7第七章目的基因在宿主中的表达.ppt

第七章 目的基因在宿主中的表达,2011-10-22,1,目的基因在宿主中的表达,外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达 外源基因在高等植物细胞中的表达,2011-10-22,2,目的基因在宿主中的表达,绪：基因表达的关键因素,1.转录起始（关键和限速步骤）,转录宿主RNA聚合酶启动子,2011-10-22,3,目的基因在宿主中的表达,2.mRNA的延伸与稳定性,非特异性终止:衰减子,抗终止序列正确终止转录：终止序列mRNA稳定性与Poly(A)尾有关 载体上添加 Poly(A)掺入信号宿主RNase缺失,增强mRNA稳定性,2011-10-22,4,目的基因在宿主中的表达,强化转录终止的必要性,外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物。,过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：,转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降。,如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性。,过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗。,更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率。,2011-10-22,5,目的基因在宿主中的表达,3mRNA有效翻译,原核翻译AUG起始密码子SD序列:与16SrRNA互补结合位点，该序列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基SD序列与ATG之间合适距离3-9bp翻译起始区间内不形成明显二级结构(5)终止密码子：UAA、UAG、UGA,2011-10-22,6,目的基因在宿主中的表达,4外源蛋白的稳定性,融合蛋白分泌蛋白表达系统包涵体表达系统使用蛋白水解酶基因缺陷型受体细胞,2011-10-22,7,目的基因在宿主中的表达,5.目的基因的沉默,1）位置效应 目的基因位于甲基化程度高，转录活性低的异染色质上2）转录水平基因沉默 启动子甲基化和外源基因的异染色质化；目的基因的重复序列可导致自身甲基化3）转录后水平基因沉默 共抑制(cosuppression)是转录后水平的基因沉默，指被整合的外源基因沉默的同时，与其同源的内源DNA的表达也受到抑制。,2011-10-22,8,目的基因在宿主中的表达,一、外源基因在大肠杆菌中的表达,2011-10-22,9,目的基因在宿主中的表达,1.大肠杆菌表达外源基因的优势,全基因组测序，共有4405个开放阅读框,基因克隆表达系统成熟完善,繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定,被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物,2011-10-22,10,目的基因在宿主中的表达,2.大肠杆菌表达外源基因的劣势,缺乏对真核生物蛋白质的复性功能,缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统,内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白,细胞周质内含有种类繁多的内毒素,2011-10-22,11,目的基因在宿主中的表达,3.外源基因在大肠杆菌中高效表达的理论基础,启动子,终止子,核糖体结合位点,密码子,质粒拷贝数,2011-10-22,12,目的基因在宿主中的表达,3.1 启动子,目的基因,(1)启动子最佳距离的探测,A,E,E,目的基因E,E,A 酶切开,启动子Bal31酶解,2011-10-22,13,目的基因在宿主中的表达,PL,Ptrp,(2)启动子的构建,启动子PrecAPtraAPlacPtac,-35 区序列T T G A C AT T G A T AT A G A C AT T G A C AT T T A C AT T G A C A,-10 区序列G A T A C TT A T A A TT A A T G TT T A A C TT A T A A TT A T A A T,Ptac=3 Ptrp=11 Plac,2011-10-22,14,目的基因在宿主中的表达,(3)启动子的可控性：乳糖操纵子的启动子Plac,野生型的Plac与其控制区Olac偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基底水平表达；诱导物可以使启动子Plac介导的转录大幅提高。,诱导作用,2011-10-22,15,目的基因在宿主中的表达,(3)启动子的可控性：乳糖操纵子的启动子Plac,野生型的Plac上游附近拥有代谢激活因子（CAP）结合区，cAMP激活CAP，cAMP-CAP复合物与DNA结合，改变DNA结构，促进RNA聚合酶和启动子结合，使转录能力增强。葡萄糖代谢使cAMP减少，从而阻遏Plac介导的转录。因此，基因工程中使用的乳糖启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即Plac UV5。,cAMP的正调控作用,2011-10-22,16,目的基因在宿主中的表达,(3)启动子的可控性：色氨酸启动子Ptrp的可控性,色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目基因的表达。,2011-10-22,17,目的基因在宿主中的表达,3.2 终止子,2011-10-22,18,目的基因在宿主中的表达,强终止子的选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌 rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的T。对 于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终 止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用。终止子、启动子等，可以通过特殊的探针质粒从细菌或 噬菌体基因组DNA中克隆筛选。,3.3 核糖体结合位点RBS,外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS，Ribosome Binding Site）,2011-10-22,19,目的基因在宿主中的表达,(1)核糖体结合位点的结构,大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：,位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5 UAAGGAGG 3：即,Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中,的16S rRNA 3端区域3 AUUCCUCC 5并与之专一性结合，将,mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译。,翻译起始密码子：大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子。,SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成,基因编码区5 端若干密码子的碱基序列,2011-10-22,20,目的基因在宿主中的表达,(2)核糖体结合位点对外源基因表达的影响,SD序列的影响：,一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低。,2011-10-22,21,目的基因在宿主中的表达,SD序列与起始密码子之间的序列的影响：,SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌-半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍。,2011-10-22,22,目的基因在宿主中的表达,SD序列与起始密码子之间的距离的影响：,SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低。,2011-10-22,23,目的基因在宿主中的表达,起始密码子及其后续若干密码子的影响：,大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50%而UUG只及AUG的25%。除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5 端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位。,目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的。,2011-10-22,24,目的基因在宿主中的表达,3.4 密码子,（1）生物体对密码子的偏爱性,不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：,密码子与反密码子相互作用的自由能：性中等强度规律,如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少；如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；,细胞内tRNA的含量,生物基因组中的碱基含量：在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体X174）基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高；而在GC丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子占90%以上的绝对优势。,2011-10-22,25,目的基因在宿主中的表达,Codon Usage Database,Aspergillus oryzae,Aspergillus niger,Saccharomyces cerevisiae,Escherichia coli,2011-10-22,26,目的基因在宿主中的表达,（2）密码子偏爱性对外源基因表达的影响,由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程度的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：,外源基因全合成同步表达相关tRNA编码基因,2011-10-22,27,目的基因在宿主中的表达,外源基因全合成,按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子。重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法。,实验技术：密码子优化,http:/genomes.urv.cat/CAIcal/OPTIMIZER,2011-10-22,28,目的基因在宿主中的表达,同步表达相关tRNA编码基因,对于那些含有不和谐密码子种类单一、出现频率较高、而本身分子量又较大的外源基因而言，则选择相关tRNA编码基因同步克隆表达的策略较为有利。例如，在人尿激酶原cDNA的412个密码子中，共含有22个精氨酸密码子，其中7个AGG、2个AGA，而大肠杆菌受体细胞中tRNAAGG和tRNAAGA的丰度较低。为了提高人尿激酶原cDNA在大肠杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个tRNA编码基因克隆在另一个高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体细胞对外源基因高效表达的制约作用。,2011-10-22,29,目的基因在宿主中的表达,3.5 质粒拷贝数,（1）质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响,目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因表达水平的下降。,解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道。,2011-10-22,30,目的基因在宿主中的表达,（2）质粒扩增时序的控制,pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子，在28时，每个细胞的质粒拷贝数为60；在42时，拷贝数迅速增至300-600。这是因为，在42时，受体细胞染色体上的CI基因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活，从而使受温度调控的质粒的拷贝数增加。,2011-10-22,31,目的基因在宿主中的表达,4.大肠杆菌基因工程菌的构建策略,包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建,2011-10-22,32,目的基因在宿主中的表达,4.1 包涵体型异源蛋白的表达,（1）包涵体及其性质,在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下以包涵体的形式存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。,2011-10-22,33,目的基因在宿主中的表达,（2）以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点,包涵体表达形式的优点：,能简化外源基因表达产物的分离操作,包涵体的水难溶性及密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来。,能在一定程度上保持表达产物的结构稳定,在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁。,2011-10-22,34,目的基因在宿主中的表达,包涵体表达形式的缺点：,以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性-复性操作，才能回收得到具有正确空间构象的目标蛋白，因此包涵体变性-复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%。,2011-10-22,35,目的基因在宿主中的表达,（3）以包涵体形式表达目的蛋白的操作,如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择高表达的载体。事实上，这种高表达率也是包涵体法的长处所在。,2011-10-22,36,目的基因在宿主中的表达,包涵体的溶解与变性：包涵体的溶解与变性的主要任务是在人工条件下，拆开包涵体内蛋白质中错配的二硫键和次级键，使包涵体溶解并重新进入复性途径。能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括：,（4）包涵体的变性-复性操作,清洗剂：SDS、正十二醇肌氨酸。廉价，但影响复性和纯化促溶剂：盐酸胍、尿素。前者昂贵，尿素便宜，但常被自发形成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应。混合溶剂：如尿素与醋酸、二甲亚砜等联合使用，溶解力强。极端pH：廉价，但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应。,2011-10-22,37,目的基因在宿主中的表达,包涵体的复性与重折叠（refolding）：,包涵体的复性与重折叠的主要任务是：将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠；通过次级键的形成使蛋白质复性。,包涵体复性操作的方法包括：一步稀释法：蛋白复性与浓度无关，但集聚与浓度关系很大。分段稀释法：逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生。试剂添加法：精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca 2+。蛋白修饰法：氨基柠檬酸酐酰化，蛋白带负电，抑制集聚。产物隔离法：将变性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞。分子伴侣法：GroEL、GroES、DnaK，固定化，共表达。,2011-10-22,38,目的基因在宿主中的表达,包涵体的复性与重折叠（refolding）：二硫键形成在包涵体变性体系中，始终存在着还原剂，使多肽链中的巯基保持还原状态，防止二硫键错配导致严重的集聚。在变性操作结束后，这些游离型的巯基必须重新配对形成二硫键，此时多肽链也重新发生折叠。形成二硫键的方式主要有：化学氧化法（A）：需要电子受体，最廉价的电子受体为空气，二硫键形成是随机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠。二硫键交换（B）：需要还原型和氧化型谷胱甘肽（GSH和GSSG），二硫键形成相对特异，因此适用性较广，重折叠效果好。,2011-10-22,39,目的基因在宿主中的表达,4.2 分泌型异源蛋白的表达,在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件。,2011-10-22,40,目的基因在宿主中的表达,（1）以分泌形式表达目的蛋白的优缺点,分泌表达形式的优点：,目的蛋白稳定性高 重组人胰岛素原若分泌到细胞周质中，其稳稳定性大约是在细胞质中的10倍。目的蛋白易于分离,目的蛋白末端完整 相当多的真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠杆菌的信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其N端的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去。,2011-10-22,41,目的基因在宿主中的表达,分泌表达形式的缺点：,相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，其表达效率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍。,2011-10-22,42,目的基因在宿主中的表达,（2）蛋白质的分泌机制,原核细菌周质中含有多种分子伴侣可阻止分泌蛋白的随机折叠，分泌在细胞周质或培养基中的重组蛋白很少形成分子间的二硫键交联，因此与包涵体相比，分泌型重组蛋白具有较高比例的正确构象，生物活性的回收率增加，且对蛋白酶不敏感。,2011-10-22,43,目的基因在宿主中的表达,（3）分泌型目的蛋白表达系统的构建,有些革兰氏阴性菌的细菌素释放蛋白，它激活定位于内膜上的磷酸酯酶，导致细菌内外膜的通透性增大。,因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上，并转化宿主菌，即可构建完全分泌型的受体细胞。此时，用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，使用相同性质的启动子介导目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌。,2011-10-22,44,目的基因在宿主中的表达,4.3 融合型异源蛋白的表达,除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放阅读框进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于N端，异源蛋白位于C端。通过在DNA水平上人工设计引入蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放异源蛋白。,2011-10-22,45,目的基因在宿主中的表达,（1）以融合形式表达目的蛋白的优缺点,目的蛋白稳定性高：尤其对分子量较小的多肽效果更佳。,目的蛋白易于分离：利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白。,目的蛋白表达率高：与受体蛋白共用一套完善的表达元件。目的蛋白溶解性好：由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性。,目的蛋白需要回收：融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获得目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段。,2011-10-22,46,目的基因在宿主中的表达,（2）融合型目的蛋白表达系统的构建,融合蛋白表达质粒的构建原则：,受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化。,外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体结构基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，为目的蛋白分离回收创造条件。,两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺。,两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架。,2011-10-22,47,目的基因在宿主中的表达,用于融合蛋白构建的受体蛋白：,谷胱甘肽转移酶（GST）：维持良好空间构象麦芽糖结合蛋白（MBP）：促进分泌,金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA）：免疫亲和层析硫氧化还原蛋白（TrxA）：维持良好空间构象外膜蛋白（OmpF）：促进分泌,-半乳糖苷酶（LacZ）：免疫亲和层析,泛素蛋白（Ubi）：维持良好空间构象,2011-10-22,48,目的基因在宿主中的表达,（3）目的蛋白的回收,融合蛋白中受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋白的空间构象和生物活性，如果将之注入人体还会导致免疫反应，因此在制备和生产药用目的蛋白时，将融合蛋白中的受体蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位点专一性断裂方法有两种：化学断裂法 酶促裂解法,2011-10-22,49,目的基因在宿主中的表达,化学断裂法：,用于蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为溴化氰（CNBr）。它与多肽链中的甲硫氨酸残基侧链的硫醚基反应，生成溴化亚氨内酯，后者不稳定，在水的作用下肽键断裂，形成两个多肽降解片段。其中上游肽段的甲硫氨酸残基转化为高丝氨酸残基，而下游肽段N端的第一位氨基酸残基保持不变。这一方法的优点是回收率高（可达到85%以上），专一性强，而且所产生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，与真核生物细胞中的成熟表达产物较为接近。然而，如果异源蛋白分子内部含有甲硫氨酸残基，则不能用此方法。,2011-10-22,50,目的基因在宿主中的表达,酶促裂解法：单残基位点蛋白酶酶促裂解法的特点是断裂效率更高，同时每种蛋白酶均具有相应的断裂位点决定簇，因此可供选择的专一性断裂位点范围较广。几种断裂位点专一性最强的商品化蛋白酶分别在多肽链中的精氨酸、谷氨酸、赖氨酸残基处切开酰胺键，形成不含上述残基的下游断裂肽段，与溴化氰化学断裂法相似。,用上述蛋白酶裂解融合蛋白的前提条件是外源蛋白分子内部不能含有精氨酸、谷氨酸、赖氨酸残基，如果外源基因表达产物为小分子多肽，这一限制条件并不苛刻，但对大分子量的异源蛋白来说，上述三种氨基酸残基的出现频率是相当高的。,2011-10-22,51,目的基因在宿主中的表达,酶促裂解法：多残基位点,为了克服仅切单一氨基酸残基的蛋白酶所带来的应用局限性，可在受体蛋白编码序列与不含起始密码子的外源基因之间加装一段编码寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接头片段，该寡肽为具有蛋白酶活性的凝血因子Xa的识别和作用序列，其断裂位点在Arg的C末端。纯化后的融合蛋白用Xa处理，即可获得不含上述寡肽序列的目的蛋白。由于Xa的识别作用序列由四个氨基酸残基组成，大多数蛋白质中出现这种寡肽序列的概率极少，因此这种方法可广泛用于从融合蛋白中回收各种不同大小的目的蛋白产物。,2011-10-22,52,目的基因在宿主中的表达,ATC GAA GGT CGC GAA GCT TCA GCT GGG ATC CGG TAC CGA TAT CAG ATC TCC CGG GGC GGC CGC,Xa-1,Ile Glu Gly Arg Glu,ATC GAA GGT CGC GAA AGC TTC AGC TGG GAT CCG GTA CCG ATA TCA GAT CTC CCG GGG CGG CCG C,Xa-2,ATC GAA GGT CGC GAA AAG CTT CAG CTG GGA TCC GGT ACC GAT ATC AGA TCT CCC GGG GCG GCC GC,Xa-3,NruI HindIII PvuII BamHI KpnI EcoRV BglII SmaI NotI,Xa因子切割位点,2011-10-22,53,目的基因在宿主中的表达,4.4 寡聚型异源蛋白的表达,构建串联型异源蛋白表达载体，将多拷贝的外源基因克隆在一个低拷贝质粒上，以取代单拷贝外源基因在高拷贝载体上表达的策略。,2011-10-22,54,目的基因在宿主中的表达,4.5 整合型异源蛋白的表达,整合型的目的基因随受体细胞染色体DNA的复制而复制，在大多数情况下相当稳定，工程菌在没有选择压力存在下可以连续培养而不丢失目的基因表达盒，这对以改良物种遗传性状为目的的基因工程案例特别有意义。,2011-10-22,55,目的基因在宿主中的表达,4.6 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建,无论是在真核生物还是在原核细胞中，重组目的蛋白表达后都会面临被降解的命运，其稳定性甚至还不如半衰期较短的受体细胞内源性蛋白质。,在大多数情况下，重组目的蛋白的不稳定性可归结为对受体细胞蛋白酶系统的敏感性。然而越来越多的实验表明，重组目的蛋白在受体细胞内的半衰期可以通过蛋白序列的人工设计以及受体细胞的改造加以调整和控制。,2011-10-22,56,目的基因在宿主中的表达,5.基因工程菌的遗传不稳定性及其对策,基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制,改善基因工程菌不稳定性的策略,2011-10-22,57,目的基因在宿主中的表达,5.1 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制,（1）工程菌遗传不稳定性的表现形式,基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性，这种不稳定性具有下列两种表现形式：,结构不稳定性：重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失。,分配不稳定性：整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸（curing）,2011-10-22,58,目的基因在宿主中的表达,（2）工程菌遗传不稳定性的产生机制,受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解；外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢；能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序；重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配，这是重组质粒逃逸的基本原因；受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排。,2011-10-22,59,目的基因在宿主中的表达,（3）重组质粒的逃逸率,当含有重组质粒的工程菌在非选择性条件下生长时，培养系统中一部分细胞不再携带重组质粒，这些空载细胞数与总细胞数之比称为称为重组质粒的宏观逃逸率。重组质粒逃逸的原因有：,高温培养、表面活性剂（SDS）、药物（利福平）、染料（吖啶）促使重组质粒渗漏；受体细胞中的核酸酶降解重组质粒；重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配，细胞所含重组质粒拷贝数的差异随着细胞分裂次数的增多而加剧。,2011-10-22,60,目的基因在宿主中的表达,5.2 改善基因工程菌不稳定性的策略,（1）改进载体受体系统,以增大质粒稳定性为目的的构建方法包括：,将R1质粒上的parB基因引入表达型载体中，其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞；正确设置载体上的多克隆位点，禁止DNA片段插在非稳定区内；,2011-10-22,61,目的基因在宿主中的表达,（2）施加选择压力,根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素。但注意，药物和食品生产时禁止使用抗生素。根据载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份。培养基复杂，成本较高。,2011-10-22,62,目的基因在宿主中的表达,（3）控制目的基因的过量表达,2011-10-22,63,目的基因在宿主中的表达,（4）优化基因工程菌的培养工艺,使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度；使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数。,培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定；培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定。,2011-10-22,目的基因在宿主中的表达,64,6.利用重组大肠杆菌生产人胰岛素,1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年，Novo公司推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。上述由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有无免疫原性、注射吸收迅速等优点，充分展示了基因工程在生物医药领域中的巨大潜力。,2011-10-22,65,目的基因在宿主中的表达,6.1A链和B链分别表达法,基因工程菌的构建策略：,2011-10-22,66,目的基因在宿主中的表达,表达产物的后处理路线：,2011-10-22,67,目的基因在宿主中的表达,生产技术的评价：,由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低，通常只有10%-20%，因此采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。为了进一步降低生产成本，美国Ely LiLi公司随后又建立了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线。,2011-10-22,68,目的基因在宿主中的表达,6.2人胰岛素原表达法,基因工程菌的构建策略：,2011-10-22,69,目的基因在宿主中的表达,表达产物的后处理路线：,2011-10-22,70,目的基因在宿主中的表达,生产技术的评价：,在人胰岛素原表达工艺中，由于C肽的存在，胰岛素原能形成良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率也相应提高，折叠率高达80%以上。虽然这条工艺路线并不比AB链分别表达法更为简捷，而且还要使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷，使得每克最终产品的成本仅50美元。目前美国Ely LiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。,2011-10-22,71,目的基因在宿主中的表达,6.3 A链和B链同时表达法,2011-10-22,72,目的基因在宿主中的表达,6.4分泌型重组人胰岛素表达法,上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序列与大肠杆菌b-半乳糖苷酶基因拼接的方法，所产生的融合型重组蛋白表达率高、稳定性强，但不能分泌，只要以包涵体的形式存在于胞质中。一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰岛素或胰岛素原编码序列与b-內酰胺酶基因拼接，b-內酰胺酶通常能被大肠杆菌分泌到胞外。由此获得的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合蛋白的优良特性，为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担。,2011-10-22,73,目的基因在宿主中的表达,二、外源基因在酵母菌中的表达,2011-10-22,74,目的基因在宿主中的表达,1.酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征,1.1酵母菌的分类学特征,酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。,如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。,2011-10-22,75,目的基因在宿主中的表达,1.2酵母菌表达外源基因的优势,全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便；具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统；大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉；能将外源基因表达产物分泌至培养基中；不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe，GRAS）；酵母菌是最简单的真核模式生物,2011-10-22,76,目的基因在宿主中的表达,2.酵母菌的宿主系统,广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌,提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌,抑制超糖基化作用的突变宿主菌,减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌,2011-10-22,77,目的基因在宿主中的表达,目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：,酵母属：如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,克鲁维酵母属：如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）,毕赤酵母属：如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）裂殖酵母属：如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）汉逊酵母属：如多型汉逊酵母（Hansenula polymorpha）,其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。,2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌,2011-10-22,78,目的基因在宿主中的表达,能提高酿酒酵母中重组蛋白产量或改善其质量的突变类型,突变类型ssc1ssc2rgr1ose1ssc11rho-,生物效应改善重组蛋白分泌提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达改善重组蛋白分泌提高重组蛋白表达,作用位点钙离子依赖型的ATP酶转录后加工转录水平转录水平羧肽酶Y转录水平,2011-10-22,79,目的基因在宿主中的表达,2.2 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌,mnn,alg,och,2.3 抑制超糖基化作用的突变宿主菌,酵母菌普遍拥有蛋白质的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。,能抑制超糖基化的突变类型,突变类型,生物效应甘露糖生物合成缺陷型天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型外侧糖链添加缺陷型,2011-10-22,80,目的基因在宿主中的表达,许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，它们常常影响蛋白质的生物活性。,2.4 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌,泛素降解途径衰减的酿酒酵母,UBI 4缺陷型：在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4缺陷突变株能正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体。,UBA1缺陷型：UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解。,Ubc4-ubc5 双突变型：七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。,2011-10-22,81,目的基因在宿主中的表达,3.酵母菌的载体系统,酵母菌中的野生型质粒酵母菌克隆表达质粒的构建,2011-10-22,82,目的基因在宿主中的表达,3.1 酵母菌中的野生型质粒（1）酿酒酵母中的2环状质粒,几乎所有的酿酒酵母中都含有2双链环状质粒，拷贝数达50至100个。,IRs 反向重复序列，600 bp，重组FLP 编码产物驱动IRs的同源重组,REP 编码产物控制质粒的稳定性STB REP的结合位点接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及克鲁维酵母属中的pKD1等，均与2质粒类似。,2011-10-22,83,目的基因在宿主中的表达,（2）乳酸克鲁维酵母中的线状质粒,乳酸克鲁维酵母中含有两种不同的双链线状质粒pGKL1和pGKL2。拷贝数为50-100个，分别携带K1,K2两种能使多种酵母菌致死的毒素蛋白编码基因（），同时含有毒素蛋白抗性基因。,2011-10-22,84,目的基因在宿主中的表达,3.2 酵母菌克隆表达质粒的构建,（1）含有ARS的YRp质粒的构建,ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。,以ARS为复制子的质粒称为YRp,以2质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp,上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但培养几代后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由