淋巴细胞的分离与淋巴细胞活性检测.ppt

实验四 淋巴细胞分离 淋巴细胞活性检测,【实验目的】1.学习单个核细胞分离的基本方法，熟悉本实验的原理与用途。2.熟悉E玫瑰花环形成的原理；了解E玫瑰花环形成的实验方法。,外周血单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，可根据其与其他细胞形态、体积和密度的不同进行分离。利用聚蔗糖泛影葡胺分层液作密度梯度离心，可将不同比重的血液组分按其密度不同作相应密度梯度分布，达到分离目的，收集到淋巴细胞。正常人和动物的T淋巴细胞表面具有能与红细胞（RBC）表面糖肽相结合的受体（E受体），即CD2分子，是T细胞所特有的表面标志。在体外一定条件下T细胞能直接与RBC结合，形成玫瑰花样细胞团，称为E玫瑰花环。常用于检测T细胞的数量、活性及分离T细胞。,【实验原理】,【实验器材】略,【实验方法】,1.小鼠摘眼球取血0.5 ml，滴入装有0.5 ml肝素的试管A内摇匀，Hanks液对倍稀释。2.将上述抗凝血用吸管慢慢加到有2 ml淋巴细胞分 离液的试管B中，确保沿管壁流下的血液与分离液 形成明显的界面。3.配平试管A、B，2000 rpm离心15 min，小心取出。4.小心吸取B试管内中间区域的白色雾状薄层，移入试管C。,5.Hanks液洗2 次（加Hanks液对倍稀释,2000 rpm离心10min，对半弃上清液，重复一次）。6.洗完后留下管底0.1ml液体，即为淋巴细胞悬液。7.加入0.1 ml SRBC,500 rpm离心5 min。低速离心后能迅速形成E花环，称为Ea花环（active T rosette）。8.小心吸去上清，留0.1 ml，轻轻吹匀，加0.8%戊二醛2滴混匀后固定2-3 min。,9.取1滴悬液涂片，晾干后加瑞氏染液1滴，盖上盖玻片，镜检。10.结果判断：凡能结合3个以上SRBC者即为E花环阳性细胞。计数200个淋巴细胞，算出花环形成细胞的百分率。Ea花环正常值为25%40%。11.注意事项：12.作业：实验报告,1.T细胞 2.SRBC,