这样的资料，研究者们即可推测酶与底物的亲和程度，并利用定点诱变技术对蛋白质进行改造，提高酶的活性。,表44 天然和诱变酪氨酰-tRNA合成酶活性酶 Kcat(s-1)Km(mmol/L)Kcat/Km(s-1mol-1)Thr-51 4.7 2.5 1.860Ala-51 4.0 1.2 3.200Pro-51 1.8 0.019 95.800,（五）改变酶的特异性,诱变葡萄球菌核酸酶与含-SH寡核苷酸结合示意图,本章重要名词,1.定点诱变（site directed mutagenesis）2.蛋白质工程(protein engineering),