《蛋白表达纯化》PPT课件.ppt
北京康为世纪生物科技有限公司 Beijing CoWin Biotech Co.,Ltd.,康为世纪 原核表达及纯化,蛋白表达流程,序列分析表构建达载体蛋白表达蛋白纯化蛋白检测,原核表达,非融合型表达载体融合型表达载体-带标签的表达载体（His、GST）具有编码不同多肽的标签序列，为定位、检测或纯化目的蛋白提供方便。若蛋白较小可加入融合标签，促进蛋白正确折叠。-分泌型表达载体可使外源基因产物直接分泌到大肠杆菌的外周腔，减少在胞内表达且表达产物对细菌的毒性，同时外周腔中的蛋白酶活性低，有助于提高融合蛋白的稳定性。,优势：遗传背景清楚、表达量高、产物易纯化、使用范围广。劣势：原核表达系统翻译后修饰体系不完善，表达产物活性低。,原核表达,目的基因的获取 选择载体、构建重组表达质粒 转化受体菌 重组体的筛选鉴定,I 重组表达载体克隆,1.目的基因获取：基因组DNA、mRNA反转录cDNA、人工合成2.常用载体：His标签：pET系列（pET28a、pET32a）、pQE系列 GST标签：pGEX系列3.构建重组质粒：选择合适的内切酶位点、酶切、连接4.转化感受态细胞：热击法转化非表达型感受态菌5.重组体的鉴定：阳性抗药克隆菌落PCR 阳性抗药克隆提质粒、酶切鉴定 测序,原核表达,转化表达菌株优化诱导条件表达蛋白检测放大培养,I I 蛋白诱导表达,1.表达菌株选择：（pET系统）常规表达菌株：BL21 表达毒性蛋白：BL21pLys适合表达真核基因：Rosseta（BL21衍生菌，补充大肠杆菌缺少的6种稀有密码子）2.诱导表达pET系统采用T7启动子，诱导剂：IPTG 诱导要素：IPTG浓度、诱导温度、诱导时间设置阴性对照：未加IPTG诱导3.SDS-PAGE、WB检测，确定目的蛋白 未诱导、诱导后的全菌、诱导后上清、诱导后沉淀,包涵体表达及增加蛋白可溶性,优化诱导条件，增加蛋白溶解性 在 E.coli中表达的重组蛋白经常以不溶的、无活性蛋白聚集体的形式表达，被称作包涵体。即使在形成包涵体时，还是有一部分目的蛋白是溶解的。由于pET 系统的高表达水平，即使有大量的目的蛋白聚集形成包涵体，也会有相当多的可溶性目的蛋白存在。在通常情况下，降低蛋白合成速率，如降低诱导培养温度及在基本培养基中生长都会使目的蛋白的可溶性增加。诱导和培养条件：37（包涵体），30，低温(15-20)诱导过夜，IPTG浓度，诱导后的培养条件细胞周质定位：选择带有信号肽的载体（pET12/20/22）宿主菌：尝试可表达真核蛋白的Rosseta菌株 裂解缓冲液：普通的Binding buffer中一些疏水或膜结构蛋白会是不溶的，但如果加入非离子去污剂就会变成可溶。,表达载体选择,标签选择：6XHis：-适合任何表达系统-纯化后不需切割标签-纯化简单，也可纯化包涵体蛋白-小标签对重组蛋白折叠影响小,GST：谷胱甘肽巯基转移酶-适合任何表达系统-相对可增加蛋白的可溶性-纯化后需切除标签-标签蛋白可能会形成二聚体,标签蛋白：优点-可以提高蛋白的可溶性和稳定性。-用亲和层析的方法对蛋白进行纯化，采用通用的检测标签的方法。,缺点-标签可能对蛋白的结构、折叠和生物学活性有影响。-切除标签时，酶切效率不会达到100%，会有氨基酸残余。,His标签：pET系列常规表达载体：pET28a、pET32a、pQE系列周质腔表达载体：CBD融合(pET36/37)、Dsb融合(pET39/40)采用带pelB/ompT引导肽的载体(pET12/20/22)采用带MBD融合(pMAL载体,Biolabs)、SUMO融合GST标签：pGEX系列,pET-28a,蛋白纯化,蛋白纯化 方法-亲和层析-凝胶过滤-离子交换层析亲和层析通过生物分子之间特异性的相互作用来分离物质的方法。配体受体 抗原抗体 底物酶,常用的亲和配基,蛋白纯化,主要步骤样品准备缓冲液准备-结合缓冲液-洗脱缓冲液组装层析柱纯化检测定量,CW0009,蛋白纯化产品,Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒,产品特点：4个镍离子结合位点，结合更牢固 载量高，使用方便 配置从抽提开始至纯化的全套试剂 适用于纯化可溶性蛋白及包涵体蛋白,明星纯化产品,2ml/￥398 5ml/￥598,6 ml 10 ml,样品处理：收集菌体后，每100 mg菌体（湿重）加入1-5 ml细菌裂解液，超声裂解菌体。离心，取上清。缓冲液配制：请使用高纯度的试剂配制缓冲液，并通过0.45 m过滤器过滤。为避免柱子被堵塞，建议将裂解液进行离心，或者使用0.45 m过滤器过滤。组装层析柱：将填料混匀后加入层析柱，室温静止10分钟，待凝胶与溶液分层后，让乙醇通过重力作用缓慢流出。向装填好的柱中加入5倍柱床体积的去离子水将乙醇冲洗干净后，再用8倍柱体积的Binding Buffer平衡柱子，平衡结束后即可上样。,His标签蛋白纯化,纯化介质：Ni-琼脂糖凝胶（CWBIO 填料具有4个Ni2+螯合位点）载 量：20-30mg His标签蛋白/ml填料（CWBIO）粒 径：50-160m（CWBIO）,纯化：将菌体裂解液负载上柱，流速为10倍柱体积/小时。使用15倍柱体积的Soluble Binding Buffer冲洗柱子，收集流穿峰。使用5倍柱体积的Soluble Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。洗脱后，依次使用3倍柱体积的Soluble Binding Buffer和5倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡（乙醇要将填料浸没），4保存。,检测分析：,凝胶填料,应用：纯化抗血清或腹水中的总IgG，尤其对人IgG1、IgG2、IgG4、小鼠IgG2a、IgG2b具有高亲和力。,应用：纯化抗血清或腹水中的总IgG,对人 IgG3,小鼠 IgG1,大鼠 IgG2a等具有高亲和力,应用：纯化带His标签蛋白。,应用：纯化带GST标签蛋白。,蛋白纯化常见问题,没有出现纯化蛋白纯化前将目的蛋白的表达量进行优化，确保表达量最大保证蛋白在纯化过程中不降解，纯化条件低温、纯化速度快标签蛋白没有暴露。应在变性条件下进行纯化没有洗脱下来洗脱条件太温和（提高咪唑浓度、降低PH值、加大洗脱体积确定最优条件）洗脱后杂带较多（电泳显示有多条带）蛋白酶降解标签蛋白（使用蛋白酶抑制剂）杂质与标签蛋白结合在一起（使用线性梯度浓度咪唑进行洗脱）洗涤不充分（重复上样进行洗涤）,谢谢！,
