《生物化学核酸化学》PPT课件.ppt

第一节 核酸的概念、分类和功能,第二节 核酸的组成和分子结构,第三节 DNA的结构,第五节 核酸的性质及分离、分析,第六节 核酸的应用,第四节 RNA的结构,第五章 核酸化学,第一节 核酸的概念、分类和功能,一、染色体和基因,二、核酸概念和分类,在生物细胞核中存在着一种能被碱性染料着色的螺旋集缩体。这是由核酸、组蛋白、非组蛋白等组成，称此物质为染色体。,一、染色体和基因,染色体的形成：DNA+组蛋白=核小体；核小体绕成螺线管状(染色质丝)；染色质丝+非组蛋白=染色体；,一、染色体和基因,核酸：DNA-脱氧核糖核苷酸 RNA-核糖核苷酸,一、染色体和基因,核糖核酸（ribonucleic acid-RNA）转移RNA(transfer RNA-tRNA)信使RNA(messenger RNA-mRNA)核糖体RNA（ribosomal RNA-rRNA）脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid-DNA）,二、核酸的概念和分类,二、核酸的概念和分类,DNA功能：遗传信息的载体，负责遗传信息的贮存和发布。RNA功能：参与遗传信息的表达。,二、核酸的概念和分类,核酸,核苷酸,水解,核蛋白,蛋白质,第二节 核酸的组成和分子结构,组成元素（C,H,O,N,P）,核苷,核酸,核苷酸,碱基,许多个,戊糖,磷酸,第二节 核酸的组成和分子结构,一、戊糖,三、核苷,二、碱基,四、核苷酸,第二节 核酸的组成和分子结构,五、核酸,组成核酸的戊糖有两种,组成DNA,组成RNA,一、戊糖,二、碱基,1.嘧啶碱基2.嘌呤碱基,核酸中的碱基分两类：,（1）嘧啶碱：胞嘧啶（C）尿嘧啶（U）胸腺嘧啶（T）（2）嘌呤碱：腺嘌呤（A）鸟嘌呤（G）,二、碱基,尿嘧啶 U,胸腺嘧啶 T,胞嘧啶 C,DNA特有,RNA特有,1.嘧啶碱基,鸟嘌呤 G,腺嘌呤 A,2.嘌呤碱基,三、核苷,1.核苷的结构2.核苷的书写,核苷是一种糖苷，由戌糖和碱基缩合而成。糖与碱基之间以糖苷键相连接。糖的第一位上的碳原子（C1）与嘧啶碱的第一位上的氮原子（N1）或嘌呤碱的第九位上的氮原子（N9）相连，所以糖与碱基间的连键是N-C键，一般称之为N-糖苷键。蛋白质与糖连接时，天冬酰氨的氨基与半缩醛羟基间形成的为N-糖苷键。,1.核苷的结构,糖与碱基之间以C-N糖苷键连接,1,1,1,9,1.核苷的结构,2.核苷的书写,核苷可用单字符号A（腺嘌呤核苷，简称腺苷）、G（鸟苷）、C（胞苷）、U（尿苷）表示。脱氧核苷则在单字符号前面加一个小写的d，如dA（腺嘌呤脱氧核糖核苷，简称脱氧腺苷）、dG（脱氧鸟苷）、dC（脱氧胞苷）、dT（脱氧胸苷）。,1核苷酸的种类2核苷酸的结构与命名3多磷酸核苷及其衍生物4环核苷酸5核苷酸的性质,四、核苷酸,核苷中的戌糖羟基被磷酸酯化，就形成核苷酸作为DNA或RNA结构单元的核苷酸分别是5-磷酸-脱氧核糖核苷和5-磷酸-核糖核苷。,1核苷酸的种类,M-单(D-二；T三）；P-磷酸RNA的名称为某（单、二、三）磷酸核苷酸，DNA在某（单、二、三）前加脱氧两字。如AMP称腺苷磷酸(或腺苷酸），dAMP称为脱氧腺苷磷酸（脱氧腺苷酸）。,八种核苷酸的表示,2核苷酸的结构与命名,参与核酸生物合成的直接原料不是一磷酸核苷酸，而是三磷酸核苷酸，如ATP（三磷酸腺苷酸）。ATP上的磷酸残基用、来编号。,ATP含有两个高能磷酸酯键（P），其水解时释放出的能量为7.3千卡/克分子（普通磷酸酯键为2千卡/克分子）。ATP在细胞能量代谢中起着及其重要的作用。,3多磷酸核苷及其衍生物,3多磷酸核苷及其衍生物,4核苷酸的性质,碱基可以发生酮式和烯醇式的互变异构，体内以酮式为主。核苷酸在240290 nm具有强烈的光吸收，最大吸收波长在260 nm左右。核苷酸是两性电解质，在不同的pH条件下，其解离程度不同，在某一pH值时，对外不表现出电性，该pH值称为其等电点。,一般物理性质：,一、DNA的一级结构,三、DNA的三级结构,二、DNA的二级结构,四、核酸序列的研究方法,第三节 DNA的结构,五、DNA基因组,一、DNA的一级结构,双链线性分子:真核细胞核内的DNA、有些动物病毒。环状双链DNA:原核生物染色体DNA、质粒DNA、真核生物细胞器DNA、有些动物病毒。,各核苷酸残基沿多核苷酸链排列的顺序叫核酸的一级结构。连接键：3，5一磷酸二酯键连接起来的直线形或环形分子。DNA没有侧链。,一、DNA的一级结构,DNA字母简写:,5 A P G P C P T P G P C P 3 或 5 A G C T G C 3,一、DNA的一级结构,公认的为1953年watson和crick提出的DNA双螺旋结构模型。,二、DNA的二级结构,二、DNA的二级结构,1B-DNA双螺旋结构模型的要点2双螺旋结构的稳定性3DNA双螺旋的不同类型,（1）两条多核苷酸链组成；反向平行（p5-糖3-p的结构与p3-糖5-p的结构相对）两条链的糖磷酸主链都是右手螺旋，有一共同螺旋轴,1B-DNA双螺旋结构模型的要点,（2）两条链上的碱基互补配对：A-T，C-G或T-A，G-C；A与T之间为二个氢键，C与G之间为三个氢键。,1B-DNA双螺旋结构模型的要点,1B-DNA双螺旋结构模型的要点,双螺旋的螺距为3.4 nm，螺旋的直径为2 nm，相邻碱基对平面间的距离是0.34 nm。双螺旋的每一转有10对核苷酸，相邻核苷酸之间的夹角为36。,（3）,螺旋表面有一条大沟和一条小沟,大沟,小沟,1B-DNA双螺旋结构模型的要点,（4）,1B-DNA双螺旋结构模型的要点,（5）碱基平面与双螺旋的中心轴垂直，糖环平面与中心轴平行。,1B-DNA双螺旋结构模型的要点,（6）双螺旋结构横向靠氢键稳定，纵向靠碱基堆积力维系稳定。,1B-DNA双螺旋结构模型的要点,（7）,一个链的碱基顺序确定后，则另一条链必有相对应的碱基顺序。碱基互补原则具有极重要意义，DNA复制、转录、反转录等过程的分子基础都是碱基互补配对。,ATGAACAGCT TCAATAAGGA CGAGTTTGACTACTTGTCGA AGTTATTCCT GCTCAAACTG,（1）氢键；（2）离子键及范德华力；（3）碱基堆积力；,2双螺旋结构的稳定性,（1）氢键：两条链间碱基的相互作用，A与T之间为二条氢键，C与G之间为三条氢键。氢键作用力很弱，但DNA分子中存在大量氢键，因此氢键为一重要稳定因素；,2双螺旋结构的稳定性,（2）离子键及范德华力：DNA分子中磷酸基因在生理条件下解离，使DNA成为一种多阴离子，这有利于它与带正电荷的其它阳离子基团发生静电作用，这样减少双链间的静电排斥，有利于双螺旋的稳定；（3）碱基堆积力：目前普遍认为堆积碱基间的疏水作用是稳定DNA结构的更重要的因素。大量碱基层层堆积，两相邻碱基的平面十分贴近，于是使双螺旋结构内部形成一个强大的疏水区，与介质中的小分子隔开，有利于互补碱基之间氢键的形成；,2双螺旋结构的稳定性,3DNA双螺旋的不同类型,B型DNA（BDNA）:在相对湿度为92%时，所得到的DNA钠盐纤维；A型DNA（ADNA）:在相对湿度低于75%时，获得的DNA钠盐纤维；此外还有ZDNA等；,3DNA双螺旋的不同类型,三、基因组,基因组是指生物体的单倍体细胞核、细胞器或病毒粒子所含的全部DNA分子或RNA分子的总和。为了揭示生命奥秘，必须要测定生物体的基因组序列-基因组计划。目前已经完成了病毒、大肠杆菌、酵母、果蝇、玉米、水稻和人类基因组的测序，得出人类基因组的大小为3109 bp，用于编码蛋白质的基因序列约为31 000个，只占基因组的1.1%1.4%。,一、RNA的一级结构,二、RNA的高级结构,第四节 RNA的结构,1.一级结构的定义2.一级结构的特点,一、RNA的一级结构,1.一级结构的定义,RNA的一级结构指的是多核苷酸链中核糖核苷酸的排列顺序，即多核苷酸链中碱基的排列顺序。RNA也是无分支的线形结构。,含腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶四种碱基，尚含有多种“稀有碱基”和特殊形式的核苷。其中以各种甲基化的碱基和“假尿嘧啶核苷”尤为丰富。,假尿苷,这些不寻常的成分可能与tRNA的生物学功能有一定的关系。,1.一级结构的定义,含量:占总RNA的5%。存在：在细胞核中以DNA为模板被合成以后，可能暂存于核仁内，也可能立即转移到胞质中，并以每分子mRNA与几个或几十个核蛋白体结合成串珠样的多核蛋白体形式而存在。特点：一般都很不稳定，代谢活跃，更新迅速，寿命较短，种类很多。功能:在蛋白质生物合成中起传递遗传信息的作用，故也叫信息RNA（iRNA）。,2.一级结构的特点（mRNA）,顺反子：mRNA上具有翻译功能的核苷酸顺序。单顺反子：只编码一个蛋白质的mRNA。polyA片段：指10200个多聚腺苷酸，这与mRNA顺利通过核膜进入胞浆有关，也与mRNA从细胞核转移到核糖体的过程有关，也有人认为与病毒侵染性有关。“帽子”结构：5-末端的G被甲基化，通过焦磷酸与另一个发生了核糖上甲基化的核苷酸以5、5-磷酸二酯键相连,此结构对mRNA的翻译活性是重要的。,2.一级结构的特点（mRNA）,2.一级结构的特点（mRNA）,含量：占细胞总RNA的75-80%。存在：与蛋白质结合成核蛋白的形式，存在于细胞质的核蛋白体中。功能：以核蛋白体的形式在蛋白质生物合成中提供合适的工作场所。分子量:它的分子量都比较大，大肠杆菌核糖体中有三类rRNA（它们的沉降系数分别为5S、16S、23S）；动物细胞核糖体rRNA有四类（5S、5.8S、18S和28S）。,2.一级结构的特点（rRNA）,大肠杆菌5SRNA的结构,2.一级结构的特点（rRNA）,原核生物：是由30S和50S两个亚基组成的70S的rRNA和蛋白质聚合体，其中rRNA含66。真核生物：是由60S和40S两个亚基组成的80S的rRNA和蛋白质聚合体，其中rRNA含60。,2.一级结构的特点（rRNA）,含量：约占细胞总RNA的1015%。存在：tRNA溶于“胞液”部分中，它们以自由状态或以氨基酸结合状态而存在。分子量：由6095个核苷酸残基组成，都较小功能：蛋白质的生物合成中起选择性运输原料（氨基酸）的作用，因此把tRNA叫受体RNA。每种氨基酸都有对应的一种或几种tRNA。,2.一级结构的特点（tRNA）,tRNA的三叶草型结构特点（总）,反密码环,二、RNA的高级结构,氨基酸接受区（氨基酸臂）二氢尿嘧啶区反密码区TC区额外环（可变区）,氨基酸臂,二氢尿嘧啶区,额外环,TC区,tRNA分子中含有修饰碱基，但多少不等。在某些位置上的核苷酸对于所有的tRNA都是同样的，或变化很少叫做不变核苷酸。,稀有碱基,二、RNA的高级结构,第五节 核酸的性质及分离、分析,一、核酸的理化性质二、核酸的分离三、核酸的分析四、核酸测序的研究方法,1相对分子质量2粘度与沉降特性3紫外吸收4变性与复性5熔解温度6克原子磷消光系数,一、核酸的理化性质,纯品DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末。DNA、RNA及核苷酸为极性化合物，溶于水，不溶于有机溶剂。DNA能被乙醇和异戊醇沉淀。,核酸的物理特性,核酸的两性解离,DNA和RNA都为两性电解质，具有等电点。核酸在pH4时，带负电荷等电点（pI）：,DNA的相对分子质量较大，一般为106109 bp，大多数DNA为线性分子，分子极不对称，虽然其长度可达厘米级但分子的直径只有纳米级。RNA的相对分子质量较小，通常为104106 bp。,1相对分子质量,DNA能被乙醇和异戊醇沉淀。DNA分子的粘度比RNA分子的粘度要大得多。不同相对分子质量的核酸沉降速度不同。一般情况下，超螺旋DNA 环状DNA 线形DNA。,2粘度与沉降特性,嘌呤碱与嘧啶碱有共轭双键，使碱基核苷、核苷酸和核酸在240290nm紫外波段有一强烈的吸收峰，最大吸收值在260nm附近。,3紫外吸收,4变性与复性（变性）,定义：指核酸双螺旋区氢键断裂，变成单链，它并不涉及共价键（磷酸二酯键）的断裂。变性因素：热变性、酸碱变性和化学变性等。,定义：变性DNA在适当条件下，又可使两条彼此分开的链重新缔合成双螺旋结构。,高温变性,缓慢冷却,热复性,退火,4变性与复性（复性）,DNA复性后，许多物化性质又得到恢复，生物活性可以得到部分恢复。但将热变性的DNA骤然冷却，不能复性，只有缓慢冷却时才可以复性。,高温变性,缓慢冷却,热复性,急速冷却,复性失败,4变性与复性（复性）,4变性与复性（复性）,影响核酸复性速度的因素很多：核酸浓度越高，随机碰撞的频率越高，复性速度越快。核酸分子越大，链间错配频率越高，复性速度越慢。核酸链内重复序列多，易形成互补配对，复性速度较快。维持一定的溶液离子强度，消弱磷酸基静电斥力，可加快复性速度。选择最佳的复性温度，温度太高会使核酸发生变性，而温度过低会使错配的两链无法分开。,通常把DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称该DNA的溶点或溶解温度，用Tm表示，DNA的Tm值一般在70850C之间。,变性的相对量,温度0C,60,80,100,1.0,1.2,1.4,1.6,0,Tm,Tm,Tm,100%,Poly d(A-T),Poly d(G-C),DNA,5熔解温度,Tm值的大小与下列因素有关：（1）DNA的均一性（2）G-C含量（3）介质中的离子强度,5熔解温度,（1）DNA的均一性：一般均一性越高，Tm值的变动范围越小。（2）G-C含量：G-C含量越高，Tm值越大，Tm与G-C含量成正比关系。因为G-C比A-T更稳定（氢键）。Tm与所含G-C的多少的关系，可用经验公式计算不同DNA的Tm：（GC）(Tm69.3)2.44,5熔解温度,（3）介质中的离子强度：一般离子强度较低，DNA的Tm值也较低，范围也越窄。,温度0C,70,80,100,1.2,1.4,1.5,90,1.1,1.3,A 260,0.01,0.02,0.05,0.2,0.1,0.5,1.0,大肠杆菌DNA在不同KCl浓度下的Tm,5熔解温度,6摩尔磷吸光系数,核酸分子中磷原子的含量基本稳定。根据磷的含量测定核酸溶液的吸光度，以每升核酸溶液中一摩尔磷为标准来计算核酸的吸光系数，就叫做摩尔磷吸光系数，用（P）表示。,二、核酸的分离,核酸的分离原则：尽量简化操作，缩短提取过程；减少化学物质对核酸的降解；减少核酸的生物降解；减少物理因素对核酸的降解。,二、核酸的分离,核酸的分离方法：细胞裂解；酶处理；核酸的分离提纯：盐提取法酚提取法层析法。,三、核酸的分析,纯DNA的OD260/2801.8。纯RNA OD260/2802.0，如果样品中含有杂蛋白，比值会明显下降。如果OD260/2301.8时样品是纯的，否则样品中含有杂多糖。通常1.0 OD相当于50g/mL的双螺旋DNA或 40 g/mL单链DNA（或RNA）。,紫外法,1977年两位学者分别提出了化学断裂法和双脱氧链终止法。这两种方法的基本原理相同，都是用不同的专一性手段使被分析的DNA分子断裂成若干带放射性标记的、长短不一的片段，然后用测DNA片段的相对长度来测核苷酸的顺序。,四、核酸测序的研究方法,Sanger双脱氧链终止法,四、核酸测序的研究方法,Gilbert化学断裂法,四、核酸测序的研究方法,DNA片段一端用放射性标记，用碱基特异性的化学反应裂解DNA，通过标定末端与断裂位点之间的距离来确定碱基的位置。,四、核酸测序的研究方法,最新的测序方法：焦磷酸测序技术：Roche公司的GS FLX系统（454系统）；桥扩增测序技术：Illumina公司的Genome Analyzer系统（Solexa系统）；连接测序技术：ABI公司的SOLiD系统；,第六节 核酸的应用研究,一、人类基因组计划二、分子杂交三、小RNA和微小RNA四、反义RNA,一、人类基因组计划,1990年，美国国会批准美国的“人类基因组计划”于10月1日正式启动。美国的人类基因组计划总体规划是：拟在15年内至少投入30亿美元，进行对人类全基因组的分析。,一、人类基因组计划,2003年4月l4日，美、英、日、德、法、中六国首脑发表了“人类基因组联合宣言”，宣告“人类基因组计划”提前完成。,一、人类基因组计划,美国：WASHMIT等研究中心，贡献率为54；英国：SANGER等研究中心，贡献率为33；日本：RIKEN等研究中心，贡献率为7；法国：GENOSCOPE研究中心，贡献率为2.8；德国：IMB等研究中心，贡献率为2.2；中国：华大基因等，贡献率为1；,一、人类基因组计划,2002,12,18日，水稻基因组由中国领衔完成。,一、人类基因组计划,2007年10月11日，我国科学家成功绘制出第一个完整中国人基因组图谱（炎黄一号），这也是第一个亚洲人全基因序列图谱。,2008年10月11日，我国科学家成功绘制出大熊猫晶晶的基因组序列。,玉米、水稻、猪、家蚕等生物的DNA全序列也被陆续测定，目前科学家的研究中心开始转移到对基因组的功能研究上，产生了基因组学这一新的学科。,一、人类基因组计划,破译基因组的全部遗传信;利用基因组学信息和生物技术改善全人类的健康;蛋白质组学和结构基因组学：阐释基因组中全部基因及其编码蛋白质的功能以及结构与功能的关系。,后基因组时代（Postgenome era）,概念：两种来源不同，具有互补碱基序列的多核苷酸片段在溶液中冷却时，可以再形成双螺旋结构，称为杂交作用。DNA和DNA杂交以及DNA和RNA杂交在核酸技术中占有十分重要的地位。,二、分子杂交,种类：13Southern印迹法（Southern bloting：DNA-DNA）。Northern印迹法（Northern bloting：DNA-RNA）。Western印迹法（Western bloting：抗原-抗体）。,小RNA：1998年发现一些小RNA具有调控DNA分子的功能，这种机制叫做RNA干扰（RNAi）。微小RNA：1925nt组成的，具有负调控功能的RNA分子。小RNA和微小RNA技术主要应用于癌症的预防、诊断和治疗方面。,三、小RNA和微小RNA,反义RNA是指与目标核酸(如mRNA或DNA)互补的RNA分子，能抑制目标核酸的翻译的RNA分子。反义RNA技术目前在植物基因工程和人类疾病治疗方面具有广泛的应用。,四、反义RNA,Thank You!,