现代生物技术在生物活性物质开发中的应用.ppt

主讲：林标声,考试形式,1.平时占40%、期末60%2.实验课3.期末考试4.平时抽点，三次未答到者无成绩,关于中医学,中医学已经有数百年的临床使用历史。中医学使用整体概念和阴阳五行理论使身体恢复平衡，从而治疗疾病。中医学主要靠针灸和中草药进行治疗。中药包括植物，动物和矿物质。中医学最近越来越多地和西医结合了。,中药的正面效果（一）,许多中药中都有多种维生素或矿物质，所以可以当作日常饮食的补充物。这些草药含有抗氧化剂，可以减轻或者预防很多病症。草药和食物一起烹调会很容易消化吸收，特别富有营养，而且有的时候很美味。,中药汤剂多是复方，根茎药居多，多数中药提取物中含有最多的物质为淀粉，多糖，粘液质等等，这些物质混合在水溶液中呈上黑色或棕色,中药的正面效果（二）,大部分的中药都因有滋补保健作用而著称。这些滋补草药都特别有营养，能促进身体机能。如果使用得当，它们可以在没有副作用的情况下延缓衰老，并且非常好消化。,中药的正面效果（三）,例如，人参作为经典的滋补药，有增强机体耐力的功效。这种植物含有能营养并调节神经系统和内分泌系统的化学成分。,中药的正面效果（四）,当归是另一种经典补药，用于补血已经有数百年历史。它可以缓解经前综合症，肌肉疼痛和肠运动。一些中国运动员在严格训练的同时也摄取一些滋补中药进行辅助。,中药的负面效果（一）,因为过量使用或者误用中药而产生的中毒事件时有发生。误用中药可能导致急性的或慢性的负面效果。中药产品可能掺有杂质或者污染物。还有很多临床试用产生的（慢性的）负作用没有被好好地记录下来。,中药的负面效果（二）,一些中草药有假冒伪劣或者药物间互相反应的现象。开架贩售的中药上的一些误导性的标签也会引起一些问题。一些未获准加入的配料和重金属可能在配制或者生产过程中掺入。,令人不能接受的中药（一）,一些中药有难闻的气味和非常苦的味道。人们使用中草药时，很少有觉得愉快的体验。不相信中医学的人怀疑中药的疗效，并且不能接受建立在整体概念上的中医疗法。,令人不能接受的中药（二）,围绕中药的使用展开的争论令那些不相信中医学的人更加不舒服。例如，人参的作用据说有很多是表面作用。现在并没有适当的标准和程序来保证中药对外宣称的药效和质量。,中药配方,积实9g-18g、合欢花3g-9g、玫瑰花2g-6g、乌贼骨3g-12g、白及3g-12g、姜半夏3g-9g、陈皮3g-9g、甘草1g-3g、茯苓3g-12g、鸡内金6g-12g、大麦芽6g-15g、延胡索2g-6g、黄连1g-3g、香橼3g-9g、青皮3g-9g、香附3g-9g、砂仁2g-6g、党参3g-12g、白术3g-12g、焦山查3g-12g、神曲3g-9g、木香3g-6g、怀山药6g-15g、白芍3g-9g。本发明在胃病患者使用中，能迅速改善胃病症状，且疗效持久，无明显不良反应。适用于慢性胃病出现的胃痛、胃胀、胃酸或恶心、呕吐、嗳气等消化道症状。,保肝降酶的中药处方,.五味子(研末)60克,女贞子、连翘、白芍各15克,败酱草、垂盆草各30克,薏苡仁、酸枣仁各20克,酸枣仁,薏苡仁,保肝退黄的中药处方,赤芍30克,丹参、滑石(包煎)、丹皮、茜草、车前子各15克,紫草20克,蝉蜕12克,生大黄10克,白豆蔻3克,第 1 章现代生物技术在生物活性物质开发中的应用,生物技术（biotechnology）是 20 世纪 70 年代初在生物化学和细胞生物学最新研究成果的基础上发展起来的一个新兴技术领域，这些新成就包括基因重组、杂交瘤、固定化酶和动植物细胞大规模培养等技术。这些技术的应用，使人们能定向设计组建具有特定性状的新物种或新品系，结合发酵和生化工程原理，加工生物材料，生产新型产品在医药、食品、化工、能源、农业和环境保护等方面有着广阔的发展前景。近年来，生物技术在农业、医药卫生等领域均取得了突飞猛进的发展，已逐渐成为生命科学各个领域研究的主要内容和手段，同时也是各个学科研究的主旋律，它丰富了传统学科的研究内容带动了传统学科的发展。,生物技术的概念,从认识、发展和利用生物或生物机能而进行改造、创建新生物或生物新机能这一特点来看，生物工程不同于传统的生物技术。按照普遍的看法，生物工程的技术体系主要包括基因工程（DNA 重组技术）、细胞工程（细胞融合和组织培养技术）、酶工程（酶的改造与设计技术）和发酵工程（细胞大量培养技术）四个方面。一般而言，发酵工程包括生化工程（生物反应器的设计）和酶工程，但也有将二者分开的,生物工程,基因工程,细胞工程,酶工程,发酵工程,核心和关键、主导技术,基础,条件,获得最终产品的手段,生物资源,生物资源通常指植物、动物和微生物，即可为人类所利用的一切生命有机体的总和。生物资源不同于其他自然资源，有其特殊的性质，它在整个自然资源中占据中心的地位。生物资源具有再生性，地域性，可解体性，可影响水、土、气候资源的形成与演变，可直接利用并转换太阳能等五个特点。前四点是整个生物资源 所普遥共有的，后一 点则主要为植物的属性。,一、生物技术释义传统生物技术:发酵、酿酒、制酱、育种等,当代生物技术：应用自然科学原理，利用生命有机体(从微生物到高级动物、植物等作为反应器)及其组成(含器官组织、细胞、细胞器甚至基因)，在生物体内生产实用产品的一种技术体系。,生物技术产业包括：传统生物技术产业 现代生物技术产业,现代生物技术产业包括：基因工程 细胞工程 酶工程 发酵工程主要是医药生物技术、农业生物技术和工业生物技术，如天然药物、保健品、环保产业、生物能源、生物材料和组织器官工程等。,生物技术研究的内容及优越性,生物技术产业的发展目标：解决世界人口、粮食、环境、健康、能源和海洋等影响21世纪人类生存的重大问题。生物技术将成为21世纪的高新技术与支柱产业。,生物技术在生物资源中应用的优越性：操作培养条件和培养方式极大地提高生产率培养是在无菌条件下进行，可以排除病菌和虫害的侵扰，控制药材质量，为中药现代化提供统一标准的原料。进行特定的生物转化反应，大规模生产所需要的有效成分对有效成分生物合成路线进行遗传操纵，提高所需物质的产量通过加入或删除基因而改变原药材的遗传特性,近年来人们利用生物技术对上述问题进行了大量 的研究，取得了较好的研究成果，有些已经成功地产业化。Fouya 等报道利用 20t 规模的反应器进行人参毛状根培养，取得成功,1.2 药材的分子鉴定,中药鉴定是保障中药用药安全，确定中药质量优劣，寻找、扩大和发展新的中药材资源的一项重要工作直接关系到中药各项研究工作结论的正确与错误和临床疗效的好坏。中药的鉴定包括两个方面：一是中药材的真伪二是质量的高低。常用的鉴定方法有四种：来源鉴定、性状鉴定、显微鉴定及理化鉴定。中药的真伪是对中药品种的真假而言。因为中药历史悠久，用于临床的大多是野生资源，在长期的进化中会发生各种各样的变异，从而造成资源混乱。在人工种植的过程中由于缺乏有效的鉴定，造成了很大的损失尤其目前在中医药研究中的关键问题之一是中草药育种，更需要有真实可靠的资源保证,举例：人参的鉴别,人参按生长环境可以分为园参（人工种植参）、山参、野山参等分类，按加工方式可以分为白参、红参、糖参等，按产地可分为吉林人参（中国产）高丽参（韩国朝鲜产）西洋参（又名花旗参，加拿大美国产）其中高丽参、西洋参、现在很多都是国外引种中国种植，功效都一样。人工种植参因为产量大，价格也不是很高所以基本没有假货，只有好坏之分，种植参单位重量棵树越少价格越高，挑选的时候以干燥没有发霉、没虫蛀，颜色自然为好。,苦参饮片,苦参药材,北苍术原植物,北苍术药材,北苍术饮片,防风药材，蚯蚓头,防风饮片,防风原植物,苍耳子原植物,苍耳子饮片,蜈蚣,蒲公英原植物,蒲公英饮片,紫花地丁药材,紫花地丁原植物,黄芩,生地黄,熟地黄,夏枯草饮片,原植物,当归头,当归身,当归尾,当归片,分子生物学技术鉴定中草药,传统的生药鉴定方法是外观性状鉴别，以后又发展为显微鉴别和理化鉴别，但这些方法都各有其局限性。而作为当今世界生命科学领域中最活跃和最具前途的学科 分子生物学，正逐渐在中药鉴定工作中得到广泛应用。除矿物类药材外，来源于动、植物的中药均含有决定其生物学特性的遗传物质墓因，由于基因中 DNA 的多态性的特点，构成了物质表型的多样性。分子生物学的发展使人们能从干燥药材中提取 DNA 以 DNA 多态性为基础，根据不同种属间药材 DNA 的变异情况，揭示其亲缘关系，从而对生药和合成生药的中成药及其基原进行真伪优劣鉴定。由于 DNA 分析技术是针对生物的遗传物质进行鉴别其结果不受环境因素、样品形态和材料来源的影响，因此这项技术为中药鉴定提供了更加准确可靠的手段。,1.3 DNA指纹图谱技术,DNA指纹图谱技术及其在中药研究中的应用,作为中药指纹图谱的一个组成部分,DNA 指纹图谱这一现代分子生物学技术在现代中药研究中有其独特的作用。DNA指纹图谱技术在药材鉴别、道地药材研究、遗传育种和种质资源研究及中成药质量控制等领域有重要价值和广阔的应用前景。,DNA 指纹图谱的概念,核苷酸序列是生命有机体构建、维持和繁殖生命所必需的遗传信息。不同种生物体含有不同的DNA序列,同种生物体既有相同的DNA序列,保持同种生物体的遗传性状,又具有多态性,这种多态性可以是个体、种属或变异等引起的,它使得同种生物中的各个体千差万别,生物多样性正是由于其基因多态性的结果。由于这种核苷酸序列是相对稳定的,因而可以利用现代分子生物学技术构建DNA指纹图。,将生物体DNA模板进行PCR扩增,不同生物体得到的DNA 片段的大小、数目不同,再将这种扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,电泳结果显示的DNA 带型差异在紫外下成像,从而得到DNA指纹图。,DNA指纹图谱具有高度的个体特异性。在分子水平上检测基因多态性,比形态、组织和化学水平上检测更能代表其变异类的遗传标记,其鉴别结果更加准确可靠。DNA指纹技术灵敏度高,如果选择合适的扩增引物,其结果的重复性也非常好。,限制性片段长度多态性(简称RFLP)随机扩增多态性DNA(简称RAPD)任意引物 PCRPCR-RFLPRAPD-RFLP,应用于中药研究的DNA指纹技术有：,DNA 指纹图谱在中药研究中的应用,DNA 指纹图谱技术是在分子水平上、以药材基因型特征为鉴定指标的一种新技术。它直接分析遗传物质本身,是分析生物的基因型而非表现型,排除了环境因素给药材鉴定带来的干扰,也不受样品形态(药材原植物、饮片或粉末)和材料来源的影响,比传统的方法(性状、显微、化学、理化鉴定)更准确可靠。,它不仅能区分相近物种(同科、同属不同种),而且可以检测外型极为相似的同种不同变种、变型、品系、化学型乃至个体之间的DNA 的细微变异。这一技术近年来正越来越广泛地被应用于中药研究中。,I,III,II,诃 h 子,小诃子,大诃子,绒毛诃子,为清凉解毒中药，主治久泻；久痢；脱肛；喘咳痰嗽；久咳失音。,人参须根,人参主根,不同产地高良姜的气相指纹图谱,指纹图谱研究过程中的注意事项：1、在药效学指导下进行研究，保证指纹图谱反映的化学成分包括中药材中有效部位所含的绝大部分成分或有效成分的全部。2、样品的预处理过程及测定方法应简便、经济、易行，且专属性、准确度与重现性好。,1.4 生物活性物质的细胞工程,1.药用植物细胞组织和器官培养2.植株再生3.植物有效成分的生产4.毛状根培养和增殖技术5、植物活性成分的生物转化6.药用植物的快速繁殖7、多倍体育种,1.药用植物细胞组织和器官培养,植物细胞具有全能性，即单个细胞在适宜的环境下可分化发育成植株，并具有整株植物所具有的合成化合物的能力。这为通过植物组织和细胞培养来获得其药用活性成分提供了新途径，自 P.R.white 和 R.J.Gautherd 于 1939 年在实验室建立植物细胞和器官培养技术以来，经过科学家们的努力目前这项技术已发展成为一门精细的实验技术。在选材消毒、接种培养、诱导筛选、继代保存、分离鉴定等方面建立了一整套完整的技术方法。,再分化,脱分化,愈伤组织,外植体,试管苗,利用该技术在实验室大量繁殖稀有、珍贵和难繁殖的植物，可以有效地减轻野生资源的生存压力；通过快速萦殖，实现工厂化生产，以大量生产药用植物中的有效成分；同时还可用于脱病毒和育种工作，繁殖和保存去除病原菌的植物，从而达到复壮原种、提高品质和产量的效果。,试管苗大规模培养,移栽,经过炼苗的小苗，可以和一般植物一样进行大规模栽培,中国最早从事植物组织培养研究的先驱可追溯到 20 世纪 60 年代进行人参组织培养的中国科学院上海植物生理研究所的罗士韦研究员。半个世纪以来，据不完全统计，目前已有40 0多种植物建立了组织和细胞培养体系并从中分离出 600多种代谢产物，其中代表性的研究成果有：中国科 学院植物研究所的紫草细胞大规 模培养并且使紫草中主要成分 乙酸紫草素的含量提高了 4.7 倍，为保护天然紫草资源提供了重要途 径；华中理工大学的红豆杉细胞 大规模培养中国药科大学的 人参细胞培养；上海中医药大 学的黄芪毛状根大规模培养等。,植物细胞的大规模培养,应用生物技术进行中药材生产有以下几个优点：药材（或活性成分）的生产可以在人为控制条件下进行农药残留最的困扰，不受季节、气候条件与土壤环境等因家的制约可排除病虫害的侵袭与，严格控制药材质量；可进行特定的生物转化反应，生产人们需要的活性成分；通过活性成分生物合成路线进行遗传操纵，提高目的物的产量 通过加人或删除基因而改变其遗传特性，达到大幅度提升产量或合成新的活性产物。,中国在细胞工程方面的研究始于 20 世纪 60 年代中期，发展于 70-80 年代，在这两个时期，研究的主要内容包括药用植物的植株再生、愈伤组织培养等。从 80 年代末至今处于鼎盛时期，研究的大部分内容是通过高产组织或细胞系的筛选与培养条件的优化等方法达到降低成本及提高次生代谢产物产量的目的，以及通过对次生代谢产物生物合成途径的调控来达到相同的日的。另外，近来利用植物悬浮培养细胞或不定根、毛状根对外源化学成分进行生物转化的研究也在悄然兴起，并取得了一定的进展。近几年药用植物的植株再生（包括原生质体培养）、愈伤组织及悬浮细胞培养及中药化学成分的生物转化等几个方面的研究取得了一定的进展。,红豆杉毛状根,2、植株再生,近几年，除传统的通过器官、胚或体细胞胚形成植株的研究之外，有很多学者将着眼点放在珍稀濒危药用植物的快速繁殖与药用植物的品质改良上，如脱毒苗的研究、多倍体植株的形成、药用植物与其寄生菌共生关系的研究。其中药用植物与其寄生菌共生关系的研究很值得注意。中国医学科学院药用植物研究所郭顺星研究小组，在离体条件下通过筛选促进金线莲生长的优良共生菌种，建立了金线莲新的栽培繁殖方法，具有较大的理论意义和应用价值。药用植物的原生质体培养研究甚少，见诸报道的仅有 20 世纪 90 年代初中国医学科学院药物研究所进行的人参及西洋参的原生质体培养，以及近两年华中农业大学所进行的银杏原生质体培养。众所周知，原生质体培养在植物的品质改良中占有相当重要的位置，例如细胞融合、外源基因的导入等都离不开原生质体培养研究。,植物体细胞杂交过程示意图,3.植物有效成分的生产,自然界许多珍贵药用植物的有效成分是其次生代谢产物。次生代谢产物是指药用植物体内的一大类化合物，它们是细胞生命活动或植物生长发育止常运行的非必需的小分子化合物，其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性。20 世纪 50 年代开始利用植物细胞大量培养作为工业化生产药用植物次生代谢产物的主要手段。实践表明，采用药用植物细胞培养技术生产次生代谢产物是解决资源问题的较为有效的途径。,目前利用生物工程技术进行药用植物有效成分的生产主要采用液体悬浮培养、固定化细胞培养和发酵工程技术。液体悬浮培养主要用于生产细胞内的有效成分，利用该方法生产植物来源药物最成功的例子就是紫杉醇和紫草宁色素的生产。,紫杉醇是从短叶红豆杉树皮中提取的天然二萜类抗癌活性物质临床表明，紫杉醇不仅对晚期和复发性卵巢癌、转移乳腺癌、霍奇金淋巴瘤、头部和颈部癌有明显的疗效，而且对类风湿性关节炎、老年性痴呆等疾病也有很好的疗效。但是由于紫杉醇在红豆杉植物细胞中的含量极低，要治好一个卵巢癌病人，至少需要 2 一 3 棵 60 年龄的此种树的树皮。这种树属于稀有树种，且生长很慢，若不断取用的话，很快就要面临濒危的境地。为了克服这一问题，美国研究人员建立了快繁紫杉细胞株系，生产出的紫杉醇产量是从树皮中提取产量的 2-4 倍。,紫杉醇存在于红豆杉属植物的树皮、叶及茎中，其中树皮中的含量最高，大约从12000株成年紫杉树中才能提取1KG的紫杉醇，而且紫杉的生长周期很长，在世界分布很少 紫杉醇的国际市场价格为450美元/g,红豆杉惨遭剥皮,紫草宁色素是一组蒽醌类色素主要是作为染料和在化妆品中用于唇膏的生产，还兼有抑菌消炎作用，在国际市场上价格十分昂贵。H 本在 1983 年用细胞培养法生产紫草宁色素投人市场，成为药用植物细胞工程产品化和商业化的先例,紫草宁 可用作创伤、烧伤以及痔疮的治疗药物，同时又因为其漂亮的紫红色而作为高级色素使用紫草宁产生于亚洲的多年生 植物紫草的根部。但紫草资源严重不足，在日本，紫草已濒临灭绝，在我国，紫草（Arnebia euchroma)列入了国际二级保护植物,固定化细胞培养技术则主要用于生产那些胞外产生的可自发释放到培养液中的一些有效成分，如黄酮、蒽醌、各种色素和生物碱等。固定化细胞培养技术以其次生物质积累多、易于控制条件、易于收获等优点得到了许多人的重视。现已用固定化植物细胞进行全合成、半合成以及生物转化等反应生产多种药用成分如用辣椒生产辣椒素，10d 就可达 3.184 mg/I 的合成量，如果加人前体如苯丙氨酸、异构辣椒素，产量会增加 50-60 倍用希腊毛地黄细胞在褐藻酸盐的固定化下进行培养，可将有毒物质毛地黄苷转化为地高辛。,心血管系统用药-抗心力衰竭药,发酵工程技术主要用于大规模的生产药用植物的有效成分。中国药科大学在进行人参细胞培养时，在缺少反应罐体的条件下，采用在普通培养皿中，以廉价的吸水性较好的天然纤维为支持物，获得了投资少、见效快、节约能源和成本的培养方式，建立了日产 20-3Okg 的生产规模。目前这种产品已作为美容保健品投放市场，成为中国传统药材生物技术产物第一个商品化的例子,到目前为止，已经从 400 多种药用植物中建立了组织和细胞培养物，从中分离出 600 多种代谢产物。在中国，许多重要药用植物如人参、西洋参、丹参、紫草、甘草、黄连等的植物细胞培养都获得了成功，其中人参、新疆紫草细胞培养技术已接近了国际先进水平,利用植物组织和细胞培养进行工业化生产中药材或活性成分的品种，目前尚不紫草是其中的佼佼者植物组织和细胞培养实施工业化生产所遇到的主要问题有 4 个方面,利用植物组织和细胞培养成本大大高于采集野生植物或种植的生产方式因此，国内不少研究单位将注意力集中在资源稀少、活性成分价格昂贵的品种上。因为只有在生产成本小于或等于野生资源时，才有生产的实际意义，因此人们正在从事各种研究和探索，以求逐步解决这一矛盾 植物组织和细胞培养与微生物发酵相比，生长速度慢，活性物质产量低一般利用链霉菌发酵生产抗生素的发醉周期为 72-96h，其最终产物高达 8000m g/L 而植物组织和细胞培养的周期在 18d 以上，有效成分的含量也较低但也有例外如日本的 Tabata 等通过细胞培养来研究紫草宁衍生物其细胞是以促进紫草宁衍生物合成为主，通过二步培养紫草宁衍生物的产量多达 1500mg/L 含量达 13.6%)，较其栽培有效量提高到 13 倍，而时问只需 3 周。这样高的浓度在植物细胞培养中实属罕见，这是它之所以能实施工业化生产的基础,适合植物组织和细胞培养的生物反应器尚有待研究解决。这里需要指出的是由于人们对植物组织和细胞在离体培养条件下的生长与发育的规律了解甚少，在设计生物反应器中浓度较高时培养液成非牛顿流体如何解决充分混合与均一供氧，如何克服剪切力对培养细胞造成的伤害等一系列涉及基础理论研究的课题有待深人探索。对植物次生代谢产物合成途径及所参与反应的各种酶的了解不多，有的甚至连有效成分的化学结构尚未明确，因此对次生代谢的调控存在着很大的盲目性,4.毛状根培养和增殖技术,毛状根培养是20 世纪80 年代发展起来的基因工程和细胞工程相结合的一项技术，通过将发根农杆菌 中Ri 质粒含有的T-DNA 整合到植物细胞的DNA上，诱导植物细胞产生毛状根,毛状根属于激素自养型，具有有效成分含量高、生理生化和遗传性稳定、易于进行操作控制等特点，可在离体培养条件下表现出次生代谢产物的合成能力，还能够合成许多悬浮细胞培养所不能合成的物质，某些产物的产量甚至高于正常植物及悬浮细胞培养。可见，毛状根培养系统无论在生物量的增加，药用有效成分的积累还是生产稳定性方面，都显示了其独特的优越性，使得利用毛状根培养生产植物次生代谢产物具有极大的生产潜力。,到目前为止，国内外现已成功地培养出天仙子、黄芪、紫草、红花、青蒿、决明等药用植物的毛状根，人参皂甙、黄连素等已通过毛状根培养得以工业化生产。而如何实现药用植物毛状根的大规模培养，以及提高毛状根中有效次生代谢物的积累能力，成为众研究者关注的焦点。农杆菌是生活在植物根的表面依靠由根组织渗透出来的营养物质生存的一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。农杆菌主要有两种：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。,红苋菜毛状根,根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。引发冠瘿瘤的原因是，Ti质粒上的T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内表达，指导合成一种非常寻常的化合物冠瘿碱，进而引起转化细胞癌变。而发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增生高度分支的根系。,发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）感染双子叶植物形成的毛状根在近十几年中已经发展成为继细胞培养后又一新的培养系统。由于毛状根具有生长迅速、遗传性稳定和生化特性不易改变等特点，越来越受到人们的重视。这一培养系统对药材而育更为重要，因为约 1/3 的传统药材是植物的根部。是一种革兰氏阴性菌，能侵染大多数的双子叶植物、少数单子叶植物及个别的裸子植物，诱发被感染植物的受伤部位长出毛状根。发根农杆菌之所以具有这种致根性，是因为它具有能诱导毛状根产生的Ri质粒。,红豆杉毛状根,根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质粒上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系，被誉为“自然界最小的遗传工程师”。,5、植物活性成分的生物转化,生物转化是利用植物悬浮培养细胞或器官（如毛状根）中的一些酶体系对外源化学成分进行结构改造的一门技术以期得到活性更好、毒性更小或价值更大的先导化合物。由于植物体系本身固有的一些特性，利用植物培养体系进行转化可以弥补传统有机化学合成及微生物生物转化的不足。国内在这方面的研究甚少，近年来北京大学利用大黄毛状根、不定根和悬浮细胞对鬼臼毒素和鬼臼苦素等进行了生物转化研究，获得了几个有意义的产物；利用银杏和桔梗悬浮细胞对紫杉烷类化合物和秦皮香豆素类化合物进行了生物转化研究，也获得了一珍今人鼓舞的结果。,6、药用植物的快速繁殖,植物的快速繁育技术就是利用组织培养方法将植物体某一部分的组织小块进行培养，并诱导分化成大量的小植株，从而达到快速无性繁殖的目的。其特点是繁殖速度快周期短，不受季节、气候、自然灾害等因素的影响并可实现工厂化生产。利用这种技术可以解决药用植物的繁殖能力低、资源匾乏等诸多问题。名贵中药石解自古就被认为具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳、明目强身等功效。现代药理研究也表明，石解还具有杭肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、扩张血管及抗血小板凝集等作用。但是由于石解自然繁殖能力极低，生长缓慢，而以它为原料药材的中药大量生产，导致 了 野生石解资源的紧缺。人们通过大量研究，已经成功地利用组织培养的方法使其获得大量繁殖，从而解决了石解的来源问题，同时在石解的育种方面也有重要的生物学意义。,地黄是传统的中药，中国具有悠久的栽培历史，而且也有很多的优良品种。但是由于长期栽培而导致地黄病害严重急需培养抗病品种。如果采用常规农业选育抗病品种，少则需要 3 一 5 年，多则需要 10 余年，而利用生物技术则能够加快培育出地黄抗病品种。到目前为止，已有近 200 余种药用植物经离体培养获得了试竹植物，苦丁茶、芦荟、三白草、怀地黄、金钱莲、石解等试管繁殖技术已经用于药材种植，在增产及挽救道地药材资源等方面发挥重要作用,5、多倍体育种,染色体组的数目在 3 3n）或 3 个以上（3 们的个体就是多倍体。植物界的多倍体植株是极为常见的，它是在漫长的历史进化过程中不断适应环境而形成的。被子植物大约有 70 的种类是多倍体。由于多倍体植株具有许多对生产有利的特性，而自然界生产多倍体的过程又相当漫长，所以人们常用人一诱变的方法来培育多倍体植株。人工诱变的方法很多，最常用的是化学诱导法，用浓度为 0.01%-1.0的秋水仙素处理植物的生长点，可得到染色体数目加倍的植株。现在也有结合植物组织培养技术诱导出多倍体的方法。此方法操作简便，实验条件容易控制，重复性好诱导效率高，嵌合体少，易于大批量处理和筛选，而筛选出的优质株系再利用组织培养技术就可以在短期内得到大量植株大大缩短了育种年限,倍性育种，缩短育种年限,多倍体植物在药用植物生产中的应用主要包括：增强抗逆性，例如日本薄荷和库页薄荷的异源四倍体具有抗粉霉病、抗寒的优点；增加产量和有效成分的含量。大量研究资料表明，多倍休植株比二倍体高大，生物量增多，同时有些药用植物次生代谢产物含量明显增加。四倍体菘蓝比二倍体菘蓝的叶片宽大肥厚，茎秆粗壮，花、果实也显著增大。同时四倍体菘蓝叶片中靛蓝和靛玉红含量和根中氮基酸含量高于，倍体的 70%-100。再如曼陀罗四倍体的生物碱含量为原植物的 2 倍，而怀牛膝四倍体中的蜕皮激素比原植物高 10 倍。黄芥、丹参、福禄考四倍体的有效成分都优于原来的二倍体植株，有的还会产生新的性状和新的化学成分。但是在不同器官内也会出现不同情况。例如长春花四倍体植株叶内千物质减少，生物碱的含量也有所下降。所以在实际生产上利用多倍体时应考虑药用部位的产景和活性成分的含量，在获得多倍体株系后进行严格的筛选得到稳定而合乎要求的植株,1.5 发酵工程技术在药用植物资源开发中的应用,在 20 世纪 80 年代，中国医学科学院药物研究所进行了菌类植物冬虫夏草的大规模发醉培养研究，取得了成功，并开发形成产品投放市场；另外中国科学工作者还建立了三七、人参、西洋参、紫草、洋地黄、长春花、丹参、红豆杉等多种药用高等植物的液体培养系统，经过对培养基和培养条件等的优化已使有效成分达到或超过原植株。在此基础 上，并对长春花、三七、人参、紫草、红豆杉等进行了大规模培养的探索，其中红豆杉细胞大规模培养生产紫杉醇被列为国家“九五”攻关项目。至今已对人参和紫草悬浮细胞、黄芪、丹参和青篱毛状根培养系统进行了大规模培养，并对其化学成分及药理活性进行了深人的研究。对人参培养细胞的化学成分（皂苷、灰分、金属离子、氨基酸等）和药理活性（急哇毒性、镇静作用、抗疲劳作用、抗高温作用、吞噬机能）进行了分析，结果与种植人参无明显差异，目前已作为美容保健品投放市场，这是中国中药生物技术第一个商品化的例子。并且通过实验证实黄蔑毛状根具有增强动物免疫功能，促进骨髓造血，抗自由基，改善记忆，抗衰老，保护肾功能等作用，其作用的效价基本上与药用黄芪类似，其毛状根中皂昔和可溶性多糖含量稍高于药物黄芪。丹参毛状根的研究证实 7 种丹参酮化合物不仅存在于毛状根组织中，而且约 40分泌到培养基中，另外丹参毛状根也具有形成水溶性酚酸类化合物的能力。,药用植物发酵培养的国际发展趋势,“热门”药用植物的培养方兴未艾所谓“热门”药用植物是指大家关注比较多的植物，如人参、红豆杉（Taxus）、长春花（Catharanthus roseus）等。这些植物或者生长年限较长，或者有效成分的含量很低。人参是大家较为熟悉的一种畅销药用梢物，栽培需要 6 年的时间，往往是先砍掉山林，然后在 6 年的栽培过程中不可避免地使用大量的农药，而且由于“老参地”的问题以及农田栽参产量较低等原因导致山林的不断砍伐。因此，人参的大田栽培会导致生物多样性和水土的流失及重金属残留、农药残留等一系列问题。所以人参的组织和细胞培养的研究经久不衰。红豆杉和长春花中含有的有效成分紫杉醇（t。xol）和长春新碱（v incristine）是抗癌和治疗白血病的有效药物，但其含量极低仅有十万分之一或百万分之一。以红豆杉为例，治疗一个癌症病人所需要的萦杉醉的量要砍掉 3 株生长 60 年的红豆杉树方可获取，因此即使栽培速度再快，也赶不上病人的用药量。同时，紫杉醉和长春新碱的化学合成步张复杂，用化学合成的方法解决不了问题。正是因为这些原因吸引了大批的科学家从事红豆杉和长春花发醉培养的研究，每年都有大量的文章发表，研究涉及细胞培养、生物转化、毛状根培养及紫杉醇和长春新喊代谢机理的探讨等。目前，细胞培养生产前体物质并与化学合成相结合的方法有望实现最终的工业化。,1.6 现代生物技术在中药生物活性物质开发中的应用,中药和天然药物发挥药效活性的物质基础是天然活性成分。药用植物中天然活性成分的含量是微最的如长春花碱、美登木碱和紫杉醇等。中国是世界上使用和出口中药材最多的国家中药材 80 以上来自药用植物。随着中药现代化的发展，对药用植物资源的用量会不断增加。过量的野生资源采集不仅导致了中药材资源的濒危和物种的灭绝，而且还带来了严重的生态问题。如华北地区日益严重的沙尘暴与西北地区甘草的过度采挖就有着直接的关系，据报道每挖一株甘草就会破坏约 8 耐的草地为解决资源问题和保证中药产品的质量，中国正在大力开展中药材种植的 GAP(good agriculture practicc）基地建设。但是，单纯的大田栽培不仅不能完全满足日益增加的市场需求，而且大田栽培还会导致山林被砍伐、生物多样性消失、与粮食作物争夺上地、农药残留和重金属残留等诸多问题。例如，对于人参、西洋参等药用植物来说，由于“老参地”问题不能解决导致每年大量的山林被砍，造成水土和生物多样性的大量流失。原料药来源能否满足批量化的生产需求就成为所有天然创新药物开发所面临的重大难题，也是高水平天然药物能否广泛应用并走向世界的“瓶颈。因此，针对特定有效成分或组分生产的天然药物人工资源开发技术引起了学术界和企业界的极大关注。,1.7现代生物技术在生物资源开发应用中的前景,中国药用植物资源丰富，但如果在使用这些资源时只进行掠夺性开采和浪费使用，不仅会造成资源枯竭，还会出现生态被破坏和环境日益恶化的严重后果。保护药用植物资源，防止物种灭绝，是一个涉及宣传、教育、立法、科学研究、行政管理、经济贸易等方面的复杂问题。但利用生物技术方法，如组织培养、基因工程等建立种质保存基因库，保存遗传资源也是一种非常有效的方法,总之，现代生物技术在中药研究中的应用越来越广泛，越来越深人，这也是中药走向世界、走向现代化的需要。中国在这方面的研究己经渐渐兴起，理论及技术都相当成熟，有些方面如药用植物组织与细，而且在全国范围内已形成了一胞培养，已积累了二三十年的经验，理论及技术郡相自武热，而且在全国范围内已经形成了一 定的规模。今后研究的主要方向应该集中在：价值大且濒危的药用植物的组织细胞培养对次生代谢产物的产生进行调控；一些重要中药化学成分的生物转化。在发酵工程、酶和蛋白质工程、基因工程方面的研究还属基础研究距离应用还较远，应该抓住少数有应用前景的项目向深度和广度延伸，争取早日走向市场。另外，还应该加强动物药的生物技术研究。可以预见，随者对生物资挥研究的深入及进一步开发利用，在不久的将来，定可创制出拥有中国自主知识产权的新型中药，并使生物资源在保健品、绿色食品、添加剂化妆品等方面的综合开发利用取得更大的成果,思考题,名词解释：生物技术、发根农杆菌、简答题1.中药的鉴定包括哪两个方面，常用的鉴定技术有哪些？,谢谢！,