《病毒的增殖》PPT课件.ppt

第三章 病毒的增殖,病毒的特点：,严格细胞内寄生物，只能在活细胞内繁殖,毒粒,宿主细胞,有繁殖性的病毒基因组,具有感染性的毒粒消失,病毒基因组复制、表达,病毒核酸和蛋白质,装配形成具有感染性的毒粒,释放至细胞外,原料能量生物合成场所,第三章 病毒的增殖,一、病毒的复制周期,（一）、一步生长曲线,（二）、病毒侵染寄主细胞的过程,二、病毒的异常复制（非增殖性感染）,病毒的增殖方式复制replication,病毒感染敏感宿主细胞后，病毒核酸进入细胞，通过其复制与表达产生子代病毒基因组和新的蛋白质，然后由这些新合成的病毒组分装配（assembly）成子代毒粒，并以一定方式释放到细胞外。,一、病毒的复制周期,复制周期（replicative circle）或称复制循环：,自病毒吸附于细胞开始，到子代病毒从感染细胞释放到细胞外的病毒复制过程。,第三章 病毒的增殖,用于病毒复制研究的实验系统,噬菌体细菌培养系统,动物病毒动物细胞培养系统,植物病毒动植物原生质体培养系统,易培养、易控制噬菌斑、易观察生长快，周期短,一、病毒的复制周期,（一）、一步生长曲线（one step growth curve）,1939年，Max Delbruck&Emory Ellis：,E.coli/bacteriopage,1、用噬菌体的稀释液感染高浓度的宿主细胞2、数分钟后，加入抗噬菌体的抗血清3、将上述混合物大量稀释4、保温培养并定期检测培养物中的噬菌体效价5、以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线,该实验标志着分子病毒学、分子生物学和分子遗传学的建立，Max Delbruck因此荣获1969年Nobel Prize,噬菌体的一步生长曲线,一、病毒的复制周期,（一）、一步生长曲线（one step growth curve）,噬菌体复制（繁殖）的三个阶段：1、吸附期游离的噬菌体吸附到宿主细胞2、潜伏期从噬菌体吸附到细胞到释放出新噬菌体的最短时期3、裂解期随着菌体不断破裂，新噬菌体数目增加，直到最高值,取培养物直接测定病毒数量,将培养物过滤去细胞后测定病毒数量,将细胞裂解后测定病毒的数量前期可将培养物先离心去上清以消除未吸附病毒的影响,裂解量：每个受染细胞所产生的子代病毒颗粒的平均数目。其值等于潜伏期受染细胞的数目除以稳定期受染细胞所释放的全部子代病毒数目，即等于稳定期病毒效价与潜伏期病毒效价之比。,（一）、一步生长曲线（one step growth curve）,隐蔽期（eclipse period）,在潜伏期的前一段，受染细胞内检测不到感染性病毒，后一阶段，感染性病毒在受染细胞内的数量急剧增加。自病毒在受染细胞内消失到细胞内出现新的感染性病毒的时间为隐蔽期。,隐蔽期病毒在细胞内存在的动力学曲线呈线性函数，而非指数关系，从而证明子代病毒颗粒是由新合成的病毒基因组与蛋白质经装配成熟，而不是通过双分裂方式产生的。,不同病毒的隐蔽期长短不同例如，DNA动物病毒的隐蔽期为520min，RNA动物病毒为210 h。,（一）、一步生长曲线（one step growth curve）,是研究病毒复制的一个经典试验，最初是为研究噬菌体的复制而建立，以后推广到动物病毒和植物病毒复制研究中。,以适量的病毒接种于标准培养的高浓度的敏感细胞，待病毒吸附后，离心除去未吸附的病毒，或以抗病毒抗血清处理病毒细胞培养物以建立同步感染，然后继续培养并定时取样测定培养物中的病毒效价，并以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线，即一步生长曲线。,不同病毒的潜伏期长短不同，噬菌体以min计，动物病毒和植物病毒以h或d 计。,潜伏期,噬菌体的裂解量一般为几十到上百个，植物病毒和动物病毒可达数百乃至上万个。,裂解量,吸附adsorption/attachment 侵入penetration/injection 脱壳uncoating 病毒大分子的合成 病毒基因组的复制与表达 装配 assembly 成熟 maturation 释放release,一、病毒的复制周期,（二）、病毒侵染寄主细胞的过程,1、吸附 adsorption/attachment,毒 粒,敏感细胞,随机碰撞而接触（静电引力或氢键）,可逆吸附，无特异性（非细胞颗粒也可吸附）,病毒表面蛋白与细胞受体的结合,特异性，不可逆吸附，启动病毒感染的第一阶段,（二）、病毒侵染寄主细胞的过程,1、吸附,VAP(virus-attachment protein)与细胞受体receptor间的结合力来源于空间结构的互补性，相互间的电荷、氢键、疏水性相互作用及范得华力。,不同种系的细胞具有不同病毒的细胞受体，病毒受体的细胞种系特异性决定了病毒的宿主范围。,1、吸附,分别吸附于大肠杆菌性毛和菌体上的噬菌体,1、吸附,动物宿主细胞及细菌表面病毒受体的存在可通过生化等实验证明；但至今仍未发现植物病毒的细胞受体存在。,1、吸附,病毒吸附蛋白VAP：一般由病毒的衣壳蛋白或包膜上的糖蛋白突起充当。如：T偶数噬菌体噬菌体尾部的尾丝蛋白x174噬菌体二十面体衣壳五邻体顶上的纤维突起H蛋白无包膜动物病毒如腺病毒二十面体衣壳上的五邻体纤维、多瘤病毒VPl（衣壳蛋白有VPl、VP2和VP3）有包膜动物病毒病毒包膜上的糖蛋白突起，如 副粘病毒HN糖蛋白、流感病毒血凝素(HA)糖蛋白，HIVgp120 糖蛋白、弹状病毒G 糖蛋白，疱疹病毒gpB糖蛋白,1、吸附,在流感病毒包膜上，有两种糖蛋白突起，血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)流感病毒的吸附只与HA有关，而与NA无关（病毒的感染性只能被抗血凝素的抗血清所中和不能被抗神经氨酸酶的抗血清中和）,流感病毒包膜上血凝素(HA)三聚体结构（三亚基）,1、吸附,流感病毒包膜上血凝素(HA)分4个区,1.细胞受体结合区：流感病毒的VAP与宿主细胞表面糖蛋白受体的唾液酸结合，这是HA的主要功能其受体结合位点位于三聚体的顶端，形似一个裂缝或小口袋。它是病毒包膜糖蛋白HA与细胞受体相互作用的分子基础。2.融合区：HA蛋白具有促膜融合的活性，但HA只有经蛋白酶切割产生HA1和HA2后才具有融合活性。3.跨膜区：在靠近HA分子的羧基端大约有25个AA残基组成非极性区即HA的跨膜区4.膜内区：HA分子羧基端最后10个AA在病毒包膜内表面。,1、吸附,影响病毒吸附的环境因素：,噬菌体数量：每一敏感细胞所能吸附相应噬菌体的数量温度:一般来说在037范围内温度越高、病毒吸附效率也越高温度越高，VAP与细胞受体间的碰撞次数愈多，吸附机会越大温度越高细胞膜中脂质分子的运动越快，其中蛋白质分子的迁移也更加频繁，受体分子更容易与病毒粒子产生多价结合离子：只有在一定的阳离子环境条件下，病毒粒子才能吸附细胞，如Na+、K+可使脊髓灰质炎病毒、腺病毒、流感病毒产生最大量的吸附，2价阳离子Ca2+、Mg2+则能促进噬菌体吸附pH：pH的高低能够引起病毒粒子和细胞表面基团电荷的改变（510）其他：某些糖基分子可与细胞受体相互作用，对病毒产生竞争性结合抑制如单糖分子可以抑制人肠道病毒的血凝作用,2、侵入penetration/injection,侵入(内化)，一个病毒吸附后几乎立即发生，依赖于能量的感染步骤。不同的病毒-宿主系统的病毒侵入机制不同 注射式injection 有尾噬菌体 细胞内吞endocytosis 动物病毒 膜融合fusion 有包膜的病毒 直接侵入 部分动物病毒、无包膜病毒、植物病毒,2、侵入penetration/injection,(1)部分病毒粒子可直接侵入 如脊髓灰质炎病毒、腺病毒。(2)许多无包膜病毒通过VAP与细胞受体结合后，其宿主细胞膜的流动性引起病毒衣壳蛋白重排和构型变化，细胞膜上可能有水解酶，导致病毒粒子释放核酸进入细胞质，病毒衣壳仍留在细胞膜外。实际上将病毒侵入和脱壳融为一体。(3)其他特殊方式：尚未发现植物病毒有特异性细胞受体，通过微伤口或自然孔口、细胞间的胞间连丝，或昆虫的口器侵入细胞。许多病毒并非仅有一种侵入方式，可能几种侵入方式并存,直接侵入,2、侵入,有尾噬菌体,注射方式将噬菌体核酸注入细胞,通过尾部刺突固着于细胞；尾部的酶水解细胞壁的肽聚糖，使细胞壁产生小孔；尾鞘收缩，核酸通过中空的尾管压入胞内，蛋白质外壳留在胞外；,吸附,尾钉固着,尾鞘收缩,尾管穿入,DNA注入,如果大量噬菌体在短时间内吸附于同一细胞上，使细胞壁产生许多小孔，也可引起细胞立即裂解，但噬菌体并未增殖，这种现象称为自外裂解（lysis from without）。,2、侵入,动物病毒,直接穿过细胞膜的移位方式,细胞的内吞功能,毒粒包膜与细胞质 膜的融合,2、侵入,植物病毒,通过人为或自然的机械损伤所形成的微伤口进入细胞；或者靠携带有病毒的媒介，主要靠是有吮吸式口器的昆虫取食将病毒带入细胞。,植物病毒一旦进入细胞后，增殖产生的子代病毒或病毒核酸可通过病毒编码的运动蛋白（movement protein）与胞间连丝的相互作用从受染细胞进入邻近细胞。,3、脱壳 uncoating,病毒侵入后，病毒的包膜和/或壳体除去而释放出病毒核酸的过程。脱壳是病毒基因组进行功能表达所必需的感染事件。,T-偶数噬菌体脱壳与侵入是一起发生的,动物病毒存在不同的结构类型和不同的侵入方式，其脱壳过程也较复杂。,病毒的毒粒消失，失去原有的感染性，进入潜隐期。,3、脱壳 uncoating,遗传的中心法则,转录 翻译复制 DNA mRNA Protein 逆转录（半保留不连续复制）,4、病毒大分子的合成(replication）,全保留复制模式：多数dsRNA病毒,4、病毒大分子的合成,病毒基因组的复制与表达存在着强烈的时序性,病毒基因组进入胞内,宿主细胞的代谢发生改变,病毒利用宿主的生物合成机构和场所，使病毒核酸表达和复制，产生大量的病毒蛋白质和核酸。,早期蛋白：中期mRNA聚合酶、更改蛋白质等,中期蛋白：DNA聚合酶、晚期mRNA聚合酶等,晚期蛋白：头部蛋白、尾部蛋白、装配蛋白、溶菌酶等,dsDNADNA肝炎病毒具有RNA中间体,+mRNA,+DNA细小病毒科,+RNA逆转录病毒,dsDNA 腺病毒、疱疹病毒,+RNA冠状病毒科,蛋白质,dsRNA呼肠孤病毒科,-RNA正粘病毒科,病毒的基因组类型及复制表达途径,dsDNA,dsDNA,-ssDNA,+RNA,dsDNA,发生在成熟过程中的病毒粒子内,Transcription of virus genomes,逆病毒复制：,mRNA,潜伏,杂种双链,逆病毒复制过程1：,、进入细胞；、反转录 在反转录酶的作用下以病毒RNA为模板合成DNA，然后再形成线形dsDNA;、整 合 DNA拷贝整合到宿主基因组中；、转 录 病毒DNA转录形成病毒mRNA和子代病毒RNA;、壳体化 在细胞质中产生核衣壳；、出 芽 粒子在细胞质膜处以出芽方式放出.,HIV replication 3,HIV2,主要是一种DNA聚合酶，表现出三种酶活性：以RNA为模板合成DNA(反转录)；以DNA为模板合成DNA;RNA酶H活性(降解RNA:DNA杂交链中的RNA链)反转录酶在进行DNA合成时需要的引物是特异的细胞内tRNA用作引物的tRNA的类型依病毒种类而不同，是从以前的宿主细胞带入病毒粒子的。如：Rous sarcoma(肉瘤)virus使用色氨酸tRNA。,逆转录酶 reverse transcriptase,从逆转录v形成dsDNA的步骤1,从逆转录v形成dsDNA的步骤2,逆转录病毒的复制,+RNA,DNA肿瘤病毒引起细胞转化的模式图,dsDNA如SV40,病毒的全部或部分DNA整合到宿主细胞DNA中；编码转化信息的病毒基因被转录并被剪切为病毒mRNA分子，然后转运到胞浆被翻译成转化蛋白或T抗原。T抗原能使得宿主细胞转变为癌细胞,-RNA病毒增殖,如：弹状病毒,单纯疱疹病毒复制,dsDNA,5、病毒的装配、成熟与释放,装配(assembly)：亦称形态发生(morphogenesis)新合成的毒粒结构组分组装成完整的病毒颗粒,释放release成熟的子代病毒颗粒然后依一定途径释放到细胞外,病毒的释放标志病毒复制周期结束,成熟（maturation）涉及病毒粒子的结构变化（蛋白构型），抗原差异,T4噬菌体的装配是一个极为复杂的自我装配的过程,大多数噬菌体都是以裂解细胞方式释放,丝杆噬菌体（如M13或fd）不杀死细胞，子代毒粒以分泌方式不断从受染细胞中释放，并同时完成毒粒的组装。,5、病毒的装配、成熟与释放,有包膜病毒的装配与释放有时也是同时完成的,有包膜的动物病毒是在从宿主细胞核芽出或细胞质膜芽出的过程中裹上包膜而形成包膜病毒,TMV的装配：RNA穿过螺旋的中心孔并在生长端形成一个可移动的环。,吸附,侵入,早期：病毒特异性酶的合成,病毒核酸复制,病毒结构蛋白质合成,装配,释放,病毒大分子合成,脱壳,成熟,裸病毒生活周期,二 病毒的非增殖性感染,增殖性感染（productive infection）,感染发生在病毒能在其内完成复制循环的允许细胞内，并以有感染性病毒子代产生为特征。,非增殖性感染（non productive infection）,感染由于病毒、或是细胞的原因，致使病毒的复制在病毒进入敏感细胞后的某一阶段受阻，结果导致病毒感染的不完全循环。在此过程中，由于病毒与细胞的相互作用，虽然亦可能导致细胞发生某些变化，甚至产生细胞病变，但在受染细胞内，不产生有感染性的病毒子代。,1、流产感染（abortive infection）依赖于细胞的流产感染：如病毒感染的细胞是病毒不能复制的非允许细胞(nonpermissive cell)，将导致流产感染依赖于病毒的流产感染:由基因组不完整的缺损病毒(defective virus)引起。这类病毒因一个或多个病毒复制必需基因有缺损，丧失了其功能，所以它们无论是感染允许细胞还是非允许细胞，都不能完成复制循环。,病毒的非增殖性感染,2、限制性感染（restrictive infection）因细胞的瞬时允许性产生，导致:(1)病毒持续存在于受染细胞内不能复制，直到细胞成为 允许性细胞，病毒才能繁殖；(2)一个细胞群体中仅有少数细胞产生病毒子代。3、潜伏感染（latent infection）在受染细胞内有病毒基因组持续存在，但并无感染性病毒颗粒产生，受染细胞也不会被破坏。潜伏感染的另一个极端情况是由于病毒基因的功能表达导致宿主基因表达的改变恶性细胞。,温和噬菌体的溶源性反应,烈性噬菌体（virulent phage）,感染宿主细胞后能在细胞内正常复制并最终杀死细胞，形成裂解循环（lytic cycle）。,温和噬菌体或称溶源性噬菌体（lysogenic phage）,感染宿主细胞后不能完成复制循环，噬菌体基因组长期存在于宿主细胞内，没有成熟噬菌体产生。,这一现象称做溶源性（lysogeny）现象,在大多数情况下，温和噬菌体的基因组都整合于宿主染色体中（如噬菌体），亦有少数是以质粒形成存在(如P1噬菌体)。,温和噬菌体的溶源性反应,整合于细菌染色体或以质粒形成存在的温和噬菌体基因组称做原噬菌体（prophage）,在原噬菌体阶段，噬菌体的复制被抑制，宿主细胞正常地生长繁殖，而噬菌体基因组与宿主细菌染色体同步复制，并随细胞分裂而传递给子代细胞。,细胞中含有以原噬菌体状态存在的温和噬菌体基因组的细菌称溶源性细菌（lysogenic bacteria）,溶源性细菌经自发裂解或诱发裂解，进入裂解循环,溶源性感染对细胞的影响,被温和噬菌体感染后形成的溶源性细菌具有“免疫性”，即其它同类噬菌体虽然可以再次感染该细胞，但不能增殖，也不能导致溶源性细菌裂解。免疫性是由原噬菌体产生的阻遏蛋白的可扩散性质所决定的。,溶源性细菌有时还能获得一些新的生理特性，例如白喉杆菌只有在含有特定类型的原噬菌体时才能产生白喉毒素，引起被感染机体发病。原噬菌体引起的溶源性细菌除免疫性外的其他表形改变，包括溶源菌细胞表面性质的改变和致病性转变被称为溶源转变(lysogenic conversion)。,溶源菌中的温和噬菌体基因组通常不影响细胞的繁殖功能，但它们可能引起其他的细胞变化。,(1)免疫性,(2)溶源转变,噬菌体的的溶源性反应,进入宿主后线状基因组依靠粘性末端环化,噬菌体的基因组,dsDNA，总长度为48502bp。DNA分子的两端、各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的5单链突出序列，即粘性末端。控制噬菌体复制转录的基因：头部基因编码头部与包装蛋白的基因(A-F)尾部基因编码尾部蛋白(z-J)重组基因int,xis,exo,red,gam等基因与识别位att，其功能是行使整合、重组和切割正调控基因N和Q，N为抗转录终止基因，Q为抗终止子基因，Q蛋白为晚期正调控因子负调控基因CI、CII、CIII和croDNA合成基因O、P基因裂解基因S、R基因,噬菌体的的溶源性反应,基因组的表达与复制存在着强烈的时序性,噬菌体的基因组,噬菌体的基因组：（4个基因簇）调节区(regulation)重组有关的区域(recombination)复制区(replication)结构基因区(包括头、尾、装配和裂解有关的基因),基因组有三个调节基因N、Cro和QN蛋白抗终止子t1，tR1和tR2Q蛋白抗终止子tR4cro蛋白对CI和Cro基因的转录起负调控作用,噬菌体的的溶源性反应,溶源化有关的有三个基因CI、C和CC蛋白使C蛋白稳定；C/C蛋白能使CI基因启始转录；CI蛋白是阻遏物，能使与复制成熟和裂解等有关的基因都不转录，使噬菌体处于溶源状态。,噬菌体的溶源途径CI蛋白的调控作用：CI蛋白也称为阻遏蛋白，是一种酸性蛋白，PR操纵子最终被CI阻遏物所抑制，导致 C蛋白的合成停止，在处于原噬菌体状态时其CI蛋白的合成一直维持低速率状态。,噬菌体的溶菌途径：,噬菌体究竟是进入溶原途径，还是溶菌途径，主要受cro和CI蛋白表达水平的调控，而CI蛋白的合成又同C的活性有关。,cro蛋白作为一种阻遏蛋白、抑制溶原状态的建立当环境因素及宿主的遗传背景或目前尚不清楚的因素使C蛋白比Cro蛋白相对浓度低时，Cro蛋白阻止CI转录，不产生阻遏物，使的其他基因可以转录，当产生的Q蛋白的量达到使PR2转录完成时、进行裂解循环途径。,噬菌体的的溶源性反应,早期基因表达，产生gpcII，gpcro及gpcIII，后者可防止宿主的裂解酶对gpcII的降解。,gpcII的积累促使阻遏蛋白CI的表达,阻遏蛋白CI的积累导致噬菌体基因转录的终止，形成原噬菌体。,早期表达的gpcro与cI的竞争最终确定噬菌体是进入溶源状态，还是进入裂解循环。（gpcro表达得早，但与基因组的结合能力较cI弱）,阻遏蛋白cI的同样可以抑制其它新侵入的噬菌体的表达，从而使溶源性细菌具有“免疫性”,阻遏蛋白CI在一般情况下通过自身的转录激活保持低水平的表达，但有时种种原因转录水平下降，会偶尔导致溶源性噬菌体进入裂解循环（10-510-2）。,噬菌体的溶源性反应,通过特定位点整合/切离细菌染色体,噬菌体的的溶源性反应,外界因素如紫外线可引起宿主染色体的破坏，宿主产生应急反应合成具有DNA重组活性的RecA蛋白，导致CI的被降解，噬菌体进入裂解循环,诱发裂解是检查是否存在 溶原性细菌的有效方法溶源菌菌落,溶源菌及其特殊噬菌斑的形态(少量的溶源菌与大量敏感菌混合),本章要点,病毒的一步生长曲线及其作用；病毒增殖的一般过程，不同种类病毒增殖过程特点；病毒的基因组类型及复制表达途径；病毒的非增殖性感染类型、特点及有关概念。,