《制药分离工程》PPT课件.ppt

制药分离工程要点题型：填空（50分/50空）讨论（30分/5道）计算（10分）设计题或判断题（10分）,第一章 绪论1.制药工业制药工业包括生物制药、化学合成制药和中药制药。人类防病治病的三大药源：生物药物、化学药物与中药。生物药物：是利用生物体、生物组织或其成分，综合应用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学等原理与方法进行加工、制造而成的一大类预防、诊断、治疗制品，广义的生物药物包括从动物、植物、微生物等生物体中制取的各种天然生物活性物质及其人工合成或半合成的天然物质类似物。如纯化胰岛素、甲状腺素、肾上腺皮质激素、脑垂体激素、尿激酶、溶菌酶、天冬酰胺酶等，目前应用现代生物制药技术如酶工程技术、细胞工程技术、基因工程技术生产抗生素、氨基酸和植物次生代谢产物也获得很大发展。,-化学合成药物：一般由化学结构比较简单的化工原料经过一系列化学合成和物理处理过程（称全合成），或由已知具有一定基本结构的天然产物经对化学结构进行改造和物理处理过程制得（称半合成）。如磺胺、扑热息痛、诺氟沙星等。-中药：指中国传统医药。常以天然植物药、动物药和矿物药为主。随着人们对化学药物的毒副作用的认识和了解，“回归自然”使人们更倾向于采用天然植物药物，从而为中医药发挥其特长提供了前所未有的机遇。然而，由于中药原料的地域性、组成的复杂性、复方配伍的多样性等，再加之生产工艺落后，缺乏科学的、严格的工艺操作参数及系统的量化指标，致使中药产品质量不稳定，产品仍多是传统的丸、散、膏、丹类剂型，很难满足国际市场的需求。目前中药在西方草药市场上仅能以食品名义进人，还不能以治疗药物为国际社会所接受。,2.制药过程中的分离技术-制药过程包括原料药的生产和制剂的生产两个阶段。-原料药属于制药工业的中间产品，药物制剂是制药工业的终端产品。制药工程主要研究原料药的生产过程，制剂工程主要研究制剂的生产过程。原料药的生产一般包括两个阶段。第一阶段是生产的上游过程，该阶段以制药工艺学为理论基础，针对所需合成成分的分子结构、光学构象等要求，制定合理的化学合成或生化合成工艺路线和确定出适当的反应条件，设计或选用适当的反应器，完成合成反应操作以获得含药物成分产物。,第二阶段常称为生产的下游加工过程。该过程主要是采用适当的分离技术，将药物成分进行分离纯化，以传质分离工程学为理论基础，根据药物成分与杂质在物理和化学性质方面的差异，如溶解度、带电离子、化学亲和力等的差别，选择合适的分离方法，制定合理的工艺流程和操作条件，设计或选择适当的设备，完成分离纯化，使其成为高纯度的、符合药品标准的原料药。下游加工过程也即目标产物的提取、浓缩、纯化及成品化等过程。是生物技术转化为生产力不可缺少的重要环节。正因为其重要性，人们将生物技术比喻为一条河流，把制药分离工程称为下游加工过程。,3.下游加工技术的发展 最早的生物技术可追溯到古老的酿造业，包括酿酒、制造酱油、醋、酸奶、干酪等，从19世纪60年代起，人们搞清了微生物是引起发酵的原因，开发了纯种培养技术，并逐步开发了发酵法生产酒精、丙酮等产品的生产技术，生产以经验为主，称为手工业式的第一代生物技术；第二代生物技术产品出现在20世纪40年代，随着青霉素、链霉素等抗生素工业生产的扩大、化工单元操作的引进，酿造业逐渐扩展成为发酵产业。产品类型开始增多，不但有初级代谢产物，还出现了次级代谢产物，产品的多样性对分离纯化提出了更高的要求，出现了离子交换色谱及电泳技术；20世纪70年代中期以来，随着重组DNA技术即基因工程技术和细胞融合技术等现代生物技术的飞速发展，推动了第三代生物技术的发展，使天然存在的极微量的生物物质得以通过大量细胞培养进行商业规模生产，也使生物产物从原料到产品的发展，由低成本、高收率地纯化目标产物成为现实。,4.下游加工过程的一般步骤 生物技术下游加工过程有一个基本框架，具有四个基本的分离阶段：（1)发酵液的预处理与固液分离：主要任务是去除发酵液中的固相物质，为后继过程提供澄清或洁净的原料液体。过滤和离心分离是这方面的主要单元操作。（2)初步纯化（或称产物的提取）：主要任务是提高产品的浓度和质量，蒸发、沉淀、萃取和吸附是该阶段的典型操作。（3）高度纯化（或称产物的精制）:去除与产品有类似化学性质和物理性质的杂质，大大提高产品的纯度。层析、超滤、电泳与沉淀是该阶段的有效方法。（4）成品加工（产品的精制）：常采用结晶和干燥。,5.下游加工的特点（1）生物产品的稳定性差。在高温、pH、金属离子等环境下会变性，为满足其生物活性的要求，就增加了分离的难度。（2）培养液是多组份的混合物。原料液中常存在与目标分子形成难分离的混合物，因此要求利用特殊高效分离技术纯化产品。（3）对最终产品的质量要求很高。很多情况下，特别是医药产品和作为生物试剂用的产品，与人类生命息息相关，因此对其纯度的要求很高。（4）原料液中目标产物的浓度一般都很低，提取时所耗费的能量就越多，费用也就越高，产品的价格也越高。,考题1：下游加工过程的四大步骤？（1）发酵液的预处理与固液分离（2）初步纯化（3）高度纯化（4）成品加工考题2：下游加工（原料药）的特点？（1）生物产品的稳定性差。（2）培养液是多组份的混合物。（3）对最终产品的质量要求很高。（4）原料液中目标产物的浓度一般都很低。,第二章 固液萃取（浸取）原理：相似相溶目的：选择适宜溶剂和方法，充分浸出原料中有效成分。浸取剂选择：对溶质溶解度大（用量少）与溶质的沸点差异大（易回收）溶质在溶剂中易扩散（粘度小）价廉易得，无毒，腐蚀性小（安全）常用浸取剂：水、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、脂肪油 辅助剂：酸、碱、表面活性剂、甘油浸取方法：浸渍、煎煮、渗漉,浸取强化方法：超声提取 微波辅助超声提取（20kHz以上）原理：机械、空化、热效应，增大介质分子的运动速度和穿透力。机械效应辐射压强，分子解聚空化效应瞬间高压，破碎细胞热 效应升温，促溶优点：不需加热、物理过程、溶剂少、效果好缺点：噪声,微波辅助（常用2450MHz）特点：仅作用于极性分子（含水才可用）原理：吸收微波细胞内温度升高胞内压过大细胞破碎有效成分流出（热效应）优点：无温差、迅速、热效率高局限：热稳定物质、吸水性好才可用，选择性差（都溶出）要求：被提物适当粉碎、适当溶剂、浓度差、适当搅拌（本章无考题）,第三章 液液萃取原理：溶质在不相溶两相间分配系数不同，使溶质向某一相浓缩。分类：有机溶剂、超临界、反胶团、双水相等。物理萃取和化学萃取：物理萃取：溶质根据相似相溶的原理在两相间达到分配平衡，萃取剂与溶质间不发生化学反应。化学萃取：利用脂溶性萃取剂与溶质之间的化学反应生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相的分配。稀释剂：化学萃取中通常用煤油、己烷、四氯化碳和苯等有机溶剂溶解萃取剂，改善萃取相的物理性质，此时的有机溶剂称为稀释剂。,1、有机溶剂萃取 分配定律：在恒T、P条件下，溶质在互不相溶的两相中达到分配平衡时，如果其在两相中的相对分子质量相等,则其在两相中的平衡浓度之比为常数，这个常数称为分配常数。（同种分子）A=C2/C1=萃取相/萃余相多数情况下，溶质在各相中并非以同一种分子形态存在，特别是化学萃取中，这时分配系数常用溶质在两相中的总浓度之比来表示。m=C2,t/C1,t 反萃取定义：当完成萃取操作后，为进一步纯化目标产物或便于下一步分离操作的实施，而调节水相条件，将目标产物从有机相转入水相的萃取操作即为反萃取。,弱电解质的分配平衡 萃取达到平衡状态时，一方面弱电解质在水相中达到解离平衡，另一方面未解离的游离电解质在两相中达到分配平衡。,弱酸的分配系数为：,弱碱的分配系数为：,结论：对于弱酸性溶质，PH减小，ma增加；酸性条件下萃取效果好。对于弱碱性溶质，PH减小，mb减小；碱性条件下萃取效果好。应用：青霉素萃取：青霉素是较强的有机酸，pH 值对其分配系数有很大影响。在较低pH 下有利于青霉素在有机相中的分配，当pH 大于6.0时，青霉素几乎完全分配与水相中。红霉素萃取：红霉素是碱性电解质，在乙酸戊酯和pH 9.8的水相之间分配系数为44.7，而水相pH 降至5.5时，分配系数降至14.4。红霉素反萃取：可通过调节pH 值实现。红霉素在pH9.4的水相中用醋酸戊酯萃取，而反萃取用pH5.0的水溶液。,有机溶剂的选择由相似相溶的原理，重要的相似是在分子的极性上。选择与目标产物极性相近的有机溶剂为萃取剂，可以得到较大分配系数。要求：价廉易得（经济）；与水相不互溶；容易回收和再利用（环保）；毒性低，腐蚀性小（安全）；与水相有较大的密度差，且粘度小，表面张力适中，相分散和相分离较容易；不与目标产物发生反应。常用于抗生素类生物产物萃取的有机溶剂有：丁醇等醇类、乙酸乙酯、乙酸丁酯和乙酸戊酯等乙酸酯类以及甲基异丁基甲酮等。化学萃取氨基酸的稀释剂主要有：煤油、己烷、异辛烷、正十二烷等。,乳化现象 乳化定义：水（有机溶剂）以微小液滴形式分散于有机相（水相）中的现象。产生乳化后使有机相和水相分层困难。乳化原因：发酵液中存在蛋白质和固体颗粒等物质，具有表面活性剂的作用，使有机溶剂（油）和水的表面张力降低，油或水易于以微小液滴的形式分散于水相或油相中，形成乳浊液。分类：水包油型（O/W型）乳浊液：油滴分散于水相；油包水型（W/O型）乳浊液：水滴分散于油相。防止乳化的方法：（1）对发酵液进行过滤或絮凝沉淀,除去蛋白质及固体微粒（2）产生乳化后，采取适当的破乳手段,乳化现象不严重：采用过滤或离心沉降的方法；O/W型乳浊液：加入亲油性表面活性剂；W/O型乳浊液：加入亲水性表面活性剂。萃取计算单级萃取溶质的物料衡算式和平衡关系式：,ymx,得萃取后,轻重两相溶质在平衡时的浓度:,其中E为萃取因子，E=mL/H,萃余分率,萃取分率,多级错流萃取萃余率=1/(1+E)n萃取率=1-=1-1/(1+E)n多级逆流萃取萃余率=(E-1)/(E(n+1)-1)萃取率=1-=(E(n+1)-E)/(E(n+1)-1),第三章 例题原料xF=0.2，k=40(相平衡系数)，原料液流量H=0.5m/s，溶剂流量L=0.03m/s，萃取率=96%，多级逆流萃取需几级？解：萃取因子E=mL/H=400.030.5=2.4=(E(n+1)-E)/(E(n+1)-1)=96%n=3.09 需4级,考题3：液液萃取的原理？溶质在不相溶两相间分配系数不同，使溶质向某一相浓缩。考题4：多级逆流萃取的计算？萃余率=(E-1)/(E(n+1)-1)萃取率=1-=(E(n+1)-E)/(E(n+1)-1)其中，E=mL/H,第四章 超临界萃取（SFE）超临界流体的特性：超临界流体的密度近似于液体。黏度接近于气体。扩散系数比液体大。临界点附近，T、P的微小变化都会导致流体密度的显著变化，导致溶解度相应地变化。超临界流体既具有液体溶解度大的性质，又具有气体易扩散、传质速度高的优点。常用的超临界萃取剂：乙烷、丙烷、丁烷、戊烷、乙烯、氨气、CO2、SO2、甲醇、乙醇、水 其中 CO2应用最广,CO2超临界萃取剂的优点：临界点较低：Tc=31.06（防止热敏性物质的氧化和降解）临界密度(0.448g/cm3)最高（萃取能力强，提取率高）无毒、稳定性好、不易燃、价廉、易于回收,考题5：超临界萃取的概念、原理、特点？概念：当流体的P、T均超过其临界点值时，称为超临界流体。用超临界流体作为萃取剂进行的操作叫做超临界萃取原理：超临界流体的密度近似于液体，溶解能力强；黏度接近于气体，易扩散、传质。临界点附近，T、P的微小变化都会导致流体密度的显著变化，导致溶解度相应地变化，能方便的进行萃取、分离。特点：易于进行产物的萃取及分离 溶剂可循环使用 适于热敏性物质的分离，且无溶剂残留。,1、反胶团：反胶团是表面活性剂分子在有机溶剂（油）中自发形成的分子聚集体。2、萃取过程：首先,在两相界面上的表面活性剂与邻近的蛋白质分子发生作用,在界面上形成包含有蛋白质分子的反胶团,此反胶团扩散进入有机相,从而实现蛋白质的提取。通过改变水相条件可实现反萃。,3、特点：提供保持生物分子活性的屏障,第五章 反胶团、双水相萃取,4、双水相萃取双水相体系双水相体系是一种或几种物质在水中以一定浓度混合,在一定条件下形成互不相溶的两相水溶液体系。萃取依据：物质在两相间的选择性分配常用的双水相体系聚合物-聚合物-水体系以及聚合物-无机盐-水体系例如：PEG（聚乙二醇）/Dextran（葡聚糖）和PEG/无机盐优点：安全、无毒,不存在有机溶剂残留的问题整个操作在常温常压下进行,能够保持抗生素分子的活性。,考题6：反胶团、双水相萃取的概念、原理？概念：反胶团是表面活性剂分子在有机溶剂（油）中自发形成的分子聚集体。双水相体系是一种或几种物质在水中以一定浓度混合,在一定条件下形成互不相溶的两相水溶液体系。原理：反胶团：在两相界面上的表面活性剂与邻近的蛋白质分子发生静电作用,在界面上形成包含有蛋白质分子的反胶团,此反胶团扩散进入有机相,从而实现蛋白质的提取。通过改变水相条件可实现反萃。双水相：物质在两相间的选择性分配。,第六章 固液分离1、固液分离方法离心、沉降、过滤2、设备离心管式（旋液分离器）、碟式（碟式分离机）过滤叶滤机、板框压滤机、回转真空过滤机,考题7：固液分离方法、设备？方法：离心、沉降、过滤设备：离心：管式（旋液分离器）碟式（碟式分离机）过滤：叶滤机、板框压滤机、回转真空过滤机,第七章 蒸馏1、分子蒸馏（短程蒸馏）定义：在高真空度下进行非平衡分离操作的连续蒸馏过程。适用：低挥发度、高沸点、热敏性和生物活性物料的分离。2、分子蒸馏过程分子从液相主体到蒸发表面。分子在液层表面上的自由蒸发。分子从蒸发表面向冷凝面飞射。分子在冷凝面上冷凝。,3、分子蒸馏的特点分子蒸馏的蒸发面与冷凝面的距离小，蒸气分子间的碰撞几率小，系统可在高真空度下工作。分子蒸馏是不可逆过程。分子蒸馏的分离能力与各组分间的相对挥发度有关，而且与各组分的分子量有关。分子蒸馏没有鼓泡、沸腾现象。,考题8：分子蒸馏过程、特点？过程：分子从液相主体到蒸发表面。分子在液层表面上的自由蒸发。分子从蒸发表面向冷凝面飞射。分子在冷凝面上冷凝。特点：分子蒸馏的蒸发面与冷凝面的距离小，蒸气分子间的碰撞几率小，系统可在高真空度下工作。分子蒸馏是不可逆过程。分离能力与各组分间的相对挥发度有关，且与各组分的分子量有关。分子蒸馏没有鼓泡、沸腾现象。,第八章 膜分离1、膜分离定义：利用具有一定选择透过性的过滤介质进行物质的分离纯化。膜的厚度在0.5mm以下，否则就不称为膜。根据推动力本质的不同，可具体分为四类：以静压力差为推动力：微滤、超滤和反渗透以蒸汽分压差为推动力：膜蒸馏、渗透蒸发（渗透气化）以浓度差为推动力：透析以电位差为推动力：电渗析在生物分离领域应用的膜分离法包括微滤、超滤、反渗透、透析等。,2、膜材料1)天然高分子材料：纤维素衍生物，如醋酸纤维、硝酸纤维2)合成高分子材料：聚砜类、聚酰胺类、聚烯类和含氟聚合物3)无机材料：陶瓷、微孔玻璃、不锈钢和碳素等3、操作特性浓度极化（反渗透、超滤和微滤）在膜分离操作中，不能完全透过膜的溶质受到膜的截留作用，在膜表面附近浓度升高，高于主体浓度的现象。浓差极化现象不但引起流速下降，同时影响到膜的选择透过性、降低膜的运行效果，因此应降到最低程度。克服措施：震动、搅拌、错流、改变流速、升高温度,凝胶极化当膜表面附近的浓度超过溶质的溶解度时，溶质会析出，形成凝胶层。分离含有菌体、细胞或其他固形成分的料液时，易形成凝胶层。影响：产生附加传质阻力，透过通量降低。4、影响膜分离速度的因素操作方式：主要采用错流（减轻浓度极化，透过通量较大）料液浓度：Jv随Cb的增大而减小。流速：流速增大，传质系数增大，透过通量亦增大。压力：当P小,Jv与p成正比；P 增加，Jv的增长速率减慢；P继续增加时，Jv为此流速下的极限值。,5、膜污染、预防污染原因A、凝胶极化引起的凝胶层B、溶质在膜表面的吸附层C、膜孔堵塞D、膜孔内溶质吸附预防膜的预处理(用乙醇浸泡聚砜膜)，料液预处理(调pH，预过滤)，开发抗污染膜，远临界压力操作等。,第八章 例题例1：超滤、微滤、反渗透的差别及共同点？微滤（MF）：膜孔较大，操作压力小（0.05-0.5MPa）,可除去0.1-10m的颗粒。超滤（UF）：膜孔较小，膜两侧渗透压比RO低，操作压力（0.1-1.0MPa）,适用于分离或浓缩直径1-50nm的生物大分子（蛋白质、病毒等）。反渗透（RO）：操作压力较大（几十个大气压），适用于1nm以下小分子的浓缩。共同点：均靠压差和膜的筛分性质进行工作。,例2：膜分离过程，污染原因？如何处理？污染原因：一是附着层被滤饼、有机物凝胶、无机物水垢、胶体物质或微生物等吸附于表面；二是料液中的溶质结晶或沉淀造成堵塞。膜污染可预防或减轻，措施如下：料液预处理、膜性质改善（抗污染）、操作条件改变等（远临界压力）。膜污染所引起的通量衰减往往不可逆，只能通过清洗的方式消除，包括物理冲洗和化学药品溶液清洗。,例3、热敏性抗生素的浓缩方法？如何去除发酵液中的大分子蛋白质？反渗透、超滤膜例4、产物的分子量在1000以下，要如何去除其中的热原？（截留分子量）MWCO1104的超滤膜,考题9：超滤、微滤、反渗透的概念缩写？超滤（UF）：膜孔小，通过筛分作用将大于膜孔的大分子溶质截留，使其与溶剂及小分子组分分离。微滤（MF）：膜孔较大，通过筛分作用将大于膜孔的微粒、细菌、悬浮物截留，达到澄清溶液的目的。反渗透（RO）:通过压差在膜两侧形成电势差，促使溶剂透过膜而达到浓缩溶质的目的。,考题10：膜污染、预防？污染原因：附着层被凝胶、水垢、微生物等吸附于表面 料液中溶质结晶或沉淀造成膜孔堵塞预防：膜的预处理(用乙醇浸泡聚砜膜)料液预处理(调pH，预过滤)开发抗污染膜远临界压力操作等。,3、吸附平衡吸附等温线 当吸附剂与溶液中的溶质达到平衡时，其吸附量q*同溶液中溶质的平衡浓度与温度有关。当温度一定时，吸附量只和浓度有关。q*=f(c)-吸附等温线 四种吸附等温线亨利型:q*=mc，一般在低浓度范围内成立。Freundlich型:q*=kc1/n,n=1-10；抗生素、类固醇及激素吸附兰格谬尔型：q*=qkc/(1+kc);蛋白质的吸附矩形:q*=kc1/n，n10时，q*=常数，为矩形;单克隆抗体的吸附,4、吸附历程吸附速率：单位重量吸附剂、单位时间内，吸附的物质量步骤：（1）外扩散，通过吸附剂外表面液膜至颗粒表面（2）内扩散，在孔内表面扩散（3）吸 附，表面吸附控制步骤：物理吸附内、外扩散；化学吸附表面吸附5、吸附设备固定床、流化床、膨胀床,第九章 吸附1、定义：利用吸附剂对液体或气体中某一组分的选择性吸附能力，使其富集在吸附剂表面。吸附主要分为物理吸附、化学吸附。作用力分别为分子间引力和化学键合力。2、常用的吸附剂种类：活性炭：普遍使用，常用于生物产物的脱色和除臭等过程大孔网状吸附剂：价格昂贵。特点：脱色去臭效果理想；对有机物具有良好的选择性；物化性质稳定；机械强度好；吸附速度快；解吸、再生容易。,考题11：四种吸附平衡方程（吸附等温线）？Henry型:q*=mc，一般在低浓度范围内成立。Freundlich型:q*=kc1/n,n=1-10；抗生素、类固醇及激素吸附Langmuir：q*=qkc/(1+kc);蛋白质的吸附Rectangle(矩形):q*=kc1/n，n10时，q*=常数，为矩形;单克隆抗体的吸附考题12：影响吸附的主要因素？吸附剂性质：化学成分、材料结构、比表面积、孔径分布、粒度分布等。吸附质的性质。操作条件的影响。,第十章 离子交换（重要）1、离子交换剂的构成立体网络骨架（高聚物）+活性基团（固定离子、活动离子）注：树脂本身不是离子化合物，无交换能力，需要加上活性基团。2、分类：阳离子交换树脂（cation）：强酸性（-SO3H）、弱酸性(-COOH)阴离子交换树脂（anion）:强碱性(-N(CH3)3)、弱碱性(-NH3)例如：常用于蛋白质提取的、多糖类离子交换树脂DEAE（二乙基氨基乙基纤维素）anion（带正电）CMC(羧甲基纤维素)cation（带负电）,3、性能评价 交换容量：单位质量干燥离子交换剂或单位体积湿离子交换剂，所能吸附的一价离子的毫摩尔数。单位：mmol/g树脂 或 mmol/mL湿树脂4、影响因素 被吸附离子的带电情况：正、负；多、少 离子取代的优先顺序：带电荷多、半径大、浓度大5、操作步骤 预处理、吸附、洗脱、再生,例2、现有四种氨基酸A、B、C、D，等电点pI分别为2.98、5.95、6.7、9.5，在pH=3的缓冲溶液中，用阳离子吸附树脂吸附，问氨基酸的洗脱顺序？在pH=3的缓冲溶液中，A、B、C、D分别带负电、正电、正电、正电。A、B、C、D所带电荷量的多少分别为ABCD。,第十章 例题例1、（设计题）血清蛋白质的pI大多在7以下，只有抗体IgG的pI为8.3。设计离子交换程序，用DEAE-sephacel，可很快地纯化IgG。DEAE-sephacel为阴离子交换树脂78.3,IgG带负电，需先吸附再解吸，速度较慢。调节7pH8.3，可很快地纯化IgG。,考题13：离子交换的原理、步骤？原理：能解离的不溶性固体物质，与溶液接触时可与溶液中的离子发生离子交换反应：,步骤：预处理、吸附、洗脱、再生。洗脱的方法？pH梯度法和改变离子强度法。离子交换的应用？提取中药有效成分、提取抗生素、水处理（软化和去离子）例如：多糖类-蛋白质提取、螯合树脂-碱金属吸附,交换树脂的组成？立体网络骨架（母体）+活性基团（固定离子和活动离子）糖类离子交换剂有哪些？离子交换纤维素、交联葡聚糖、交联琼脂糖代表性离子交换剂？DEAE(二乙基氨基乙基纤维素)-阴离子交换树脂CMC（羧甲基纤维素）-阳离子交换树脂,第十一章 色谱分离1、原理：溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同，引起移动速度的不同而进行分离。（速度快的最先流出）三要素：固定相、流动相、样品2、分类：按机理分：凝胶、离子交换、亲和、疏水作用凝胶色谱：根据蛋白质分子量的不同进行分离。离子交换色谱：根据蛋白质分子与树脂间的静电引力进行分离。亲和色谱：根据蛋白质分子与配基间的特异性的亲和作用进行分离。,3、如何进行选择：了解样品的有关性质熟悉各色谱方法的特点及应用范围选择依据：样品相对分子质量、溶解度、极性、稳定性例如：相对分子质量2000凝胶色谱（GFC）,考题14：按分离机制分类？及其概念和原理？分类：凝胶色谱（SEC或GFC）：以凝胶为固定相，根据各组分分子大小的不同而进行分离的色谱技术。原理：凝胶具有一定的孔径，大分子进不去而先流出色谱柱，小分子由凝胶孔径通过后流出，进而将混合组分分离。离子交换色谱(IEC)：以离子交换树脂为固定相，根据各种离子对离子交换树脂的相对亲和力不同，而在色谱柱上分离成不连续的谱带。原理：离子与固定相间的静电引力的不同。,亲和色谱（AC）：以亲和吸附剂为固定相，利用蛋白质分子和适当的配体间存在特异性的亲和作用，来进行分离。原理：蛋白质分子和适当的配体间存在特异性的亲和作用。疏水作用色谱（HIC）：以疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的相互作用的差别，来进行分离。原理：蛋白质与疏水性吸附剂之间的相互作用的差别。,正相/反相色谱（N/R PC）：根据固定相和流动相的极性与非极性的差别而定义。NPC的固定相为极性、流动相为非极性，RPC的固定相为非极性、流动相为极性。原理：根据各组分与流动相之间的分配系数、吸附作用等的差异，来实现分离。正相/反相色谱常用的固定相和流动相？NPC的固定相为极性（含水硅胶）流动相为非极性（烷烃），RPC的固定相为非极性（硅烷）流动相为极性（甲醇-水）。常用分离蛋白质的色谱有哪些？凝胶色谱、离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱。,气相、液相、凝胶、离子交换等色谱的缩写？气相（GC）、液相（LC）、高效液相色谱（HPLC）、凝胶（SEC）、离子交换（IEC）、超临界流体色谱（SFC）,第十二章 结晶1、定义：固体物质以晶体形态从蒸汽、溶液（熔液）中析出。（缓慢析出）特征:离子和分子在空间晶格的结点上呈规则排列。2、原理：饱和溶液：当溶液中溶质浓度等于该溶质在同等条件下的饱和溶解度时，该溶液称为饱和溶液；过饱和溶液：溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶液称之为过饱和溶液；溶质只有在过饱和溶液中才能析出。,3、结晶的步骤实质上，在饱和溶液中，晶核是处于一种形成溶解再形成的动态平衡之中，只有达到一定的过饱和度以后，晶核才能够稳定存在。（1）过饱和溶液的形成（2）晶核的形成（3）晶体生长其中，溶液达到过饱和状态是结晶的前提；过饱和度是结晶的推动力。,4、溶解度曲线 在温度-溶解度关系图中，SS曲线下方为稳定区，在该区域任意一点溶液均是稳定的；而在SS曲线和TT曲线之间的区域为亚稳定区，如不采取一定手段（如加入晶核），溶液可长时间保持稳定；加入晶核后，溶质在晶核周围聚集、排列，溶质浓度降低至SS线；,在TT曲线（超溶解度曲线）上半部的区域称为不稳定区，在该区任意一点溶液均能自发形成结晶，溶液中溶质浓度迅速降至SS线（饱和溶解度曲线）；形成小结晶，质量差。,5、过饱和溶液的形成（1）热饱和溶液冷却法（等溶剂结晶）：适用溶解度随温度升高而增加体系；（2）部分溶剂蒸发法（等温结晶法）：适用溶解度随温度降低变化不大的体系；（3）真空蒸发冷却法：使溶剂在真空下迅速蒸发，并结合绝热冷却，是结合冷却和蒸发的一种结晶方法。（4）化学反应结晶：加入反应剂产生新物质，当新物质的溶解度超过饱和溶解度时，即有晶体析出；,6、常用的工业起晶方法（1）自然起晶法：溶剂蒸发进入不稳定区形成晶核、当产生一定量的晶种后，加入稀溶液使溶液浓度降至亚稳定区，新的晶种不再产生，溶质在晶种表面生长。（2）刺激起晶法：将溶液蒸发至亚稳定区后，冷却，进入不稳定区，形成一定量的晶核，此时溶液的浓度会有所降低，进入并稳定在亚稳定的养晶区使晶体生长。（3）晶种起晶法：将溶液蒸发后冷却至亚稳定区的较低浓度，加入一定量和一定大小的晶种，使溶质在晶种表面生长。,7、晶体质量包括那几方面的内容？晶体大小形状纯度 结晶过程应尽量控制在介稳区内进行，以得到平均粒度较大的结晶产品，避免产生过多晶核而影响最终产品的粒度。,考题15：（过）饱和溶解度曲线的意义？饱和溶液：溶液中溶质浓度等于该溶质在同等条件下的饱和溶解度。过饱和溶液：溶质浓度超过饱和溶解度。过饱和溶液形成的方法？（1）热饱和溶液冷却法（2）部分溶剂蒸发法（3）真空蒸发冷却法（4）化学反应结晶法,常用的工业起晶方法？（1）自然起晶法（2）刺激起晶法（3）晶种起晶法结晶的步骤？（1）过饱和溶液的形成（2）晶核的形成（3）晶体生长晶体质量包括那几方面的内容？晶体大小、形状、纯度结晶的前提、推动力？过饱和状态是结晶的前提；过饱和度是结晶的推动力。,第十三章 电泳定义：带电荷溶质在电场作用下发生定向泳动。分类：按其分离原理的不同，分为区带电泳、移动界面电泳、等电聚焦电泳等。区带电泳又分为有载体（纸、凝胶、粉末）和无载体（毛细管、自由电泳）迁移率：电泳迁移率(m)是指在单位电场强度(1V/cm)时带电粒子的迁移速度。迁移率与带电粒子所带电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。常用电泳技术：1、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和SDSPAGE（加表面活性剂）2、等电点聚焦电泳（IFE）3、双向电泳（二维）、毛细管电泳、连续电泳,1、PAGE和SDSPAGE 聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制：分离较大的蛋白质，需要使用低浓度的凝胶(孔径较大)；分离较小的蛋白质，使用的较高浓度凝胶(孔径较小)。SDS即十二烷基磺酸钠，是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，使蛋白质变性和解聚，并形成棒状结构。蛋白质分子本身的电荷完全被SDS 掩盖。这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异（均带负电）。电泳的影响因素：PAGE分子量和电荷 SDSPAGE分子量（未知蛋白质分子量的测定）,2、等电点聚焦电泳（IFE）原理：是根据两性物质等电点（pI）不同，两性物质在电泳过程中会被集中在与其等电点相等的pH区域内，形成分离的蛋白质区带。机制：在凝胶中加入两性电解质从而构成从正极到负极pH逐渐增加的pH梯度。处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等电点的位置上。蛋白质所带正负电荷的数量随所处环境酸碱度的变化而变化。在电场存在下的一定pH溶液中，带正电的蛋白分子将向负极移动而带负电的蛋白分子将向正极移动，在某一pH时，蛋白分子不带电在电场中不再移动。,pH 梯度的形成：两性电解质是人工合成的一种复杂的多氨基多羧基的混合物。要根据待分离样品的情况选择适当的两性电解质，使待分离样品中各个组分都在两性电解质的pH 范围内。接通电源，两性电解质中不同的等电点的物质通过电泳在凝胶中形成pH 梯度，从阳极侧到阴极侧pH 值由低到高呈线性梯度分布。应用：测定某个未知蛋白质的等电点 同功酶（一两个氨基酸的差别）的分离优点：混合物可被完全分离缺点：载体两性电解质对产品有污染 pH梯度的稳定性不高 操作中凝胶易脱水起皱,3、双向电泳、毛细管电泳、连续电泳双向电泳：IFE/SDSPAGE（蛋白质组的研究）优点：分辨率高；缺点：处理量小毛细管电泳：石英毛细管 优点：分离精度高；缺点：处理量小连续电泳：用于大量纯化蛋白质（无载体）,考题16：迁移率的概念？电泳迁移率(m)是指在单位电场强度(1V/cm)时带电粒子的迁移速度。迁移率与带电粒子所带电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。PAGE、SDS-PAGE、IFE、双向电泳概念、原理？PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，迁移率的影响因素有溶质所带电荷量、分子量。原理：凝胶的分子筛效应、电场力作用。SDS-PAGE：在聚丙烯酰胺凝胶中加入表面活性剂，迁移率的影响因素只有溶质分子量。原理：凝胶的分子筛效应。,IFE：在连续的pH梯度溶液中，加入待分离物，利用两性物在等电点的pH条件下不带电，在电场中不发生泳动的特点来进行分离。原理：在等电点的pH条件下不带电、不发生泳动，形成分离的蛋白质区带。双向电泳：第一相为IFE,第二相为SDS-PAGE。根据不同组分间的等电点差异和分子量差异进行分离。原理：等电点差异和分子量差异进行分离。,第十四章 对映体拆分定义：将外消旋体拆分为单一对映体。方法：结晶拆分法生物拆分法化学拆分法色谱拆分法手性膜拆分1、结晶拆分法例如：酒石酸对映体拆分。结晶的外观不同2、生物拆分法（酶法）选择性地使外消旋体中的一个反应例如：外消旋体氨基酸的拆分,3、化学拆分法利用合适的分离性质差异来拆分。原理：（常规性质差异不行）将对映体转变为非对映体。步骤：手性试剂反应、分离非对映体、还原成单个对映体。（选择合适的拆分剂和拆分溶剂）拆分剂要求：易生成非对映体，易还原出原对映体非对映体溶解度差别大旋光纯，价廉易得，易回收,4、色谱拆分法分类：手性试剂衍生法手性添加剂法手性固定相法手性试剂衍生法：用光学纯的手性试剂将对映体转变为非对映体。要求：衍生剂对映体纯，非对映体的分离性大手性添加剂法（手性固定相法）：分子的手性识别作用。即对映体与添加剂（固定相）间的相互作用与分子的立体选择性有关。例如：环糊精添加剂5、手性膜拆分原理：提供合适的手性膜环境，让某一对映体有选择性地穿过。包括液膜和固膜,考题17：对映体的拆分方法？结晶拆分法、生物拆分法、化学拆分法、色谱拆分法、手性膜拆分。化学拆分法的原理及内容？原理：将具有相同性质的对映体转变为具有不同性质的非对映体来进行拆分。内容：手性试剂衍生、分离非对映体、分解（还原）单个对映体分子印迹技术？以待分离手性物为模板分子，（与聚合物交联）经聚合后洗脱，（聚合物上）留出空穴，作为对待分离手性物的特异性识别位点，从而达到拆分的目的。,