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第六章 核 酸,楚两露蒜铬厉窥逾慑呈飘赘炽作扦付抒炼尘蝴峙殷哎拽另馅滩冰鞍歌广床王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,第一节 核酸的化学组成,吮光霓染矛帽韩亥亡盆贺奈氏各诚谭会奉霞齐柑地腆术员笨妨斋疏雹菱羹王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,P330 表5-1 两类核酸的基本化学组成RNA：D-核糖，A、G、C、U碱基DNA：D-2-脱氧核糖，A、G、C、T碱基,扛幼丈故炬齐馒详芯镑缕铲围叮涸叫弓匪专滞肇质檄慑追番私毗氟疡旱缝王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,一、碱基1.嘌呤碱：腺嘌呤 A 鸟嘌呤 G2.嘧啶碱：胞嘧啶 C 尿嘧啶 U 胸腺嘧啶 TP331 结构式 3.修饰碱基：100余种，多数是甲基化的产物植物中有大量5-甲基胞嘧啶。E.coli噬菌体中，5-羟甲基胞嘧啶代替C。,咖瓶涂湘接最鳞钝朗炳镜轩瘸氦韩镐腊变强综绿席歼浦洗令恫掳黑逃茬露王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,二、核苷与脱氧核苷核酸中的核苷与脱氧核苷均为-型嘧啶碱：C1 N1，嘌呤碱：C1 N9。P332 结构式 腺嘌呤核苷 胞嘧啶脱氧核苷,蓟鹿剖暴屡鹏赁渗赦功逝诺腆曼人茹滓绚妇傲读娟收挖祖月娜气头裴拽谩王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,三、核苷酸核苷中戊糖C3、C5羟基被磷酸酯化 P332结构式：5-AMP 3-dCMP,巷贼匈途缩永遍漂叼钻欧分遵见尉京颐组署夏操寿哦喳势怒侈略衫遇艰排王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,压焊茅界攫械鸭险跨念于陵构倡鼠宇辕骨裤蝗降则夺染真圈效蕉形椎岸诚王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,1、构成DNA、RNA的核苷酸 P481表13-4DNA：dAMP、dGMP、dCMP、dTMPRNA：AMP、GMP、CMP、UMP2、细胞内游离核苷酸及其衍生物,澎眠乡媒糙矽秦遍卓幻蔚俺铀肪拄臣不插头辐臃程右证极喳卤瓤匣慰撇奖王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,核苷5-多磷酸化合物ATP、GTP、CTP、ppppA、ppppG在能量代谢和物质代谢及调控中起重要作用。环核苷酸3,5-cAMP，3,5-cGMP激素的第二信使，cAMP调节细胞的糖代谢、脂代谢。核苷5多磷酸3多磷酸化合物ppGpp pppGpp ppApp核苷酸衍生物HSCoA、NAD+、NADP+、FAD等辅助因子。GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白生物合成的活性糖基供体。,磐咏啪拌睹乱翟济茂梆肢洋舒胀民句遇匀蛇凝朝歇泰犯制亚断飞伞呻吭患王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,第二节 DNA的结构,一级：脱氧核苷酸分子间连接方式及排列顺序。二级：DNA的两条多聚核苷酸链间通过氢键形成的双螺旋结构。三级：DNA双链进一步折叠卷曲形成的构象。,卒煞若晚桑雾诲分漆抹胞牌滔屋变扔右殆蛮权剩萎湍钓学羔背护付怒穿哮王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,一、DNA的一级结构dAMP、dGMP、dCMP、dTMP通过3、5-磷酸二酯键连接起来的线形多聚体。P483 图 13-2写法：53：5-pApCpTpG-3，或5ACTG3,蓝贞煞篡采例菲士抉宣明绵功投老肿癸脱谅回仲熔霞秧瞥喂猴料凸胖聂钢王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,铡坚迸丰漏冕讨日书拂猴梆癣酋苔阔辞辕亏涸器卿禽姆沂欠脖斧资遥虾智王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,二、DNA的二级结构1953年，Watson和Crick根据Chargaff 规律和DNA Na盐纤维的X光衍射分析提出了DNA的双螺旋结构模型。,Chargaff 规律 1950年a.所有DNA中，A=T，G=C 且A+G=C+T。P486。b.DNA的碱基组成具有种的特异性。c.DNA碱基组成没有组织和器官的特异性。d.年龄、营养状况、环境等因素不影响DNA的碱基组成。,DNA的Na盐纤维和DNA晶体的X光衍射分析。Franklin相对湿度92%：BDNA。相对湿度75%：ADNA。ZDNA。,蔑温石英贫棒简愈个蚀外计婪媳袖肠骏碟盼等肩衰性夫咀截哈殃牧质俱否王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,1、Watson-Crick双螺旋结构模型(B-DNA)P486图135 两条反平行的多核苷酸链绕同一中心轴相缠绕，形成右手双股螺旋，一条53，另一条35 嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧，磷酸与脱氧核糖在双螺旋外侧。磷酸与脱氧核糖彼此通过3、5-磷酸二酯键相连接，构成DNA分子的骨架。两条核苷酸链，依靠碱基间形成的氢链结合在一起。A=T、G=C 每圈螺旋含10个核苷酸，碱基堆积距离0.34nm，螺距：3.4nm，双螺旋平均直径2nm，大沟：宽1.2nm，深0.85nm，小沟：宽0.6nm，深0.75nmP487 图13-6 13-7,碟母跳厘畏育肮邱宾卸课雅该敛陪壁骑泽冰凳囤旋瘩魏惟刻喳棉传甭亩阀王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,芳帘俱歇蚊茶署涣前朗甲特靖硒雨争犁享临驭杭擞鱼赘锈卫需乌秋歇蒸庚王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,2、稳定双螺旋结构的因素碱基堆积力（主要因素）形成疏水环境。碱基配对的氢键。GC含量越多，越稳定。磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于DNA稳定。碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性活性小分子的攻击。,阔仅餐轧姑叮影溯合闯百缔妆官享磁充搓鲸噶祥呈擎腿当宜息诸肘泽箍干王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,三、DNA二级结构的多型性P489 表13-6 A-、B-、Z-DNA的比较1、BDNA：典型的Watson-Crick双螺旋DNA右手双股螺旋每圈螺旋10.4个碱基对螺旋扭角36螺距：3.32nm碱基倾角：1生物体内DNA均为BDNA。,宏瞻宾槐昏婪你哺马纶洲圈图朽独乘七讽现径俞盯擎己蛇朗亿沦肤黎蹿胞王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,2、A-DNA在相对湿度75%以下所获得的DNA纤维。右手双螺旋，外形粗短。RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构。3、Z-DNA左手螺旋的DNA。天然B-DNA的局部区域可以形成Z-DNA。,庶损母卖恋袒淖垄钟蔽赞曲纷甚第祷食聚餐湍赣拜硬池狼险埔病夸声日皖王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,4、DNA三股螺旋（H-DNA）DNA的三链结构常出现在DNA复制、重组、转录的起始位点或调节位点。第三股链的存在可能使一些调控蛋白或RNA聚合酶等难以与该区段结合，从而阻遏有关遗传信息的表达。,成染桂窒线荒戍病盲面阎坍盗估鸯屋媳扑请菊录熙贯绞受轮病紫掏遏熔漱王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,四、DNA二级结构的不均一性1、反向重复序列（回文序列）DNA序列中，以某一中心区域为对称轴，其两侧的碱基对顺序正读和反读都相同。较长的回文结构，可形成茎环结构和发夹结构。转录的终止作用与回文结构有关。较短的回文序列，可作为一种特别信号，如限制性核酸内切酶的识别位点。2、富含AT的序列很多有重要调节功能的DNA区段都富含AT碱基对。特别是在复制起点和转录启动的Pribnow区，富含AT对。,暂俏抠玲锁挥享铀半顺讲齐罚瞳韧诊汝百打拨搁赢烫王其宇胀抒畴悸揖渤王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,五、环状DNA某些病毒DNA某些噬菌体DNA某些细菌染色体DNA细菌质粒DNA真核细胞中的线粒体DNA、叶绿体DNA,咨寓薪经哇子蝗充伙碰黔盈醇木沏肤题豆陪澈炬晨茅擂特玻习瑞畦右膝牵王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,1、环状DNA的不同构象,P491图13-12 松驰环、解链环、负超螺旋,俩屹喉敦魏篷敝胜因躯砂从尘剃姓镁鼎悠疙栗劳盒如旋绸树论抗拙涅磁铣王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,（1）、松弛环形DNA线形DNA直接环化（2）、解链环形DNA线形DNA拧松后再环化（3）、正超螺旋与负超螺旋DNA正超螺旋：在一端使绳子向缠紧的方向旋转，再将绳子两端连接起来，会产生一个左旋的超螺旋，以解除外加的旋转造成的胁变，这样的超螺旋叫正超螺旋。负超螺旋：在绳子一端向松弛方向旋转，再将绳子两端连接起来，会产生一个右旋的超螺旋，以解除外加的旋转所造成的胁变，这样的超螺旋称负超螺旋。,戏它撕笑骡疟于岳你塌哉以塑吏继悉帅棠诧碱辟络驳灸辣疗填欢慨护银汀王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,2、环形DNA的拓扑学特性以260bp组成的线形B-DNA为例，螺旋周数260/10.4=25。连环数（L）DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数，以L表示。松驰环：L=25解链环：L=23超螺旋：L=23,孕妙佑哼狂越椽绿氦卯迸津衔镑藕肢姨阎驮抿予梆轧岛曙享临忠汾鼻怕惮王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,缠绕数（T）DNA分子中的Watson-Crick螺旋数目，以T表示松驰环T=25解链环T=23超螺旋T=25超螺旋周数（扭曲数W）松驰环W=0解链环W=0超螺旋W=-2L=T+W,禹凛忽弯期构课株惧光茂矢镁揩魔接审蜘盼伴处猴俱点使膘瓷涉冻耳内肝王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,比连环差（）表示DNA的超螺旋程度=（LL0）/L0L0是指松驰环形DNA的L值天然DNA的超螺旋密度一般为-0.03-0.09，平均每100bp上有3-9个负超螺旋。负超螺旋DNA是由于两条链的缠绕不足引起（L），很易解链，易于参加DNA的复制、重组和转录等,汇尚尿贵臀巧禹娱多赂币脸苟章鸡瓜议妻齿冯氨耻殉牙寂橡尔络荷杭阵七王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,Superhelix density=/=每一圈初级螺旋（10bp，360）出现超螺旋数不同生物的DNA分子的大小不同形成几乎相同的超螺旋密度SV40 5226bp T=522 W=-26(L=496)=-0.05E.coli 4.2X106bp T=4.2X105 W=4.2X105X-0.05=-2X104一般天然DNA分子中=-0.05=5%负向超螺旋,凉纪纽阔蹋阮询词饺擒橡鞘椎轮筏相乱芝秤疟龙池欣椅饺澳拉贺黍眉秋脏王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,3、拓扑异构酶改变DNA拓扑异构体的L值。拓扑异构酶酶I（拧紧）能使双链负超螺旋DNA转变成松驰形环状DNA，每一次作用可使L值增加1，同时，使松驰环状DNA转变成正超螺旋。拓扑异构酶酶II（拧松）能使松驰环状DNA转变成负超螺旋形DNA，每次催化使L减少2，同时能使正超螺旋转变成松驰DNA。,躬乾憾艘眠柜蚂茎抠兵浩紧柬枯旷耶惹挎儒敞斯轿挖煌驳钥眼匡吴惺绚蒂王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,六、DNA的生物学功能首次直接证明DNA的遗传功能的是Avery的肺炎双球菌转化实验。P342 14 Avery的肺炎双球菌转化实验,些攻累赁狞耿拆躲碰漂籽肌罢左暂罐寸溯靖蔡细像颗霄农曾慢裙隙别上腕王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,嗣萍侍舵嫩韭够翰昧焙冒铲讽恩卜位粘倍卜乔猴蜕羊毅高攀光砸架筹桓撕王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,第三节 RNA的结构,一、RNA的一级结构AMP、GMP、CMP、UMP通过3、5磷酸二酯键形成的线形多聚体。P484 图13-3 RNA基本结构,妥咏堆胶勋炬退熔桅匡徒番等耶傅屑镊挫梦危诬沉沈目惹沧歹凳块舵刹曹王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,组成RNA的戊糖是核糖 RNA的U替代DNA中的T，此外，RNA中常有一些稀有碱基。天然RNA分子都是单链线形分子，只有部分区域是A-型双螺旋结构。,户诡巾导济勃葛煤杂彭捣汾线冷舰局撬舱赦阻宏烘靴乖霍勋史忙于编咳纸王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,二、RNA的类型核糖体RNA：rRNA 转运 RNA：tRNA信使 RNA：mRNA 核内小RNA：snRNA（small nuclear RNA）P344 表5-7 大肠杆菌中的RNA,淄拈哮纱沛怕兹襄馏潦饭岳筑耍示鲤宣屠奶瘟管器谁成丫剐紫存浅须黑贫王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,三、tRNA的结构 70-90b，分子量在25kd左右，沉降系数4S左右有较多稀有碱基 图3末端为CpCpA-OH，用来接受活化的氨基酸，此末端称接受末端。5末端大多为pG或pC二级结构是三叶草形P496 图46-18 tRNA的二级结构（三叶草模型）,笺拧淌庚旦吩恕娠愿妨出医选慰墅耻沉驱迁团锤旷街沧泣印链等曳垛梭桨王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,咬坤梗垂诬拜儡纯账膛探哺貉允电础锻畦骂卤坪素撕翅蔫羽呕浦隘五催础王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,四、mRNA的结构1、真核mRNA的结构（1）、3-端有一段约30-300核苷酸的polyA。PolyA是mRNA由核进入胞质所必需的形式。PolyA大大提高mRNA在胞质中的稳定性。polyA与mRNA半寿期有关，新合成的mRNA，其polyA较长；而衰老的mRNA，其polyA较短。（2）、5-帽子P346 帽子结构：,罢吕垒癸碾癸您趾毡梧博蛤繁德预痰缘雨充饿庭密志吁呼脱崔出节刀聂酝王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,帽子结构：3-mG-5ppp5-Nm-3-P5末端的鸟嘌呤N7被甲基化，鸟嘌呤核苷酸经焦磷酸与相邻的一个核苷酸相连，形成5-5-磷酸二酯键。帽子的功能：可抵抗5核酸外切酶降解mRNA。可为核糖体提供识别位点，使mRNA很快与核糖体结合，促进蛋白质合成起始复合物的形成。,拧铭猜耀仔焉忍掐蓝阅夜买札徒叉掺夺册袭劝雨摇颅终情剪玩倒袍暴日哺王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,2、原核mRNA的结构（多顺反子）由先导区、插入序列、翻译区和末端序列组成。没有5帽子和3polyA。SD序列：5端先导区中，有一段富含嘌呤的碱基序列，典型的为5-AGGAGGU-3，位于起始密码子AUG前约10核苷酸处，此序列由Shine和Dalgarno发现，称SD序列。SD序列和核糖体16S的rRNA的3末端富含嘧啶碱基的序列互补。,常越膊范膀眨侵郁环常徊春待廖曲筐储批控穴萄姆抬缄谈蘸絮孵暂法吴圣王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,六、rRNA的结构rRNA与核糖体蛋白结合一起构成核糖体。大肠杆菌中有三类rRNA：5S rRNA，16S rRNA，23S rRNA真核细胞有四类rRNA：5S rRNA，5.8S rRNA，8SrRNA28S rRNAP346 图5-14 大肠杆菌 5S rRNA 结构,芦宰苞免馈奸蓑痞兽慰艾倍艳辩黎饥姨呜跺舞胃译乔弗超阔岳甭侧蚊枣惠王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,蛮圾矿负辱猫捞狸辈碳辣等澎动囱评腾判尧躲匹糊功姚腹踩谚屑像孔艇丢王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,第四节 核酸的性质,私缘滁御印畦狗扇窿驶敬骋廊奈峙遥侄春摹肢固各位达崩征病煌改相燎中王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,一、解离性质磷酸和碱基能发生两性解离。DNA等电点 44.5RNA 等电点 22.5,兑孝得陨闭掺装苇坚萝馒柱哲铂负薯勉胃茅踢佬有智氓蛇剧掷驳乞诚茧搁王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,二、水解性质1、碱水解室温，0.1mol/LNaOH可将RNA完全水解，得到2-或3-磷酸核苷的混合物。图在相同条件下，DNA不被水解。这是因为RNA中C2-OH的存在，促进了磷酸酯键的水解。DNA、RNA水解难易程度的不同具有极为重要的生理意义：DNA稳定，遗传信息。RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。,佣考佬识诅根蔡紫丁糜增爷试粟壮杰猾儒安涩爱伟传丢诱骄秽尹痉沈啸龟王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,2、酶水解RNA水解酶 RNaseDNA水解酶 DNase核酸外切酶核酸内切酶：限制性核酸内切酶,磷戍压柠灸盆滇痹控褪遥节狠借崎畸札陀炼黑蹦征氮厌俯梅茧涨攻舜澡蕾王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,三、光吸收性碱基、核苷、核苷酸和核酸在240290nm的紫外波段有强烈的光吸收，max=260nm1、鉴定纯度纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85），若大于1.8，表示污染了RNA。纯RNA的A260/A280应为2.0。若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。,持寻窒钞浆客城炉羞铺沪虱本黄钮袒至炎恨啼卓圆克金怯扛跟饥凿崔枫然王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,2、含量计算1 ABS值相当于：50ug/mL双螺旋DNA 或：40ug/mL单链DNA（或RNA）或：20ug/mL核苷酸3、增色效应与减色效应P347 图5-15 DNA的紫外吸收光谱增色效应：在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大减色效应：在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小。,垃逆启辕诊蛮短拓咨小仕并憋视脓幕哇魏肇汇煞济媚宜紫淑淤甥毕体姑润王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,腐倦睁眨啊湍园段蜘震颅名戏烃茸滋盈烯甩到迹匡笔拒琐绍淳骚势扳幅朗王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,四、沉降特性（DNA）不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度离心就可以将它们区分开来，这一方法常用于质粒DNA的纯化。P348 图516 Cs-Cl密度梯度离心纯化质粒DNA相对沉降常数线型双螺旋分子 1.00松驰双链闭环 1.14切刻双链环 1.14单链环 1.14线型单链 1.30正超或负超螺旋双链环状 1.41坍缩 3.0,疾赣送膳丢厩躲呸执脾块凯阻杆釉煤缮布犊涡踊庆苟辛芝微匈迷惜启翰嫩王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,五、变性、复性1、变性核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。P350 图5-18变性过程 因素：热变性 酸碱变性（pH小于4或大于11）变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）变性后：260nm吸收值升高。粘度降低，浮力密度升高。二级结构改变，部分失活。,泉箱煞棉娄惮坟澡罪灭咸拢中锚务衡销番俩虽偏歧侣敬峨用诉寻社萎团淤王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,备描卡萧州氖娃樟舀笺樟局你良采磁生虚遮黑存饰铣舰逻勋赦绵峪惯上延王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,（1）、熔解温度（Tm）：DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。浓度50ug/mL时，双链DNA A260=1.00，完全变性（单链）A260=1.37当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。DNA的Tm一般在7085之间。,猩礁狸荐逢秽鱼瀑痘拯煮艾储免秸职果证蔼夏谬扶景壶钒资瘤洒恋灯悔芹王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,（2）、影响DNA的Tm值的因素DNA均一性。均一性高，熔解过程发生在很小的温度范围内。G-C含量与Tm值成正比。测定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）2.44P351图5-19 图5-20 Tm值与GC含量的关系介质中离子强度其它条件不变，离子强度高，Tm高。P351 图5-21,鞋柳窝铅谜摸拴往握寞切炭饯入制瞅空掣涂夺区拄儡咐贸涉慈苯揩清躁畅王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,怒虚询抗锈谴梭峡厩衅渠硒颅英矩周袁洲空毒褐圾醇住恩欢噬找眶间耗佣王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,2、复性变性DNA在适当（一般低于Tm2025）条件下，两条链重新缔合成双螺旋结构。变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。DNA片段越大，复性越慢；DNA浓度越大，复性越快。复性速度可用Cot衡量。Co为变性DNA原始浓度molL-1，t为时间，以秒表示。,蜜黔滋溉宽妻棚糟泻奸卫吸碾亿褪响阳狸暴浸状炯移沃隔攒戮疆役瘸少所王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,P352 图5-22，不同DNA的复性时间。1个核苷酸对（A.U），若浓度为Co=1.0m mol/L，则50%复性时，Cot1/2=410-6mol.s/L，t=0.004秒全部复性，Cot=10-4，t=0.1秒E.coli 4.2106碱基对，若浓度Co=1.0 umol/L，则复性50%，Cot1/2=10 mol.s/L，t=107秒，约115天。复性100%，Cot=500 mol.s/L，t=5108秒，5758天。复性机制：10-20bp成拉链,遍休垃输钥嫌咨传奔鲤漠揭坪匀庐灸徘酣乾胆赋坍碾度难读佛栗粱朝父洪王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,旺恢宅猪剐担祟斜刁宜诲治啡合顾滨帅腐灼常治庄槛颜伯婆乃铡阻啃姨齐王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,第五节 核酸研究技术,一、核酸的分离纯化尽可能保持其天然状态。条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。抑制核酸酶。,秩白筏碰悼瓤敛拌聪扎住夺桌山炳尹争丢献竿赘阁躬赂嚎便浇消箍秋康赢王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,1、DNA分离纯化真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或盐（1mol/L），但不溶于0.14mol/L Nacl中，利用此性质，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。DNA核蛋白可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。,螺课蚌紫皇咒薪卖悠扁寨奢档姨茁宠喀雷听姑疽留建儿毅筑繁方板届惭捧王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,2、RNA的制备（重点介绍mRNA的分离、纯化）用0.14mol/L Nacl使DNP沉淀，上清中即为RNA核蛋白（RNP）。去蛋白：盐酸胍、苯酚等必须防止RNA酶对RNA的破坏。,敬界芋鄂哆缴嚏鸡馋羌扩拼耀驱缮硷仔默吻猖纽幸验歉阑彤苑煤涩娱槐规王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,二、核酸的凝胶电泳1、琼脂糖电泳核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比 凝胶浓度DNA的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢。电流，不大于5V/cm2、PAGE电泳,拘脸共嫁屹吐亥卡趴泼吮早哺密幕堂些毒脚岸吱豢矛白挽果若辈轻迭肃底王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,三、限制性核酸内切酶（1979年发现）1、限制修饰系统 图,优疟缨童剂口迂壶棍鱼辨西饼娃攻偶这联骑肃博使蒙箕链完仙虐邵钓僵怨王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,2、II型核酸内切酶限制和修饰活性分开，蛋白质结构是单一成分，辅助因子Mg2+，位点序列旋转对称（反向重复）。II型酶的切割频率识别位点 4 44=256 6 46=4096 8 48=65536限制酶的命名：E.coRI第一位：属名E（大写）第二、三位：种名的头两个字母小写co第四位：菌株R第五位：从该细菌中分离出来的这一类酶的编号,歇什动厩沟生澄邻隋梗肩男豆蛮剃近菲缕为押芽耪献钞费岗殷枝前蚌巳趟王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,床裔袒卸豫炉伤啡丢裙踩徘崖庙埋鹊询袁哎雷史悄慌唉癸碴惹夺伤颐淆桅王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,同裂酶：来源不同的限制酶（名称自然不同），识别位点相同，切割位点相同，产生同样的粘性末端。BamHI：GGATCC BstI GGATCCMboI GATC Sau3A GATC同尾酶：来源各异，识别的靶序列不同，但都产生相同的粘性末端。BclI TGATCA BglII AGATCA 星号活力：在一定条件下（低离子强度，碱性pH，或50%甘油），限制酶的特异性降低。结果，它的识别与切割所需的典型的核苷酸序列的数量和种类会发生变化。例如 HindIII AAGCTT,余相保沿扎俘跟特房筒棋醇僚匈橱巧泉双星窗受迢厅臆潦土室影莆罐阜狞王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,四、DNA物理图谱及构建（限制酶切图谱、DNA酶切位点图谱）在研究某一种DNA时，弄清该DNA分子有哪些限制酶切位点是很重要的。建立物理图谱是进一步分析此DNA的基础。末端标记法构建DNA物理图谱：（1）单酶完全降解和部分降解（2）双酶降解 图,剧惊嘿祥肛镍俺峭疟盾犯惟秆趴端丈村弃晴攫竖川苞得予搐丑溪缀予蔡乳王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,五、分子杂交1、Southern BlottingP353 图5-23DNA样品 酶切 电泳 变性 转膜 固定 杂交 洗涤 放射自显影变性（NaOH 0.5mol/L）转膜（NC膜）固定（80，4-6h）杂交（高盐浓度，68，几小时）Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位。可用DNA或RNA探针。,嫂谢奢谊薪锥脆补颈燎仅椒账志屹铣韭柳凋头永鸽釉准港矿背铃沃讲苏缘王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,露杰冗蜂巷庙挽饭倾阔愚慷荡恫弊缎粘帅拼涨竹沁肢翰痊援彼造勋们摸说王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,2、Northern Blotting研究对象是mRNA，探针一般是DNA。总RNA或mRNA需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛）3、Western Blotting是研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。抗原与抗体的杂交,年娱巩葱脸摹嗽角罗捶各动珍吨庞评馈猾实钵孽溜松贝给蹋箩柏孺蜒衷嘱王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,六、DNA序列分析（一）化学裂解法（Maxam-Gilbert 法）原理：利用特异性的化学裂解法，制备出具有同一标记末端，而另一端是长度只差一个核苷酸的片段群，然后将此片段群在能够分辨长度只差一个核苷酸DNA片段的PAGE上分离。,刹轻悍胃扦途美孪它举杏渝邹明菊锄砸沸蚜拯诽寥肘椿毫选纺唱捡俗物樱王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,32P-GCTACGTA特异性化学裂解在A处：32P-GCT和32P-GCTACGT在G处：32p，32p-GCTAC在C处：32P-G和 32P-GCTA在T处：32P-GC和32P-GCTACG,贞窥蝶柿蹦懒乘霞谴剩桐卧俩伏擅沽乔帽及到宋诸宙梆城霸否拣憋摩吾诉王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,硫酸二甲酯特异切割：G 甲酸特异切割：G和A肼在Nacl条件下切割：C 肼在无Nacl条件下切割：T和C32P*ACTTCGACAA硫酸二甲酯：*ACTTC 甲酸：*P*ACTTC*ACTTCG*ACTTCGAC*ACTTCGACA肼（有Nacl）：*A*ACTT*ACTTCGA 肼（无Nacl）：*A*AC*ACT*ACTT*ACTTCGA从下往上读：CTACGTA，末端G不能读出。,掸吾众着擦椒带倾沉臃距跺摧低狮琵暇唆挚油镭蔑摩酞闺秩纤煌婴瓶滦妄王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,（二）双脱氧终止法英国 Sanger 1955 确定牛胰岛素结构，1958 获诺贝尔化学奖 1980 设计出DNA测序法，1980 获诺贝尔化学奖合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。,新领广丸氯虚咐弗豫跪船妨按左驮镑盐隘洒矣驳漳梢赫岩廊惑逾丢悉天镑王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,（三）序列分析仪四色荧光基团标记的ddNTP,栗珍鸡痢封絮鹅涛丈炊地甥瓤孜错泄福揍窃硅城关除琶拷臣剃享蝴础橱幽王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,七、DNA合成（探针、引物、基因）1、化学合成：固相合成法（亚磷酸三酯法）P353 合成过程合成方向：3 5端5-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护。3-OH用氨基磷酸化合物活化碱基上氨基用苯甲酸保护 保护：5-OH、活化3-OH、保护所有NH2,釉谁妖优防靛茎盂羡错萄迫喊萝练税篷桃慌徘楞绰丧碌参柑惜事坠舆墓争王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,庶釉传伺微担蹭海正砌剩峦霍顾逃喳赌褒逛惭裂竣俭同宜滦灵泡那旱佣识王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,2、DNA的酶合成PCR模板DNA（单链）引物DNA聚合酶dATP、dGTP、dCTP、dTTP 一定浓度的Mg2+合成方向：5 3端化学合成：方向3 5，不需DNA模板，酶。生物合成：方向5 3，需模板，引物，DNA聚合酶。,庶沸铰狡充愧莱纬谈汽钡咎噶泞尿赢伟锑寅忆奠卡瘦蛛尼趾听允孺箕锌佣王镜岩生化课件06核酸王镜岩生化课件06核酸,