均相酶催化反应动力学.ppt

化学与生命科学学院,第2章 均相酶反应动力学,生化工程电子教案,2023/8/10,酶反应的基本特征,单底物酶反应动力学,第2章 均相酶催化应动力学,复杂酶反应动力学,有抑制的酶催化反应动力学,影响催化反应速率的因素,酶失活反应动力学,2023/8/10,第2章 均相酶催化应动力学回顾,1、化学动力学的有关内容？,化学动力学的研究对象、反应速度和速率区别、反应速率表示式、反应速率如何求？（微分式和图解法）、速率方程、反应机理。,2、有关酶的内容？,酶的特性、酶催化反应的特性、米氏动力学方程等,2023/8/10,第2章 均相酶催化应动力学回顾,机理以及温度、压力、催化剂等外界因素对反应速率的影响,化学动力学的研究对象,反应速度和速率区别,速度 Velocity 是矢量，有方向性。,速率 Rate 是标量，无方向性，都是正值。,2023/8/10,第2章 均相酶催化应动力学回顾,反应速率表示式,对任何反应：,2023/8/10,第2章 均相酶催化应动力学回顾,反应速率表示式,通常定容反应，反应速率为：,反应进度,2023/8/10,第2章 均相酶催化应动力学回顾,反应速率如何求？（实验图解法）,如何绘制动力学曲线?,用各种物理性质测定方法(旋光、折射率、电导率、电动势、粘度等),2023/8/10,第2章 均相酶催化应动力学回顾,速率方程,反应速率只与反应物浓度的一次方成正比的反应称为一级反应。,一级反应的微分速率方程,或,反应：,2023/8/10,第2章 均相酶催化应动力学回顾,一级反应的积分速率方程,速率方程,或,2023/8/10,第2章 均相酶催化应动力学回顾,反应机理,假定反应进行一段时间后，体系基本处于稳态，这时，各中间产物的浓度可认为保持不变，这种近似处理的方法称为稳态近似，一般活泼的中间产物可以采用稳态近似。,2023/8/10,第2章 第1节 酶催化反应的基本特征,具有催化活性的大分子生物物质，其物质组成是蛋白质。,在多数酶促反应中，酶以游离状态参与催化反应。均相的酶促反应，且多数是在液相中进行反应。,酶,1)Highly specific;,Catalytic characters of Enzyme,2)High efficiency;（催化效率表示）,3)Reaction in normal atmosphere and room temperature;,4)Enzyme denatured and catalytic activity lowered.,2023/8/10,第2章 第1节 酶催化反应的基本特征回顾,Common property of Enzyme-catalyzed Reactions,1)Enzymes can lower G#,increase the rate without being changed themselves.,2)Enzyme doesnt change the direction and balance.,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,一、什么是简单的酶催化反应,二、活性中间复合物学说,一种底物参与的不可逆反应,如：酶的催化水解反应；异构化反应,该学说有大量实验结果支持。包括两步，底物S与酶E结合成中间复合物ES，然后分解成产物P，并释放E。,对简单E催化反应，机理可表示为：,其中：k1，k1，k2反应速度常数 E，S，ES，P酶,底物,酶-底物复合物,产物,P9三点假设,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,三、动力学方程,上述机理下的动力学方程?,产物生成速率可表示为：,?,?,rP=k2CES,rS底物S的消耗速率mol/(L.s),CES如何求？,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,四、Miechaelis-Menten方程,在反应过程中，限制反应速度的反应是ES到E+P这一步反应；(1)E+S到ES的反应在整个过程中始终处于动态平衡；(2)酶以酶游离状态E和酶-底物复合物ES的形式存在，酶在反应过程中总浓度不变；(3)底物浓度比酶-底物络合物浓度要大得多。(4),（1）Michaelis平衡态假设,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,（2）方程的推导,四、Miechaelis-Menten方程,根据假设（1），有单一底物的酶催化反应的反应速度：,（2-1）,式中：CP，CS产物，底物的浓度 t时间,根据假设（2）有:,（2-2）,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,即：,（2-3）,式中：Ks 酶与底物复合物的解离常数,（2）Miechaelis-Menten方程的推导,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,根据假设（3），有：总酶量：,（2-4）,联立（2-1）、（2-2）、（2-3）有,（2-5）,（2）Miechaelis-Menten方程的推导,Miechaelis-Menten方程,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,（3）Miechaelis-Menten方程的讨论,两个动力学参数，s和rP,max,Ks 酶与底物复合物的解离常数,当rP=rP,max/2 有ss Ks表示酶与底物作用的特性,rP,max最大的酶促反应速率,表示全部的酶都呈复合物状态时的反应速率k2含义？,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,五、Briggs-Haldance方程,Miechaelis-Menten方程的适应条件:复合物ES生成产物的速率远小于分解成酶与底物的速率。若这一条件不能满足,则M-M的平衡假设不适用。,1925年，Briggs 和 Haldance 提出了拟稳态假设：认为在酶促反应过程中，反应的中间体ES（酶-底物复合物）的浓度不随反应时间而变化，即在酶促反应过程中，反应的中间体ES的浓度处于稳定的状态，称“稳定态理论”。,1、拟稳态假设,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,五、Briggs-Haldance方程,由拟稳态假设：,2、B-H方程的推导,又,（2-6）,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,2、B-H方程的推导,五、Briggs-Haldance方程,将（2-6）代入下式：,得：,式中,米氏常数；mol/L,（2-6）,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,3、B-H方程的讨论,五、Briggs-Haldance方程,米氏常数与解离常数,若k2k-1，km=kS，说明什么？,生成产物的速率大大慢于酶-底物复合物的分解速率。说明复合物结合力很弱。,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,六、M-M方程动力学特征,(2)CsKm,曲线?,曲线点Cs=Km 时r=?,(1)CsKm,(2-17),一级反应.Km很大时,大多数E游离,ES少,欲提反应速度,提高Cs,零级反应.因为Km很小,大多数E复合,游离E少,因而提高Cs,也不能提高反应速度,(3)Cs与Km数量关系介于两者之间,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,七、动力学参数的求取,(1)Lineweaver-Burk法(简称L-B法),欲建立完整的动力学方程,就必须求取动力学参数.M-M方程中的rmax和Km。因为非线性,难求.怎么办?,怎么办?,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,七、动力学参数的求取,（2）Hanes-Woolf法(简称H-W法),对L-B法方程式的等式两端同乘CS，此种方法减少了CS值过大或过小所带来的测量误差。,Slope=1/rmax,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,（3）Eadie-Hofstee法（简称E-H法）,七、动力学参数的求取,Slope=-Km,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,七、动力学参数的求取,4）积分法,由P11 式2-25,Slope=rmax/Km,2023/8/10,5）.回归直线方程的计算回归直线方程:y=a+bx(A=L c)做实验点:,用最小二乘法拟合直线，选择a和b使其残差（样本点到直线的垂直距离)平方和达到最小.,由最小二乘法确定b和a,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,九、例题,例1：在pH5.1、15下所测定的用葡萄糖淀粉酶水解麦芽糖的反应速度r如表所示。求这一酶促反应的动力学参数rmax和Km。,表1-1 葡萄糖淀粉酶水解麦芽糖的反应初速度与底物浓度,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,解：采用Lineweaver-Burk法，对实验数据回归，有,则,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,r,r,L-B作图法,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,采用Hanes-Woolf法，对实验数据回归，有,则,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,r,r,H-W作图法,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,采用Eadie-Hofstee法，对实验数据回归，有,则,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,r,E-H作图法,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,例2 葡萄糖在葡萄糖异构酶存在时转化为果糖的反应机理为:,试分别用如下不同方法推导出反应速率方程：（）平衡态近似法；（）拟稳态近似法。,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,解：（）平衡态近似法,rP=,=k2cXk2cEcP(a),因为 cE=cE,0cX所以 rP=k2cXk-2cP(cE,0cX)(b),又，根据平衡态近似法,(c),s,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,结合式(b)、(c)，得,(d),将式(d)代入式(a)，得,rP,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,（）拟稳态近似法,k1cEcS+k2cEcPk1cX k2cX=0(a),又 cE=cE,0cX(b),将式(b)代入式(a)，得,(c),2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,而 rP=,=k2cXk2cEcP(d),把式(b)及(c)代入式(d)，得,rP=,(e),若 k1k2和k1 k2,则,rP=,则,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,例3.有一均相酶催化反应，Km值为2103 mol.L,当底物的初始浓度cS,0 为1105 mol.L时，若反应进行1min，则底物的转化率xS为2。试计算：（）当反应进行3min时，底物转化率为多少？此时，底物和产物的浓度如何？（）当cS,0 为1106 mol.L 时，也反应3min,底物和产物的浓度又是多少？（）最大反应速率rP,max为多少？,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,解：（）因为cS,0Km,所以可按一级反应计算，,代入t=min，xS=0.02,代入后，得k=49.5min 于是可求得，当t=3min时，xS=0.06,cP=cS,0 xS=1105 mol.L 0.06=6107 mol.L,cS=cS,0cP=1105 mol.L6107 mol.L=0.94105 mol.L,2023/8/10,第2章 第2节 简单酶催化反应动力学,（）当cS,0=1106 时，cS,0Km,仍视为一级，同理，可得xS=0.06,cS=0.94106mol.L，cP=6108mol.L（）由,Km=2103mol.L得rP,max=4.04105mol.L.min1,49.5min，,2023/8/10,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,概述,因底物或产物浓度过高或其他外源化合物（抑制剂）影响而降低反应速度的现象.,何为抑制?,何为抑制剂?,任何能直接作用于酶并降低酶催化反应速率的物质称为酶的抑制剂。,2023/8/10,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,概述,抑制类型,E与I的基团成共价结合而使酶永远失活，如重金属离子Hg2+，Pb2+对木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶的抑制。,(1)可逆抑制,可用物理法（透析超滤等）把抑制剂（I）去除而恢复酶活性的抑制作用，E与I的结合存在解离平衡关系。,竞争性,非竞争性,反竞争性,混合型抑制,(1)不可逆抑制,2023/8/10,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,一、竞争性抑制的酶促反应动力学,当反应物系中存在与底物的结构相似的物质，这一物质也可能与酶的活性部位结合，形成非活性复合物，阻碍酶与底物结合，从而影响酶促反应（速率下降）。,、机理（琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸为延胡索酸）,、定义,Where:I=inhibitor;EI=non-activity complexThe rate denoted in substrate is:rSI=k2CES,2023/8/10,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,、方程推导,一、竞争性抑制的酶促反应动力学,基于稳定态理论，有,总酶量为,2023/8/10,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,、方程推导,一、竞争性抑制的酶促反应动力学,式中：KmI 竞争性抑制的表观M-M常数KI 抑制剂的解离常数,联立上面几个方程，有,2023/8/10,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,、竞争性抑制的rs-Cs曲线,一、竞争性抑制的酶促反应动力学,rmax/2,KmI（变大）,？,？,Km,当 I 0时，方程还原成米氏方程。,I 时，,KmI,rs 0,2023/8/10,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,一、竞争性抑制的酶促反应动力学,对有竞争性抑制的酶促反应动力学方程,取倒数得到,、有竞争性抑制的方程参数的求取,2023/8/10,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,一、竞争性抑制的酶促反应动力学,、有竞争性抑制的方程参数的求取,截距=,斜率=？,2023/8/10,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,Fig.Relation of Km and I,一、竞争性抑制的酶促反应动力学,、mI与CI关系,KI愈小，表示抑制剂与的结合力愈强。对催化反应抑制作用愈强。,2023/8/10,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,二、非竞争性抑制的酶促反应动力学,当反应物系中存在与酶的活性部位以外相结合，且这一结合与底物的结合无竞争性关系的抑制作用。与竞争性抑制相比较，当有非竞争性抑制剂时，提高底物浓度不会消除其抑制作用。,1、定义,2、机理,其中：k4，k-4，k5，k-5，反应速度常数 I，EI抑制剂，酶-抑制剂复合物 IES底物、酶-抑制剂三元复合物,2023/8/10,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,二、非竞争性抑制的酶促反应动力学,3、方程推导,基于稳定态理论，有,总酶量为,2023/8/10,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,二、非竞争性抑制的酶促反应动力学,联解上述方程,得有非竞争性抑制的酶促反应动力学方程为:,3、方程推导,说明最大反应速率降低了(1+CI/KI)倍,2023/8/10,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,二、非竞争性抑制的酶促反应动力学,rmaxI/2,rmax/2,?,Km,4、非竞争性抑制的rSI-Cs曲线,2023/8/10,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,二、非竞争性抑制的酶促反应动力学,、有非竞争性抑制的方程参数的求取,L-B法,或,2023/8/10,加入非竞争性抑制剂后，Km 不变，而Vmax减小,无抑制剂,非竞争性抑制剂,-1/km,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,二、非竞争性抑制的酶促反应动力学,、有非竞争性抑制的方程参数的求取,2023/8/10,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,二、非竞争性抑制的酶促反应动力学,根据,Slope=1/(rmaxKI),1/rmax,-KI,CI,1/rmax,、I的确定,2023/8/10,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,三、反竞争性抑制动力学 P18-19,3,3,1、定义及机理,2、方程推导,基于稳定态理论，有:,总酶量为:,2023/8/10,2、方程推导,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,三、反竞争性抑制动力学 P18-19,联解上述方程,得反竞争性抑制的酶促反应动力学方程为:,2023/8/10,双倒数作图：,加入反竞争性抑制剂，使Km和rmax均减小,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,三、反竞争性抑制动力学,3、反竞争性抑制的rSI-Cs曲线,、方程参数的求取,cs,2023/8/10,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,四、各种抑制的比较,1、动力学参数的比较,抑制形式 最大速率 米氏常数,无抑制 rmax Km,竞争性抑制 rmax,非竞争性抑制 Km,反竞争性抑制,2023/8/10,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,四、各种抑制的比较,无抑制剂 rmax，Km,竞争性抑制作用 rmax不变，Km变大,非竞争性抑制作用 rmax变小，Km不变,反竞争性抑制作用 rmax、Km变小,竞争性,非竞争性,反竞争性,2、L-B作图法的比较,2023/8/10,可逆抑制作用与不可逆抑制作用的鉴别,1.能否用透析、超滤或凝胶过滤等方法除去抑制剂。2.在测定酶活力系统中加入一定量的抑制剂，以反应速率对酶浓度作图。可逆抑制曲线过原点，不可逆抑制不过原点。,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,2023/8/10,抑制程度,如何通过抑制程度判断抑制类型？P20,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,2023/8/10,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,1、定义及机理,五、高浓度底物抑制作用的酶促反应动力学 P14,SES不具有催化活性,不能分解为产物的三元复合物,2023/8/10,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,五、高浓度底物抑制作用的酶促反应动力学,2、方程,应用稳态理论，可得到底物抑制的酶促反应动力学方程为:,底物抑制的rss与cs关系,2023/8/10,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,五、高浓度底物抑制作用的酶促反应动力学,3、方程讨论,根据,即,解得,2023/8/10,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,六、产物抑制作用的酶促反应动力学,P14-15,1、定义及机理,无活性,2、方程推导,应用稳态理论，可得到产物抑制的动力学方程为:,2023/8/10,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,P20 例2-3,P21 例2-4,2023/8/10,第2章 第3节 有抑制的酶催化反应动力学,例2-5,某酶催化反应，在cE0=2.22x10-10mol.L-1条件下，得到下述实验数据：,试用L-B法及线性回归法确定Km,rmax 和 k+2值,Cs.103 mol.L-1 0.071 0.147 0.223 0.310 0.602 1.47 2.60Rs.107 mol.L-1.s-1 1.31 2.45 3.37 3.90 5.63 7.47 8.17,2023/8/10,第2章 第4节 复杂的酶反应动力学,1、可逆反应动力学,2、双底物反应动力学,3、平行反应动力学,4、变构酶反应动力学,2023/8/10,第2章 第5节 反应条件对酶反应速率的影响,2023/8/10,第2章 第6节 酶的失活动力学,