荧光定量PCR原理及应用科研版.ppt

实时荧光定量PCR技术简介,应用工程师 张晓辉,MJR系列实时荧光定量PCR仪之 OUTLINE,实时荧光定量PCR原理荧光定量PCR仪简介实时荧光定量PCR在科研上的应用实时荧光定量PCR实验设计实例,实时荧光定量PCR原理 OUTLINE,实时荧光定量PCR的原理：什么是实时荧光定量PCR荧光化学双通道与内标基因分型（SNP）检测,实时荧光定量PCR原理,常规PCR技术：PCR后借助电泳对扩增反应的终产物进行定量及定性分析,常规PCR,实时荧光定量PCR原理 常规PCR,常规PCR结合电泳分析方法的缺点,只能对终产物进行分析,无法对起始模板准确定量必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析,费时费事无法对扩增反应实时检测EB有毒,Opticon,实时荧光定量PCR原理,定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析,定量PCR,实时荧光定量PCR原理,实时荧光定量PCR三个关键词：实时，荧光，定量如何实时检测？借助荧光物质示踪扩增产物量的变化,定量PCR,实时荧光定量PCR原理,在PCR反应加入能示踪扩增产物的荧光化学物质，随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图，从而通过荧光强度变化实时监测产物量的变化,荧光曲线,如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析引入两个概念：荧光阈值、Ct值,实时荧光定量PCR原理 定量原理,荧光阈值在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准),实时荧光定量PCR原理 定量原理,实时荧光定量PCR原理 定量原理,Ct值的概念Ct值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数,Log浓度与循环数呈线性关系初始 模板量越多,扩增产物达到某一值（域值）时所需要的循环数越少,确定初始模板的浓度,实时荧光定量PCR原理 定量原理,实时荧光定量PCR原理 定量原理,理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率,定量原理,实时荧光定量PCR原理,在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=N(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为N.方程式(1)两边同时取对数得:log N=log X0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:log X0=-log(1+Ex)*Ct+log N(3)Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量,定量原理：利用已知起始拷贝数的标准样品作出标准曲线,通过未知样品的Ct值,从标准曲线上计算出该样品的起始浓度。,如何定量,荧光强度-循环数曲线,初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线,.,未知,104,103,106,105,102,10,实时荧光定量PCR原理,Determine C(t)value for unknownInterpolate quantity of unknown using the standard curve,Unknown contains 3108 copies,实时荧光定量PCR原理,实时荧光定量PCR原理,阈值的选择荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,实时荧光定量PCR原理,为什么要用Ct值定量实时荧光定量PCR方法利用Ct的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct值具有极好的重复性。,实时荧光定量PCR原理,相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性,Ct值的重现性,MJR系列实时荧光定量PCR仪之 与传统PCR的比较,Absolute quantification is possibleSensitiveDetects lower copies of targetDetects small fold differencesSamples with a broad range of concentrations are analyzed without normalizing concentrationCost effective and time efficientFlexible assay design,实时荧光定量PCR原理 OUTLINE,实时荧光定量PCR的原理：什么是实时荧光定量PCR荧光化学双通道与内标基因分型（SNP）检测,实时荧光定量PCR原理,示踪扩增产物量变化的荧光物质及其工作原理,SYBR Green 1,Molecular Beacons,TaqMan,荧光化学,MJR系列实时荧光定量PCR仪之,SYBR Green I,SYBR Green 1,MJR系列实时荧光定量PCR仪之,SYBR Green I 工作原理,MJR系列实时荧光定量PCR仪之,SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位SYBR Green 1 染料只有和双链DNA结合后才发荧光。,Bound SYBR Green I,Unbound SYBR Green I,PCR,SYBR Green I fluorescence increases upon binding dsDNA Post-amplification melting curve analysis,MJR系列实时荧光定量PCR仪之 SYBR Green I 工作原理,SYBR Green I 工作原理,MJR系列实时荧光定量PCR仪之,SYBR Green I 优点,使用方便-不必设计复杂的荧光探针 没有序列特异性-可以用于不同的模板 便宜 灵敏,MJR系列实时荧光定量PCR仪之,SYBR Green I 缺点,与非特异性产物结合,MJR系列实时荧光定量PCR仪之,Graph fluorescence intensity vs.temperatureDecreasing fluorescence recordedDue to increasing temperatureDue to denaturation and release of SGITm is the point of inflection on the melting curve,MJR系列实时荧光定量PCR仪之 SYBR Green I 融解曲线分析,Plot the negative of the rate of change of fluorescence vs.temperature(-dI/dT),MJR系列实时荧光定量PCR仪之 SYBR Green I 融解曲线分析,MJR系列实时荧光定量PCR仪之 SYBR Green I 融解曲线分析,Identical reaction components,except initial template concentration varies,Amplification results,1.95oC for 15 min2.94oC for 10 sec3.63oC for 15 sec4.72oC for 30 sec5.Plate Read6.84oC for 1 sec7.Plate Read8.Go to line 2 39 more times9.Melting curve from 65oC to 95oC,read every 0.2oC,hold 1 sec.,MJR系列实时荧光定量PCR仪之 SYBR Green I 融解曲线分析,Amplification results,1.95oC for 15 min2.94oC for 10 sec3.63oC for 15 sec4.72oC for 30 sec5.Plate Read6.84oC for 1 sec7.Plate Read8.Go to line 2 39 more times9.Melting curve from 65oC to 95oC,read every 0.2oC,hold 1 sec.,MJR系列实时荧光定量PCR仪之 SYBR Green I 融解曲线分析,For reliable nucleic acid quantification,each primer set requires individual optimizationParameters used to optimize reaction specificity and efficiencyPrimer design Amplicon designConcentration of reagentsCycling conditionsDenaturation and annealing temperatures,MJR系列实时荧光定量PCR仪之 Real-time PCR体系优化,Dynamic thermal gradient allows for one-step reaction-temperature optimizationUp to 24oC gradient range,MJR系列实时荧光定量PCR仪之 Real-time PCR体系优化,Melting curve results,Amplification results,1.95oC for 15 min2.94oC for 10 sec3.Gradient from 45oC to 65oC for 15 sec4.72oC for 30 sec5.83oC for 1 sec6.Plate Read7.Go to line 2 39 more times8.Melting curve from 65oC to 95oC,readevery 0.2oC,hold 1 sec.,MJR系列实时荧光定量PCR仪之 Real-time PCR体系优化,SYBR Green I 应用范围,起始模板浓度定量融解曲线分析-可区分单一产物、变异产物、多种产物和（或）引物二聚体基因型分析,MJR系列实时荧光定量PCR仪之,Molecular Beacons,Molecular Beacons,MJR系列实时荧光定量PCR仪之,发夹型杂交探针,Molecular Beacons,原理：荧光谐振能量传递（FRET）,茎由互补配对的序列组成,环与目标序列完全配对,茎,MJR系列实时荧光定量PCR仪之,荧光素,淬灭剂,环,变性:产生非特异性的荧光,Molecular Beacons,MJR系列实时荧光定量PCR仪之,Target-loop interaction more stable than stem-stem,T,A,C,C,G,G,G,G,G,T,T,A,C,G,A,A,C,G,G,T,A,A,T,T,T,T,T,G,C,C,C,C,C,A,A,A,A,Q,R,Target,During the annealing step:Probe binds targetReporter and quencher separatedTarget-specific fluorescence,MJR系列实时荧光定量PCR仪之 Molecular Beacons,延伸:没有荧光,Molecular Beacons SNP,Opticon实时荧光定量PCR仪之,Molecular Beacons 实验结果,MJR系列实时荧光定量PCR仪之,MJR系列实时荧光定量PCR仪之 Molecular Beacons实验程序,1.94 5 min2.95 5 sec3.58 30 sec4.Plate read 5.72 30 sec6.Goto step 2 for more 39 times,Molecular Beacons 应用范围,定量起始模板浓度基因型分析鉴定产物单核苷酸多态性（SNP）检测,MJR系列实时荧光定量PCR仪之,Molecular Beacons SNP,T,A,C,C,G,G,G,G,G,T,T,A,C,G,A,A,C,G,G,T,A,A,T,T,T,T,T,G,C,C,C,C,C,A,A,A,A,Q,荧光素,目标序列,茎,淬灭剂,MJR系列实时荧光定量PCR仪之,Molecular Beacons 优点,对目标序列有很高的特异性 用于SNP检测的最灵敏的试剂之一荧光背景低,MJR系列实时荧光定量PCR仪之,Molecular Beacons 缺点,设计困难无终点分析功能只能用于一个特定的目标价格较高,MJR系列实时荧光定量PCR仪之,TaqMan,探针,荧光素,淬灭剂,MJR系列实时荧光定量PCR仪之,TaqMan,水解型杂交探针,TaqMan,目标特异性探针5 为荧光素，3 为淬灭剂,5 荧光素,3淬灭剂,与目标序列互补,MJR系列实时荧光定量PCR仪之,Intact probe-reporter quenched by FRET,MJR系列实时荧光定量PCR仪之 TaqMan 工作原理,TaqMan 实验结果,MJR系列实时荧光定量PCR仪之,MJR系列实时荧光定量PCR仪之 TaqMan实验程序,1.94 5 min2.95 5 sec3.58 30 sec4.Plate read 5.Goto step 2 for more 39 times6.end,TaqMan 应用范围,定量起始模板浓度基因型分析产物鉴定SNP分析,MJR系列实时荧光定量PCR仪之,TaqMan 优点,对目标序列有很高的特异性-特别适合于SNP检测与 Molecular Beacons 相比设计相 对简单,MJR系列实时荧光定量PCR仪之,TaqMan 缺点,价格较高只适合于一个特定的目标不能进行融解曲线分析背景高,MJR系列实时荧光定量PCR仪之,兼容化学试剂总结,MJR系列实时荧光定量PCR仪之,实时荧光定量PCR原理 OUTLINE,实时荧光定量PCR的原理：什么是实时荧光定量PCR荧光化学双通道与内标基因分型（SNP）检测,MJR系列实时荧光定量PCR仪之,双通道与内标,准确的相对定量方法-内标法-解决模板提取过程中造成的差别-解决样品材料不均一造成的差别-解决加样过程中的差别,MJR系列实时荧光定量PCR仪之 内标法,内标法必须：在一个PCR管中进行两种PCR反应：一个是有差别的（目标RNA或DNA）一个是无差别的（内标RNA或DNA）,MJR系列实时荧光定量PCR仪之 内标法,内标的种类看家基因添加DNA或RNA,实时荧光定量PCR技术之 多色双通道技术,多色双通道技术：多色：可使用多种荧光染料双通道：可同时测定两种荧光染料 发出的荧光,一个PCR管内进行两种PCR扩增要解决的问题：1、引物及探针问题-引物及探针的相 互干扰2、模板量差别-共用资源的相互竞争,实时荧光定量PCR技术之 多色双通道技术,F,R,实时荧光定量PCR技术之 多色双通道技术,1、引物及探针问题,2、共用资 源的相互竞争,实时荧光定量PCR技术之 多色双通道技术,F,R,F,R,R,Q,解决办法：单双通道同时进行，相互验证,实时荧光定量PCR技术之 多色双通道技术,单,单,双,实时荧光定量PCR技术之 多色双通道技术,解决办法之二：primer limiting,实时荧光定量PCR原理 OUTLINE,实时荧光定量PCR的原理：什么是实时荧光定量PCR荧光化学双通道与内标基因分型（SNP）检测,F,R,C,SNP G/A,Forward primer,Reverse primer,Allele-specific probe,Allele-specific probe,用TaqMan探针进行基因型分析,实时荧光定量PCR技术之 SNP检测-基因型分析,Q,5,3,G,Hybridization of TaqMan Probe,Digestion of probe-fluorescence,NO digestion of probe-NO fluorescence,Match for Allele 1,Reduced Efficiency of Probe Hybridization,Mismatch for Allele 1,Polymerase,实时荧光定量PCR技术之 多色双通道技术应用-基因型分析,从病人血液样品中提取 DNA 基因型分类：A/A(Allele 1)G/G(Allele 2)G/A(Heterozygote),实时荧光定量PCR技术之 多色双通道技术应用-基因型分析,Allele 1 control,实时荧光定量PCR技术之 多色双通道技术应用-基因型分析,Allele 2 control,VIC,FAM,实时荧光定量PCR技术之 多色双通道技术应用-基因型分析,Heterozygote control,FAM,VIC,实时荧光定量PCR技术之 多色双通道技术应用-基因型分析,实时荧光定量PCR技术之 多色双通道技术应用-基因型分析,实时荧光定量PCR技术之 多色双通道技术应用-基因型分析,实时荧光定量PCR技术之 SNP网站,SNP的网站/):该网站是由美国的NCBI主办的。它除了可接受各地发来的SNP申请注册外，也向公众免费提供对SNP的查询。(2):该网站建在德国，收集基因内SNP，研究者可通过检测出的序列查询SNP。(3)MIT SNP数据库(http:/):该网站是由美国麻省理工学院建立的。它包括数千条已经定位的SNP，可以通过指定染色体的某一区域查询SNP。,其它的SNP站点还有：华盛顿大学，网址是：http:/SNP;CHLC,网址是：;美国人类基因组研究所，网址是：。,实时荧光定量PCR技术之 SNP网站,MJR系列实时荧光定量PCR仪之 OUTLINE,实时荧光定量PCR原理荧光定量PCR仪简介实时荧光定量PCR在科研上的应用实时荧光定量PCR实验设计实例,Chromo 4四通道实时荧光定量基因检测系统之 外观图片,生产商：美国MJ Research 公司,Chromo4Four-Color Real-Time Detector,Chromo 4四通道实时荧光定量基因检测系统之 组成介绍,循环仪检测系统计算机及软件系统,Chromo 4四通道实时荧光定量基因检测系统之 循环仪温控系统,PTC200加热:电热丝+半导体制冷:半导体,Chromo 4四通道实时荧光定量基因检测系统之 循环仪构造,Chromo 4的PCR仪结构：三传感器双区域温度-温度梯度,Chromo 4四通道实时荧光定量基因检测系统之 检测系统,检测,Chromo 4四通道实时荧光定量基因检测系统之 光源-LED,优势寿命长稳定体积小产热少可过夜运行,发光二极管（LED）,优势灵敏检测范围广体积小耐用,Chromo 4四通道实时荧光定量基因检测系统之光电二极管（PDT）,光电二极管通过吸收光子产生电流,Chromo 4四通道实时荧光定量基因检测系统之 检测系统结构,多色四通道四组LED、滤镜和PDT组成光学检测模块4个LED依次发光，消除孔间干扰检测模式为扫描型，11秒扫过96个样品扫描头离样品距离近，提高检测的灵敏度。,Chromo 4四通道实时荧光定量基因检测系统之 四通道检测,Chromo 4四通道实时荧光定量基因检测系统之 四通道检测,Chromo 4四通道实时荧光定量基因检测系统之 宽广的线性范围,用VIC标记的-actin连续10倍稀释标准品定量结果,Chromo 4四通道实时荧光定量基因检测系统之 高分辨率,可以清晰的分辨出128、256、512、1024拷贝数的初始模板量,Chromo 4四通道实时荧光定量基因检测系统之 优越的重复性,无论使用哪一个通道，无论使用非特异性的SG1 或特异性的TaqMan 探针，都能得到重复性极好的结果,Opticon 实时荧光定量PCR仪之 实验结果（1）,实验时间：2002年8月16日地点：北京红十字血液中心试剂：PG公司 HIV及HCV试剂盒样本：血液中心-20度保存,Opticon 实时荧光定量PCR仪之 实验结果（2）,实验时间：2002年8月14日地点：北京红十字血液中心试剂：PG公司 HIV试剂盒样本：血液中心-20度保存,Opticon 实时荧光定量PCR仪之 实验结果（3）,实验时间：2002年8月21日地点：北京大学生命科学学院试剂：PG公司 HBV试剂盒样本：参控标准品,Opticon 实时荧光定量PCR仪之 SARS试剂盒实验结果,Opticon 实时荧光定量PCR仪之 实验结果（ERBB2检测）,Opticon 2 实时荧光定量PCR仪之 实验结果（双色分析）,Opticon 2 实时荧光定量PCR仪之 实验结果（线性范围）,Opticon 2 实时荧光定量PCR仪之 实验结果（线性范围与重复性）,Opticon 2 实时荧光定量PCR仪之 实验结果（2倍分辨率）,MJR系列实时荧光定量PCR仪之 OUTLINE,实时荧光定量PCR原理荧光定量PCR仪简介实时荧光定量PCR在科研上的应用实时荧光定量PCR实验设计实例,实时荧光定量PCR技术之 应用,定量：DNA定量RNA定量定性：SNP分析基因型分析RNA变异分析融解曲线分析,临床定量研究的应用：病原微生物引起的疾病的检测病原微生物含量与病情的轻重程度、传染性及治疗效果之间的关系新的治疗与预后指标的研究病原微生物含量与用药之间的关系新的病原体分子诊断标准 超早期感染治疗用药物及疗法的研究与开发在传染病流行病学方面的应用：医院血站防疫站,实时荧光定量PCR技术之 应用,8.传染病的发病监控、预测与预防 9.mRNA的表达水平与是否肿瘤及其进展的关系10.肿瘤相关基因表、肿瘤标志物 和肿瘤耐药基因的检测11.mRNA的表达水平与染病及病情之间的关系：预测、诊断、评价、指导治疗,实时荧光定量PCR技术之 应用,实时荧光定量PCR技术之 应用,临床定性检测(SNP)的应用：1.等位基因与遗传病之间的关系2.诊断及预测致病风险3.SNP与体质遗传病之间的关系4.药物基因组学及新药的发现5.合理用药研究,其他：比较染病组织与正常组织中各种mRNA含量差异病毒性疾病中病毒的耐药性变异株的测定HBV基因突变，尤其是前核基因突变，直接影响HBV感染病情转归及抗毒治疗效果，同时也反映了来自体内或外界选择压力的作用。因此，突变株在体内产生的确切原因，突变株与野生株混合存在的发展趋向，突变株是否为耐药株，突变株与野生株相对含量的变化与致病性的关系，突变株与免疫耐受的关系等均是有必要进一步澄清的问题。新临床诊断及检验试剂的开发研究ELISA方法的漏检率HLA分型：取代传统电泳方法,实时荧光定量PCR技术之 应用,实时荧光定量PCR技术之 应用,6.遗传病诊断：如地中海贫血等位基因检测 多基因遗传病的突变检测 基因表达异常所致遗传病检测胚胎植入前遗传诊断（preimplantation genetic diagnosis，PGD）是用人类辅助生殖技术获得受精卵，体外培养发育到610细胞的卵裂球时，通过显微操作技术从中活检12个单细胞，利用医学分子遗传学诊断技术对单个卵裂球细胞标本进行遗传诊断，然后将它们移植回母体子宫内继续发育至妊娠，从而避免遗传病患儿出生。遗传病基因携带夫妇如不想用产前诊断、人工流产来避免高危受累患儿的出生，PGD目前是他们的唯一选择。与以前采用的巢式PCR相比，FQPCR减少了等位基因缺失（allele drop-out，ADO）现象的发生。,MJR系列 实时荧光定量PCR仪之 应用,其他方面的部分应用：公安系统相关：个人身份鉴定物证的各种鉴定人种的鉴定考古方面动植物检疫,MJR系列实时荧光定量PCR仪之 应用,研究方面部分应用基因表达分析：responses to a particular stimulustissue differentiationstages of developmentcell proliferationdisease state progression,物种分类环境污染与毒理监测：生物标志物的定量检测基因芯片结果的复证分子生态学研究Genotyping,MJR系列 实时荧光定量PCR仪之 应用,MJR系列 实时荧光定量PCR仪之 应用,转基因研究方面的部分应用：转基因的基因拷贝数与受体生物性状之间的关系；转基因的基因表达量与受体生物性状之间的关系；转基因胚胎中转基因拷贝数的测定；转基因对受体生物其他基因表达的影响（包括不同的发育时期的影响）；,MJR系列实时荧光定量PCR仪之 应用,转基因生物安全方面的部分研究：转基因在环境中的扩散监测；转基因生物世代传递中的拷贝数、表达量变化监测 食品、烟草、化妆品等中转基因成份含量的测定（GMO)转基因成分含量与毒理代谢之间的关系,MJR系列实时荧光定量PCR仪之 OUTLINE,实时荧光定量PCR原理荧光定量PCR仪简介实时荧光定量PCR在科研上的应用实时荧光定量PCR实验设计实例,应用实例之 Outline,Two-color-real-time qPCR assay for Cancer marker expression using TaqMan probesOne-color real-time qPCR assay(SGI)for GMO soy detectionOne-color real-time qPCR assay(SGI)for tissue profiling Experiment setting and data analysis,TraditionalNorthern blotUseful for mRNA size determinationRNase protection assayMapping initiation,termination and alternative splice sitesHigh throughputMicroarrays,应用实例之 基因表达的研究方法,Absolute quantificationSensitiveDetects lower copies of target than other methodsDetects small fold differencesSamples with a broad range of concentrations are analyzed without normalizing concentrationCost effective and time efficientEase of use,应用实例之 RT-qPCR的优点,应用实例之 Cancer marker expression,TaqMan chemistryMultiplexingExpression differences of ERBB2 in neoplastic breast tissue samples,应用实例之 Cancer marker expression,ERBB2 oncogeneTransmembrane tyrosine kinase overexpressed in 25%of breast cancer casesIncreased transcript levels associated with a poor prognosis and lower response to standard treatmentsGAPDH housekeeping gene for normalization,材料和方法 材料,从 正常乳腺组织中提取的 Total RNA 从乳腺癌组织中提取的 Total RNA含 ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准曲线单双通道同时进行，独立分析Controlsno RNARNA+no reverse transcriptase,实验材料,材料和方法 RT-qPCR,材料和方法 RT-PCR,RT-qPCR program 1,50C,30min 2,95C,15min 3,94C,15sec 4,60C,1min 5,plate read 6,go to step 3,39 more times 7,10C,forever End,应用实例之 Cancer marker expression,Color 2-VIC detection for GAPDH,Color 1 FAM detection for ERBB2,CH1-FAM detection-ERBB2,实验结果 扩增曲线,CH2-VIC detection-GAPDH,实验结果 单双通道相互验证,ERBB2单双通道相互验证的实验结果,HealthyRNA,TumorRNA,GAPDH,ERBB2,10951052,21302492,9550085730,136000130800,2.16 X,1.45 X,Copies ng/l Total RNA,实验结果 定量,ERBB2 copies/GAPDH copies,1095/95500=0.0111052/85730=0.012,2130/136000=0.0172492/130800=0.019,Healthy RNA,Tumor RNA,0.0115,0.018,Copies ng/l Total RNA,实验结果 定量分析,0,0.2,0.4,0.6,0.8,1,1.2,1.4,1.6,1.8,2,HealthyTissue,Carc.Tissue,Relative Expression,ERBB2的表达差异,实验结果 表达差异,讨论 成功检测,利用RT-qPCR在Opticon2上成功检测了ERBB2基因在不同组织的 表达差异；在乳腺癌组织中，ERBB2的表达量提高到正常水平的1.8倍,应用实例之 实验设计中的常见问题,用于生成标准曲线的样品如何设定？含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的cDNA紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度根据质粒或cDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀释,Opticon 实时荧光定量PCR仪之 部分发表文献,Opticon Reference PapersL.Shively,L.Chang,J.M.LeBon,Q.Liu.A.D.Riggs,and J.Singer-Sam.Real-Time PCR Assay for Quantitative Mismatch Detection.BioTechniques,March 2003,Vol.34,No.3.(Mismatch detection)F.Grun,R.N.Vankatesan,M.M.Tabb,C.Zhou,J.Cao,D.Hemmati,B.Blumberg.Benzoate X Receptors a and Are Pharmacologically Distinct and Do Not Function as Xenobiotic Receptors.The Journal of Biological Chemistry.Issue of November 15,Volume 277,No.46,pp.43691-43697,2002.(RT-PCR,SYBR Green)K.Decker,T.Trager,A.Missel,K.Heitz,S.Kobsch,K.Machura,D.Loffert.Optimizing Probe Hybridization in Real-Time PCR for Quantification and SNP Genotyping.Qiagen News,Issue 4,pp.13-16,2002.(SNP Genotyping)N.Qi,L.Kazdova,V.Zidek,V.Landa,V.Kren,H.A.Pershadsingh,E.St.Lezin,N.A.Abumrad,M.Pravenac,T.W.Kurtz.Pharmacogenetic Evidence That Cd36 Is a Key Determinant of the Metabolic Effects of Pioglitazone.The Journal of Biological Chemistry.Issue of December 13,Volume 277,No.50,pp.48501-48507,2002.(Gene Expression),Opticon 实时荧光定量PCR仪之 部分发表文献,L.Wu,Y.Wu,B.Gathings,M.Wan,X.Li,W.Grizzle,Z.Liu,C.Lu,Z.Mao,x.Cao.Smad4 As A Transcription Corepressor for Estrogen Receptor a.JBC Papers In Press,Published on February7,2003 as Manuscript M212332200.(Chromatin PPT.)6.L.Qin,P.Qiu,L.Wang,X.Li,J.T.Swarthout,P.Soteropoulos,N.C.Partridge.Gene Expression Profiles and Transcription Factors Involved in PTH Signalling in Osteoblasts Revealed by MicroArray and BioInformatics.JBC Papers in Press.Published on March 18,2003 as Manuscript M212226200.(Gene Expression and Microarray validation)7.J.Van Ness,L.K.Van Ness,D.Galas.Isothermal Reactions for the Amplification of Oligonucleotides.Proceedings of the Natl.Academy of Sciences.USA,10.1073/pnas.0730811100(published online before print)(Isothermal Reactions)8.X.Zhao,T.D.Gallardo,L.Lin,J.J.Schageman,R.V.Shohet.Transcriptional Mapping and Genomic Analysis of the Cardiac Atria and Ventricles.Physiol.Genomics 12:53 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