实验三 琼脂免疫电泳实验.ppt

实验三 琼脂免疫电泳实验,实验目的,了解免疫电泳的原理和用途。掌握免疫电泳的操作过程和方法。掌握免疫电泳实验结果的分析方法，并对粗提的蛋白进行检测。,免疫电泳为区带电泳与双向免疫扩散的结合。先利用区带电泳技术将不同电荷和分子量的蛋白抗原在琼脂内分离，然后在与电泳方向平行的方向上开槽，加入抗血清。37下使两者扩散，各区带蛋白在相应的位置与抗体反应形成弧形沉淀线。免疫电泳原理图解见图。,实验原理,免疫电泳原理图解,实验材料：牛血清粗提蛋白琼脂糖巴比妥缓冲液（PH8.6，离子强度0.05）兔抗牛血清,（1）配制1.2的琼脂，加热使之融化。（巴比妥缓冲液配制）（2）吸取34 mL琼脂溶液，均匀涂布到载玻片上，注意要马上用吸管尖把琼脂表面整平，若有气泡立刻除去，并立即于中间横放一根毛细管，待凝，制成2mm的琼脂板。（3）取打孔器在图示的位置打孔（图），此二孔位置要对称。于酒精灯上小心烘烤，使琼脂与玻璃板贴紧。,操作步骤,图2 胶板打孔及挖槽示意图,（4）用微量加样器加入1020uL的粗提蛋白和牛血清，不要溢出（可加入指示剂）。（5）把载玻片放到电泳槽中，倒入巴比妥缓冲液，琼脂板两端用滤纸与缓冲液搭桥，接通电源，电压10-12v/cm电泳1-2h。（6）样品中有蓝色染料，当蓝色接近另一端时，终止电泳，小心取出载玻片。（7）用刀片在胶体的中央，划两道平行线。刀刻要深及底部，两道平行线间隔不可大于3 mm。用大头针挑去琼脂。（8）加入人全血清，放入湿盒中，37 下扩散24h。,注意事项,（1）浇载玻片时，玻片应保持水平，琼脂 面要尽量铺平。（2）加样应一次加满，并防止样品溢出孔 外。（3）电泳过程中注意防止发热，以免影响 电泳结果。（4）电泳时要使滤纸与凝胶密切接触，不可有缝隙。,思考题,（1）画出沉淀线的形态、数量和位置，并予以简要说明。（2）与相关的免疫学试验进行比较，探讨免疫电泳的主要优点。,PH8.6巴比妥缓冲液配制：巴比妥酸 0.92g-100ml，加热熔解 巴比妥钠 5.15g-350ml，摇动熔解 混合，补足至500ml,