叶绿体的分离及荧光观.ppt
,生物绘图1要求：细胞和组织绘图是根据显微镜下的观察内容绘制的，因此，首先要充分观察了解所绘材料的特点、排列及比例。选择有代表性的、典型的部位进行绘图。客观真实地反映材料的自然状态。即生物绘图要求具备高度的科学性和真实感，形态正确、比例适当、清晰美观。2、用线条和圆点来完成全图。如，用线条描绘细胞壁与膜。用“点”表示明暗和颜色的深浅，给予立体感3、不要只孤独的绘制一个细胞，要表现出显微镜下还有其他细胞的存在，,关于实验报告问题,1、0.17mol/LNaCl能促进细胞质流动（旱生与水生植物有区别）2、0.35mol/LNaCl如果使这两种细胞产生质的话，就不是这两种细胞的等渗浓度。3、用不同浓度的丙二酸钠处理时，如果细胞没有产生质壁分离，但细胞质流动还是减慢或停止，就说明此种浓度的丙二酸钠有竞争性抑制作用，但如果在看到某种浓度的丙二酸钠处理时，细胞产生了质壁分离，那就说明这种浓度的丙二酸钠是一种高渗液，细胞质停止流动更大程度上是由渗透压引起的？（请思考）4、氧化磷酸化抑制剂可分为三类，即呼吸抑制剂、磷酸化抑制剂和解偶联剂。,实验二、叶绿体的分离及荧光现象观察,实验意义与目的叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，是光合作用的重要场所，由于具有这一重要功能，所以叶绿体一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。一、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。二、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光,并熟悉荧光显微镜的使用方法。,细胞器是细胞质中具有一定结构和功能的微结构，在细胞生命活动中扮演着重要角色。对其结构和功能的研究,是细胞生物学的基本课题,其重要的研究手段之一是分离纯的亚细胞组分,观察它们的结构或进行生化分析。细胞器分离的过程包括两个主要阶段：破碎细胞和细胞组分的分离。,细 胞 器 分 离,常用的细胞破碎方法,细 胞 器 分 离,分离各种细胞组分的方法主要有：差速离心 速率-区带梯度离心 密度梯度离心 等密度离心,细 胞 器 分 离,差速离心方法较简单，但分辨率不高，沉降系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。,密度梯度离心（densitygradientcentrifugation）,用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞匀浆液混悬或置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞器分层、分离的方法。这类分离又可分为速率-区带梯度离心和等密度梯度离心两种。,优点是一次离心可分离提纯样品中几种组份，用于较精细的分离。但成本与技术要求高,原理：根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，通过离心力场的作用，使不同的颗粒在密度梯度层内形成一系列区带，从而达到彼此分离的方法。,A、速率-区带梯度离心流程图,B、等密度梯度离心流程图,原理：根据不同颗粒在密度梯度介质中存在着浮力密度差，在离心力场作用下，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置上形成区带，从而使不同浮力密度的颗粒得到分离的方法。,两种密度梯度离心方法的异同,表1:各种亚细胞构造在不同的离心介质中分离所需的离心力与时间,各种细胞器、大分子和病毒的密度及相应的沉降系数,图:各种细胞器、大分子和病毒的密度及相应的沉降系数,根据1924年Svedberg（离心法创始人-瑞典蛋白质化学家）对沉降系数下的定义：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。以每单位重力的沉降时间表示，并且通常为120010-13秒范围，10-13这个因子叫做沉降单位S,即1S=10-13秒,离心力与离心机转速转换公式：,图2:离心力与离心机转数的转换列线图,RCF1.11810-5r(n)(g),式中,RCF表示相对离心力,单位是重力加速度g（980厘米/秒2）,(g)表示重力加速度的倍数,r 为离心转子的半径距离，指离心管的重心至转轴中心间的距离，单位为厘米；n为转子每分钟的转数（rpm）。,为了便于进行转速和相对离心力之间的换算，人们在此公式的基础上制作了离心力的列线图。见图2.先在离心机半径标尺上取已知的离心半径和在转速标尺上取已知的转速，然后在这两点间取一条直线，与中间RCF标尺上的交叉点，即为相应的相对离心力数值，也是文献中常用的g。,r=8cmn=15,000rpm,RCF20,000g,一、荧光显微镜(Fluorescence microscope)结构组成,落射荧光装置:电源箱220V,作为一种激发标本内的荧光物质的能源，除了产生紫外线外，还能产生各种波长的可见光和大量的热,汞灯灯箱100W/DC,集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体.,1.两组光源:透射照明光源(卤素灯)；荧光光源(超高压直流汞灯或氙灯)；2.有特殊的滤光片:激发滤色片、二向分色镜和阻断滤片3.激发光波长：较短，因此，分辨力高于普通显微镜；4.荧光光源照明方式：通常为落射式。,紫外光(UV)：激发光谱区域：330-400nm;紫光(V)：激发光谱区域：395-415nm;蓝光(B)：激发光谱区域：420-485nm;绿光(G)：激发光谱区域：460-550nm；,二、荧光显微镜的 特点：,图：落射式荧光显微镜的光路,三、荧光显微镜的成像原理,荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其基本原理是利用一定波长的激发光（如紫外光和蓝光等）对样品进行激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。,什么是荧光?,物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态（基态）时释放出的光。,四、荧光的性质,保持固有的荧光特性荧光波长激发波长荧光强度极小于激发光的强度有不同程度的衰减荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率,用于观察能激发出荧光的结构。免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断等。,Fluorescence image of epithelial cell,DNA in blue and Microtubules in green,五、荧光显微术应用,六、注意事项,荧光显微镜检要在光线尽量暗的环境下进行；使用荧光显微镜时要注意不要直接观察激发光源，保护眼睛。汞灯开启后10min达到最大效率，在15min内不要关灯，有助于保护灯的寿命，一旦关灯须等3min后才能重新开启。凡是荧光染料都有一定毒性，请做好防护。利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间,有必要时立即拍照。荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“一”无或可见微弱荧光。“+”仅能见明确可见的荧光。“+”可见有明亮的荧光。“+”可见耀眼的荧光。,实验原理,叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行,以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。利用差速离心法将匀浆液离心，从而使叶绿体得到分离。分离过程最好在05的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如让叶绿素的自发荧光淬灭后，叶绿体也可吸附吖啶橙后发桔红色荧光。本实验利用荧光显微镜对叶绿体的荧光进行观察。,实验材料与试剂,材料：菠菜叶片 试剂：蒸馏水，0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(AO)：仪器：普通离心机，研钵,天平，荧光显微镜，显微镜，镊子，目镜测微尺，物镜测微尺，培养皿，纸，移液管，滴管，烧杯，载片，盖玻片，离心管,吸水纸等,配制方法：称取0.1g吖啶橙加蒸馏水100ml做干液，放冰箱备用，临 用前取1ml干液加1/15mol/L磷酸缓冲液（pH4.8）9ml。,吖啶橙(acridine orange，AO),吖啶橙是一种芳香杂环阳离子染料可透过细胞膜，不同浓度与pH的吖啶橙溶液所呈现的荧光颜色不同，这与其结构不同有关。吖啶橙与物质的结合一般有两种方式，潜入到物质结构中或由静电吸引堆积在物质表面，如DNA和RNA都能与吖啶橙结合的，在紫外光或蓝光(330485nm)激发下，DNA可被激发出530nm的荧光发射峰，RNA可被激发出640nm的荧光发射峰，因此，细胞核发亮绿色荧光，核仁和胞质RNA发桔红色荧光。之所以有两种不同荧光的产生是由于吖啶橙与双链DNA 和单链DNA或RNA的结合方式不同而决定的。它与DNA结合是潜入双链之间，而与单链DNA或RNA的结合则由静电吸引堆积在磷酸根上。叶绿体的次生荧光主要是吖啶橙堆积在其表面所致。,注意：吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光。,Molecular Formula:C17H20ClN3Molecular Weight:301.82,Absorption and fluorescence emission spectra of acridine orange bound to DNA,实验步骤,1.选取新鲜的嫩菠菜叶片，洗净擦干后去除叶梗和粗脉，撕成小碎块，称3g放于玻璃研钵中，加入10ml0.35mol/LNaCl溶液，匀浆3 5min。2.匀浆液用1-2层尼龙布过滤于50ml烧杯中。3.将滤液平分到2个离心管中，天平配平，1000r/min下离心2min。弃去沉淀。4.将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清，沉淀即为叶绿体。5.将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮，做两张临时装片：取一滴叶绿体悬液滴于载片上，加盖片观察；取一滴叶绿体悬液滴于载片上，再滴加1滴0.01%吖啶橙荧光染料，加盖片观察：在普通光镜下观察；在荧光显微镜下观察：先用明视野（白炽光灯下）和用低倍镜头观察，找到适当的标本后，再转高倍镜头，并将白炽光灯转换成以汞灯激发光作光源，用暗视野观察。,实验结果,1.普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄型，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色颗粒，即基粒。2.荧光显微镜下，选用蓝色激发滤光片，叶绿体自发荧光为火红色，间接荧光为桔红色。,问题：叶绿体发出的自发荧光和间接荧光的由来与作用机理有何不同？,实验结果,图：叶绿体自发荧光为火红色,实验报告,记录荧光显微镜下观察的叶绿体自发荧光和次生荧光现象，并分析结果，解释叶绿体发出的自发荧光和次生荧光的来由与作用机理有何不同？,1.分离叶绿体实验的原理是什么？操作过程中应注意什么？2.普通光学显微镜和荧光显微镜的原理有何异同点？3、什么叫离心力和转速，两者之间的关系如何？4、什么叫沉降系数，其单位用什么表示，如何定义？,思考题,
