《糖酶和蛋白酶》PPT课件.ppt

第三篇 食品工业酶,第六章糖酶,糖酶（Carbohydrases）的作用是裂解多糖中将单糖结合在一起的化学键，使多糖降解成较小的分子。糖酶还能催化糖单位结构上的重排，形成新的糖类化合物，这类反应被称为转糖苷作用(由糖基（G）与糖苷配基（R）组成的糖苷RG，把糖基转移给别的物质（A）生成AG的反应：RG+AR+AG)。一些酯酶能作用于酯化糖类，例如果胶酯酶。,主要的糖酶：淀粉酶、果胶酶、转化酶、乳糖酶、纤维素酶,第一节淀粉酶,淀粉酶(Amylases)不仅存在于动物中,也存在于高等植物和微生物中,能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称。淀粉酶作用于淀粉、糖原、多糖衍生物。,三类淀粉酶：-淀粉酶，从底物分子内部将糖苷键裂开；-淀粉酶，从底物分子的非还原性末端将麦芽糖水解下来；葡萄糖淀粉酶，从底物的非还原性末端将葡萄糖单位水解下来。,一、-淀粉酶（-1,4-葡聚糖-4-葡萄糖水解酶EC3.2.1.1）存在于植物、哺乳类动物组织和微生物。-淀粉酶以随机方式作用于淀粉而产生还原糖。-淀粉酶作用于淀粉时，将-1，4糖苷键裂开，产物的构型保持不变-淀粉酶:是一种内切酶,只能水解-1,4糖苷键,不能水解-1,6糖苷键,但可越过-1,6糖苷键水解-1,4糖苷键,但不能水解麦芽糖中的-1,4糖苷键,-淀粉酶以直链淀粉为底物时，反应一般按两个阶段进行：直链淀粉寡糖，快速，随机机制 寡糖葡萄糖和麦芽糖，缓慢直链淀粉：葡萄糖+麦芽糖+麦芽三糖+低聚糖的混合物,-淀粉酶作用支链淀粉时，产生葡萄糖、麦芽糖和一系列-限制糊精（4个或更多个葡萄糖基构成的寡糖，含有-1,6糖苷键）。支链淀粉：葡萄糖+麦芽糖+麦芽三糖+-极限糊精一般分解限度以葡萄糖为准是35-50，但在细菌的淀粉酶中，亦有呈现高达70分解限度的（最终游离出葡萄糖）极限糊精是指淀粉酶不能再分解的支链淀粉残基.-极限糊精是指含-1,6糖苷键由3个以上葡萄糖基构成的极限糊精.,1、分子大小相对分子质量为50,000左右，每一个分子含有一个Ca可能存在相对分子质量为100,000的二聚体，二聚体中锌原子在两个单体之间形成了交联。,2、钙的作用Ca 没有直接参与形成酶-底物络合物，但是它起着维持酶的最适宜构象的作用，从而使酶具有最高活力和最高的稳定性。在低pH和存在螯合剂的条件下，将酶分子中的钙完全除去，会导致酶基本上失活和对热、酸或脲等变性因素的稳定性降低。,3、温度对-淀粉酶作用的影响在与钙相结合的条件下，-淀粉酶的热稳定性高于-淀粉酶。不同来源的-淀粉酶具有不同的热稳定性，某些细菌-淀粉酶的最适温度可达70以上。在超过糊化温度时使用细菌-淀粉酶特别适宜，淀粉颗粒糊化后对于酶的作用变得非常敏感，往往在酶失活前淀粉已被完全水解。,高浓度的淀粉糊（3040%）能显著提高-淀粉酶的稳定性，它使地衣形芽孢杆菌淀粉酶和淀粉液化芽孢杆菌淀粉酶在110和8590下具有短时间的作用能力。,4、在-淀粉酶作用下淀粉分解速度-淀粉酶以随机的方式作用于淀粉，因而酶反应动力学比Michaelis-Menten方程所描述的要复杂得多。酶作用的淀粉底物在反应过程中分子量逐渐下降，因而Km和Vmax随底物分子量变化而变化。-淀粉酶水解葡聚糖的速度随聚合度的减小而很快地下降；它水解直链淀粉的速度比水解分支分子（支链淀粉和糖原）要高。,5、-淀粉酶活力测定的方法底物可溶性淀粉或糊精测定参数底物与碘显色能力下降(蓝至红棕色)的速度粘度下降的速度,二、-淀粉酶（-1,4-葡聚糖麦芽糖水解酶EC3.2.1.2）也称糖化淀粉酶，存在于高等植物，不存在于哺乳类动物。1、-淀粉酶的作用外切酶，从淀粉分子的非还原性端裂开-1,4-糖苷键，依次将一个麦芽糖单位水解下来，将C(1)的构形转变为-型。-淀粉酶不能绕过-1,6-糖苷键。以支链淀粉为底物时，5060%转变成麦芽糖，其余部分称为-限制糊精。作用于直链淀粉时也只有7080%转变成麦芽糖。当底物直链淀粉分子含奇数葡萄糖基时，-淀粉酶作用的最终产物除含有麦芽糖外，还含有麦芽三糖和葡萄糖。酶作用于麦芽三糖的速度是很慢的。,支链淀粉产物：麦芽糖+-极限糊精-极限糊精是指-淀粉酶作用到离分支点2-3个葡萄糖基为止的剩余部分.,2.-淀粉酶性质,耐酸,pH3时仍保持活性不耐高温,7015分钟失活钙离子对-淀粉酶有降低稳定性的作用酶蛋白中的巯基是-淀粉酶活力必需-淀粉酶是一种巯基酶,它能被许多巯基试剂抑制,2、-淀粉酶的作用机制酶的活性部位中至少含有三个特异基团、A和B 基团淀粉分子非还原性末端C(4)上的OH基当基团和C(4)上的OH基发生相互作用时，底物分子的第二个糖苷键恰到好处地配置在催化基团A和B的邻近处，这样就形成了具有反应力的酶-底物络合物。3、-淀粉酶活力的测定测定反应中麦芽糖形成的速度，或者用3,5-二硝基水杨酸、铁氢化钾或碱性铜盐溶液测定还原基团形成的速度。,三、葡萄糖淀粉酶外切酶，它从淀粉分子非还原性末端逐个地将葡萄糖单位水解下来，当它裂开淀粉分子中的-1,4-糖苷键时，将C(1)的构型从型转变成。较低的特异性，它能作用于-1,4-糖苷键、-1,3-糖苷键和-1,6-糖苷键，相对速度分别为100、6.6和3.6实际上单独使用葡萄糖淀粉酶并不能将支链淀粉完全降解。然而当有-淀粉酶参与作用时，它可将支链淀粉完全降解。葡萄糖淀粉酶水解-1,4-糖苷键的速度随底物分子量的增加而提高，当分子量超过麦芽五糖时，这个规律不存在。,四、淀粉酶在食品工业中的应用淀粉的液化从淀粉生产结晶葡萄糖,课堂练习,试比较-淀粉酶、-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶的异同并论述他们在水解淀粉的方式和产物上有何区别。,课堂讨论,人们在嚼馒头时为什么会感觉到甜味？,第二节果胶酶,PMG-polymethylgalacturonasePG-polygalacturonasePMGL-polymethylgalacturonidelyasePGL-polygalacturonidelyase,果胶酶的分类,有二价离子Ca2+存在时，Ca2+和果胶酸分子中的羧基形成交联，从而提高果蔬的质构强度。,1果胶甲酯酶（Methylesterase）,命名：果胶 果胶基水解酶（EC 3.1.1.11），也被称为果胶酯酶（Pectinesterase，PE）存在：高等植物和微生物中,使一些食品原料（例如番茄）的质构显著变弱。有内切（endo-）和端解（exo-）两种。,命名：聚-1,4-半乳糖醛酸苷糖基-水解酶 存在:高等植物和微生物中。催化的反应:水解-1,4 糖苷键,2.聚半乳糖醛酸酶(Po1ygalacturonase),命名：聚（-1,4-半乳糖醛酸苷）裂解酶,EC 4.2.2.2存在：微生物，非高等植物。催化作用：裂开果胶和果胶酸分子中的-1,4 糖苷键。遵循-消去机制，水不参与反应。生成一个含还原基团的产物和一个含双键（235 nm 有特征吸收）的产物。,有内切和端解两种类型,3.果胶酸裂解酶(pectate lyases),分解果胶的一个多酶复合物，通常包括原果胶酶、果胶甲酯水解酶、果胶酸酶。通过它们的联合作用使果胶质得以完全分解。天然的果胶质在原果胶酶作用下，转化成水可溶性的果胶；果胶被果胶甲酯水解酶催化去掉甲酯基团，生成果胶酸；果胶酸经果胶酸水解酶类和果胶酸裂合酶类降解生成半乳糖醛酸。,第三节 纤维素酶EC（3.2.1.4）,作用于纤维素和从纤维素派生出来的产物（1）水解1.4糖苷键（2）pH4-5（3）T=50-55 葡萄糖酸内酯、重金属离子（铜、汞离子）抑制纤维素酶半胱氨酸能消除它们的抑制作用，且激活纤维素酶,纤维素酶并不是一种单一组分的酶，而是一个由多种酶组成的复合酶体系，一般将纤维素酶分为3类：,(1)葡聚糖内切酶。这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解1,4糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素,1.纤维素酶的分类,(2)葡聚糖外切酶，包括1,4-D-葡聚糖水解酶和1,4-D-纤维二糖水解酶。这类酶作用于纤维素还原性和非还原性末端，水解1,4糖苷键，释放萄萄糖(葡聚糖水解酶)或纤维二糖(纤维二糖水解酶)。(3)葡萄糖苷酶。这类酶作用于小分子量底物时表现出最高的活力，可以将纤维二糖、纤维三糖及其他低分子纤维糊精分解为葡萄糖。,2.纤维素酶活力测定,总纤维素酶活力,活力测定：滤纸法、重量法、粘度法、还原糖,第四节 乳糖酶EC3.2.1.23,-D-半乳糖苷酶(乳糖酶)EC（3.2.1.23）在植物、动物和微生物中都存在存在于摄入奶产品的哺乳动物,禽没有乳糖酶 牛奶中的乳糖是很难消化的,有人喝奶后发生腹泻,腹痛的主要原因,牛奶用乳糖酶处理,使奶中的乳糖水解为葡萄糖和半乳糖,可解决上述问题,且能提高其风味品质,乳糖酶的反应机制,(1)酶+乳糖 酶-乳糖(2)酶-乳糖 半乳糖基-酶+葡萄糖(3)半乳糖基-酶+受体 半乳糖基-受体+酶 第3步中若受体为水，则表现为水解，生成半乳糖和葡萄糖；若受体为糖则表现为转移，生成低聚半乳糖,乳糖,-半乳糖苷酶,半乳糖,葡萄糖,+,最适pH：酵母(pH6.0)、霉菌(pH5.0)、细菌(pH7.0)酵母乳糖酶适用于牛乳、脱脂牛乳和浓缩乳制品；霉菌乳糖酶适用于奶酪工业的副产品乳清和浓缩 乳清中乳糖的水解。,pH值为6.56.7,pH值为4.2左右,乳糖酶活力测定,测定乳糖酶活力的方法有下列几种：根据反应过程中溶液旋光值的变化计算反应速度采用葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶-色素原测定反应中生成的葡萄糖量根据反应过程中还原糖量的变化计算反应速度。乳糖也是还原糖，反应体系具有高的空白值，给测定带来困难采用一种生色的化合物作为底物，经乳糖酶催化水解后，转变成一种有色产物，用分光光度法测定反应的速度 邻-硝基苯-D-半乳糖苷是乳糖酶最佳的生色底物。,什么是乳糖不耐症？,糖酶复习,淀粉酶(-淀粉酶、-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶)果胶酶纤维素酶(葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶、葡萄糖苷酶)乳糖酶,思考题一个直链淀粉分子有几个还原性末端？一个支链淀粉分子有几个还原性末端和几个非还原性末端？什么是糖酶，它主要包括哪几类，各自有何特点？果胶酶如何分类？在食品工业中如何合理使用果胶酶？,蛋白酶催化的最普通的反应是水解蛋白质中的肽键,第七章蛋白酶,一、R1和R2基团蛋白酶对R1和（或）R2基团具有特异性要求胰凝乳蛋白酶R1：Tyr、Phe or Trp残基的侧链胰蛋白酶R1：Arg or Lys残基的侧链胃蛋白酶R2：Phe残基的侧链羧肽酶 一类肽链端解酶，作用于肽链的游离羧基末端释放单个氨基酸。羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶C 二、氨基酸构型提供R1和（或）R2基团的氨基酸必须是L型的,第一节蛋白酶的特异性要求,三、底物分子的大小有些蛋白酶底物分子的大小是不重要的。-胰凝乳蛋白酶的最佳合成酰胺类底物-N-乙酰基-L-酪氨酰胺-胰蛋白酶最佳合成酰胺类底物-N-苯甲酰-L-精氨酰胺,有一些蛋白酶对于底物分子的大小具有严格的要求，例如酸性蛋白酶。,四、X和y的性质XH or 继续衍生出去yOH or 继续衍生出去从酶对X和y性质的特异性要求可以判断它们是肽链内切酶还是肽链端解酶。内切酶X和y必须继续衍生出去 X酰基、氨基酸残基 y酰胺基或酯基、氨基酸残基端解酶氨肽酶 X：H y不是OH 羧肽酶 y：OH X不是H,大多数蛋白酶不仅限于水解肽键，还能作用：,第二节蛋白酶的分类,按酶的来源分类木瓜蛋白酶papain无花果蛋白酶figficin菠萝蛋白酶bromelin 胰蛋白酶trypsin胃蛋白酶 pepsin 凝乳酶rennin,按作用模式肽链端解酶肽链内切酶按酶的活性部位的化学性质分类一、丝氨酸蛋白酶活性部位中含有丝氨酸残基，属于内切酶胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和枯草菌蛋白酶都属于这一类蛋白酶,二、巯基蛋白酶活性部位中含有一个或更多的巯基。植物蛋白酶和一些微生物蛋白酶属于这一类。三、金属蛋白酶活性部位中含有Mg Zn Mn Co Fe Hg Cd Cu 或 Ni离子羧肽酶A、一些氨肽酶和细菌蛋白酶属于这一类。EDTA和氰化物会使其失活。,四、羧基蛋白酶主要是最适pH2-4的酸性蛋白酶类，活性部位中存在两个羧基。胃蛋白酶、凝乳酶和许多霉菌蛋白酶在酸性pH范围内具有活力，它们属于这一类酶。第三节丝氨酸蛋白酶第四节巯基蛋白酶第五节金属蛋白酶第六节羧基蛋白酶(天冬氨酸蛋白酶),第七节蛋白酶活力的测定可适用两类底物蛋白质底物和合成底物一、蛋白质底物根据蛋白质经酶作用后在三氯醋酸（TCA）溶液中溶解度的变化来确定酶的活力。但不能提供在酶反应中被水解的肽键的数目。以亮氨酸为基准，采用茚三酮试剂显色，作标准曲线可以计算蛋白质中被水解的肽键的数目。570nm.常用的蛋白质底物酪蛋白中性和碱性条件变性血红蛋白酸性条件,二、合成底物蛋白酶的合成底物一般含有酯、酰胺或肽键1、硝基苯酯,用分光光度法测定反应产物特定波长下的吸光度,2、-N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）,用pH-stat法测定得到的游离的羧基,3、-N-苯甲酰-L-精氨酰-对-硝基苯胺,在波长410nm处测定对-硝基苯胺的量以牛乳为底物，测定凝乳酶使它产生凝块的能力-具有实用价值选择酶代替凝乳酶,第八节蛋白酶在食品工业中的应用（一）蛋白酶水解过程的控制,质子交换,肽键打开,基本反应,氨基的滴定,（二）水解度对蛋白质功能性质的影响1、溶解度,2、乳化能力,大豆蛋白质的乳化能力随DH增加而提高，在DH 5%时达到最高值，然后下降。,3、起泡作用,蛋白质经有控制的酶水解后，能提高蛋白质的起泡能力10倍以上,思考题蛋白酶如何分类？蛋白酶水解蛋白质的苦味来源及控制措施是什么？碱性蛋白酶活力测定基本原理及酶活力定义。,自学：酶催化反应动力学,在进行酶的活力测定时应该注意哪些因素？常用哪些方法来测定酶活力？简述各种方法的原理和优缺点。简述酶促化学反应的中间络合物学说，并阐明目前所得的该学说的主要实验依据。试根据平衡态理论和稳态理论分别推导米氏方程式，并简述各常见化学动力学参数Km、Vmax、kcat、kcat/Km等的意义简述温度、pH和激活剂等因素对酶促化学反应速度的影响。,