药物分析11第十一章抗生素类药物分析.ppt
第十一章 抗生素类药物的分析,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称,内酰胺类氨基糖苷类四环素类大环内酯类多烯大环类多肽类,1.抗生素（antibiotics）,2.分 类,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,一、概 述,化学纯度较低活性组分易发生变异稳定性差,3.来 源,4.抗生素的特点,生产工艺复杂发酵过程不易控制，易受污染,原因,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,一、概 述,采用生物学法与物理化学法鉴别：理化方法、微生物法检查：水分、异常毒性、热原、细菌内毒素、降压物质等含量/效价测定：微生物法：与临床疗效吻合，灵敏度高，但操作复杂费时；理化方法：准确度与专属性较高，且操作简便，但与临床疗效有偏差,5.抗生素质量分析,一、概 述,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,1.化学结构,包括青霉素类和头孢菌素类,青霉素类：6-APA为母核 头孢菌素类：7-ACA为母核,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,二、内酰胺类,酸性较强（pKa 2.5-2.8）临床常用其碱金属盐（水溶性好）,酸性(羧基),有多个手性碳,旋光性,青霉素类：苯环取代基头孢菌素类：母核有共轭结构,UV（共轭）,干燥条件较稳定，溶液不稳定,稳定性(内酰胺),2、主要理化性质,降解失效,氧化剂、酸、碱酶、金属离子、,青霉素,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,二、内酰胺类,2、主要理化性质,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,二、内酰胺类,1）羟肟酸铁反应：内酰胺类 羟肟酸 显色2）茚三酮反应-氨基 蓝紫色3）双缩脲反应 内酰胺类 紫色4）光谱法（UV、NMR）5）色谱法（HPLC、TLC）,NH2OHHClNaOH,茚三酮,碱性酒石酸铜,呈色反应,3、鉴 别,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,二、内酰胺类,3、鉴 别-头孢利定的NMR鉴别法(JP14),NMR鉴别法,单峰信号,取本品50mg溶于0.5ml重水中，测定NMR光谱时，应显示,多重峰信号,多重峰信号,=3.8 附近,=6.97.5,=7.99.0,2,3,5,强度比,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,二、内酰胺类,3、鉴 别-头孢氨苄鉴别的TLC条件,CHP（2000）,5mg/ml 2l 硅胶G 0.1mol/L枸橼酸液-0.2mol/LNa2HPO4-丙酮(120:80:3)0.1%茚三酮溶液显色,USP（24）,25mg/ml 5l 硅胶 醋酸乙酯-水-乙腈-冰HAc(48:18:14:14)短波长UV光检出,BP（1999）,0.4%(W/V)1l 硅烷化硅胶HF25415.4%NH4Ac(pH6.2)-丙酮(85:15)254nm 检出,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,二、内酰胺类,4、特殊杂质检查-聚合物、有关物质、异构体等,色谱条件与系统适用性试验,测定法,头孢他啶中聚合物测定,头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查,色谱条件与系统适用性试验,异构体和有关物质,举 例：,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,二、内酰胺类,头孢他啶中聚合物测定-色谱条件与系统适用性试验,葡聚糖凝胶G-10,理论板数应不低于900，拖尾因子在0.751.5,254nm 检 测,流动相A：含3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓冲液,蓝色葡聚糖2000,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,头孢他啶中聚合物测定-色谱条件与系统适用性试验,葡聚糖凝胶G-10,峰面积的RSD应小于5.0%,254nm 检 测,流动相B：0.01%十二烷基硫酸钠溶液,头孢他啶对照品溶液,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,头孢他啶中聚合物测定-测定法,葡聚糖凝胶G-10,254nm 检 测,流动相A：含3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓冲液,头孢他啶样品（20mg/ml）,外标法计算，本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超过0.3%,AS,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,头孢他啶中聚合物测定-测定法,葡聚糖凝胶G-10,254nm 检 测,流动相B：0.01%十二烷基硫酸钠溶液,头孢他啶对照品溶液,AR,外标法计算，本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超过0.3%,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查,头孢呋辛酯A，B异构体之间、头孢呋辛酯A异构体与头孢呋辛酯2-异构体之间的分离度应大于1.5；,色谱条件：,ODS分析柱；0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇（62:38）为流动相；流速1ml/min；检测波长278 nm。,系统适用性试验：,理论板数按头孢呋辛酯A异构体峰计算，应不低于1500。,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,B异构体峰的相对保留时间约为0.85，A异构体峰的相对保留时间为1.0。供试品色谱图中,A异构体峰的面积与A、B异构体峰的面积和之比应为0.480.55。,头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,异构体,供试品溶液：0.2mg/ml(流动相溶）对照溶液:供试品溶液，加流动相稀释成6g/ml 对照溶液进样20l，调节仪器灵敏度，使主成分峰高约为记录仪满量程的10%取供试品溶液和对照品溶液各20l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的2.5倍供试品溶液如显杂质峰，量取各杂质峰面积的和，不得大于对照溶液主峰的面积,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查,有关物质,5、含量测定-碘量法（ChP2000）,二、内酰胺类,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,原理：青霉素与头孢菌素本身不与碘反应，但其碱性降解产物可消耗碘,青霉素族头孢菌素族,NaOH水解,4I2H+,8I-,I2+2Na2S2O3 2NaI+Na2S4O6,定量过量,剩 余,5、含量测定,-碘量法（ChP2000）,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,反应分两步进行：,水解反应(按化学计算量进行),氧化-还原反应(无定量关系，受温度、pH值和时间等因素影响，应严格控制反应条件并采用标准品平行对照测定),5、含量测定,-碘量法（ChP2000）,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,因样品中杂质会消耗碘，故应作空白试验。,加入样品，不加碱；其余试剂（醋酸盐缓冲液，碘液，硫代硫酸钠）都要加碱。,空白试验:,空白试验与经典空白试验不同：,5、含量测定,-碘量法（ChP2000）,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,试验条件:（I2氧化）,弱酸性（pH4.5）,20分钟后，耗碘量随时间的变化较小,碱 I2 IO3-+I-酸 某些药物与碘生成复盐沉淀,温度（2426）,温度38 时未水解的供试品亦消耗碘,反应时间：（20分钟）,5、含量测定,-碘量法（ChP2000）,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,含量 对照品,V样空-V样 W对 V对空-V对 W样,灵敏度高：样品:碘=1:8反应条件、实验操作要求高,1份含量,V对、V对空V样、V样空,加试剂次序、反应时间、滴定速度相同,特 点：,5、含量测定,-电位配位滴定法（汞量法）,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,原理：青霉素不与汞盐反应，其碱性降解产物可与Hg2+络和。,Hg+2R-SH(RS)2Hg+2H+,方法说明：a、空白试验与碘量法类似，加样品，不加NaOH b、与碘量法相比，汞量法不需对照试验,5、含量测定,-其他常用方法,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,酸碱滴定法：应用广泛,硫醇汞盐法,羟肟酸比色法,HPLC法：应用广泛,5、含量测定,（例）-阿莫西林克拉维酸钾片,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,阿莫西林峰与克拉维酸峰的分离度应大于3.5,色谱条件与系统适用性试验,十八烷基硅烷键合硅胶,磷酸盐缓冲液-甲醇(95:5)流速为0.7ml/min；,检测波长为220nm,5、含量测定,（例）-阿莫西林克拉维酸钾片,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,取本品10片，置1000ml量瓶中，加水适量，振摇使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取阿莫西林对照品与克拉维酸对照品各适量，加水溶解，制成每1ml中含阿莫西林0.5mg和克拉维酸0.25mg的混合溶液，同法测定。按外标法以峰面积分别计算供试品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。,测 定 法：,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,1.化学结构,三、氨基糖苷类,都是以氨基环醇与氨基糖缩合而成的苷；分子结构中都含有多羟基；均为碱性抗生素；,链霉素,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,临床应用其硫酸盐,碱性(氨基),（糖）：有多个手性碳,旋光性(糖),水 溶 性,溶解度(氨基、羟基),强酸、碱条件均可水解,稳定性(苷),2、主要理化性质,三、氨基糖苷类,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,3、鉴 别,三、氨基糖苷类,茚三酮反应：具羟基胺类，-氨基酸性质,链霉素+水和茚三酮 蓝紫色,链霉素 N-甲基葡萄糖胺,N-甲基葡萄糖胺（Elson-Morgan）反应：,红 色,水解,对二甲氨基苯甲醛,乙酰丙酮OH-,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,8-羟基喹啉 NaOBr,坂口（Sakaguchi）反应：(链霉胍特有）,麦芽酚（Maltol)反应：(链霉糖特有）,三、氨基糖苷类-鉴别,链霉素 麦芽酚 紫红色,链霉素 链霉胍 橙红,硫酸盐反应,或-萘酚,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,4、检 查-,来 源：,发酵中产生,BP:,薄层色谱法（杂质对照品法）,要求：NC2 2000，C2a峰和C2峰的分离度应符合要求，重复进样RSD2.0%,三、氨基糖苷类,链霉素中链霉素B的检查,庆大霉素C 组分测定（系统适用性试验）,色谱柱：ODS,流动相：H2O-HAc-MeOH配制的庚烷磺酸钠溶液(0.2M)，必要时调节甲醇的含量。,检测波长：330nm（邻苯二甲醛柱前衍生）,4、含 量 检 测,三、氨基糖苷类,氨基糖苷类 含量检测,微生物法、HPLC法等,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,四、四环素类,1.化学结构,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,四、四环素类,-OH：酸性N(CH3)2：碱性与酸、碱均可成盐临床多用盐酸盐,两 性,旋光性,易发生异构化，降解等反应，性质不稳定,稳定性,酚羟基、烯醇基与Ca2+、Mg2+络合显色,与金属离子络合,2、主要理化性质,UV和荧光,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,四、四环素类,2.主要理化性质,碱 性 C环开环，形成内酯 异四环素,弱酸性（pH2-6）A环C-4异构化 差向四环素,酸性（pH 2）C环脱水 脱水四环素,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,四、四环素类,差向异构体,异四环素,OH-,四、四环素类,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,四、四环素类,3.鉴 别,1）浓硫酸反应2）FeCl3反应：（酚羟基）显红色褐色3）TLC、HPLC4）荧光：（含共轭双键）紫外灯照射下产生不同颜色荧光,ChP、USP：HPLC法 JP：比色法,4.检 查,TLC、HPLC法杂质吸收度（降解产物颜色较深）,5.含 量,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,五、高分子杂质的检查,内源性：药物自身聚合物 来源于生产过程、贮存过程、使用不当外源性：蛋白、多肽、多糖及其与药物的结合物 来源于发酵过程临床应用其硫酸盐,高分子杂质,凝胶色谱法：葡聚糖凝胶 Sephadex G-10,杂质控制方法,
