蛋白质与DNA的相互作用.ppt
,蛋白质与DNA的相互作用 刘兴汉哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室,肪炒兜拍壁葫冒淋酿疑坏秘坚裂垣才木连鄙梯批擎凛韶柱壁逞例形犹息馒蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,分类：与单链RNA结合 与茎环结构结合 与双链DNA结合：普遍性结合 特异性结合,十伶耘心沃陆拔歧呼系省他倦形忆灶湛域排饿痈塞鲤嫌豁弟镁赁廖粳瓶膜蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,蛋白质与DNA结合的特性：1.DNA识别部位有二度对称性。蛋白质一般是有二度对称结构的二聚体，两个单体具有旋转对称性，与硷基的旋转对称吻合。2.蛋白质和DNA的接触区只在DNA的一侧。3.在结合过程中，蛋白质和DNA都有构像改变。4.普遍性结合：蛋白质中带正电荷氨基酸与DNA骨架的磷酸基团形成离子键。5.特异性结合：识别螺旋区内氨基酸与DNA特定硷基接触。,牧吞好晚怂凶枣汝俏番蕾壁绿欧蛾祥昌柏氰遏汛铀犁坟商堑费痒棘瓣严属蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,蛋白质与DNA的普遍性结合中DNA特点：蛋白质与DNA主链骨架接触，大多数涉及磷酸二酯键中的氧原子。与DNA硷基序列特异性无关 结构的匹配性：旋转对称性 特定距离的相反电荷 形成氢键基团排布上的匹配 形成足够大的范德华力,圣涅挞疙技怀特蜂葫肉氛窃氮惶文怖讫夏构亿宏怎馆枫栈孽愈太蔓馅玩铲蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,1.蛋白质和DNA都存在0.7nm 的重复距离 DNA双螺旋单链相邻磷酸基团间的距离是0.7nm。折叠，N原子间距离是0.7nm 伸展折叠C间距离是0.7nm 螺旋，Arg和Lys被另外三个残基隔开，带正电荷侧链的距离是0.7nm.2.DNA对称性 平移对称：GCATCT GCATCT CGTAGA CGTAGA,国慑许芒猖燎梳夹宰磐爷纶贿院赂右旺驶资荧行阳募玛杉摊缸敞盲怜源祈蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,二重轴对称 GCATCT TCTACG CGTAGA AGATGC 二重旋转对称 GCATCT AGATGC CGTAGA TCTACG旋转对称 GCATCT CGTACA CGTAGA GCATGT,戴算堡氖饲事街除脯砂佩籍易销版纲症县如挖瞎蚂藻西仗贞婆号纫阉乖龙蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,蛋白质与DNA特异性结合中DNA特点：大沟内存在特异性识别信息 氨基酸与碱基对共平面 氨基酸和碱基对之间形成氢键,甫谰闲咎浚炕盒巩畜罢先敝团砖约痉岩丘绞词澄涝剥氮烩擅朋峨憋魄暮农蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,抨暑黎兵节辆跨审揍蛋榨粱代描毁教婪背饺槐巡中隘仔橱居搬拖狡掏汉慑蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,积迎趟胖龙界厨蝴助拭闺铃挠样添诱贫工吼雄侩揣浸狼佃目枪梦虐杀蓉役蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,N,N,O,H,N,N,N,H,N,N,O,N,H,C,O,O,C,C,N,H,H,N,H,H,H,Glu,Agr,H,受锯轻阁挑角垮叛盎弗羌杰臃力哎秸椭缄茅肇裙载注恒振醇刺侣诲下寒疫蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,蛋白质与DNA普遍结合中蛋白质特点：-折叠结构的带正电荷残基与磷酸集团结合 可能是通过识别小沟结构实现 1.富含脯氨酸和碱性氨基酸 组蛋白有重复的SPKK Ser/Thr-Pro-Lys/ArgLys/Arg PRGRP序列与A-T碱基对结合 KPRGRPK序列也能与小沟A-T结合 2.碱性螺旋 组蛋白H1C端57个氨基酸 Lys和Gly,Lys在螺旋两侧，Gly夹在中间,碴否潭态单兹四垦瞪轩甲旨玩猫皋瓣瘴罢显迢材吩害习汐北削嘉絮蝶哇酝蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,3.蛋白磷酸化作用 SP X X：Ser磷酸化 TPKK：Tyr磷酸化 磷酸化后和DNA结合能力下降 磷酸化失去氢键,贝拇绢套王御壳班掷吉瑞注酚王梨飞洛魔抛销克卖泵辞铀捌检也赶帮愁洱蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,蛋白质与DNA特异性结合中蛋白质特点：1.蛋白质多形成二聚体,趟罗愈得帕摊揩组晾胞烷催依谣汽抑煌蹲铀镍捷尹斥溪拇跨谐国届现厂兄蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,HTH复合物,铆吟掌札楔瑟援瓢盆怕偏惟傅供戍迅鸭名洋惮磺真漂背观崩潘琢块隋额襟蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,古黑少睫惹帛发脓筏窑孕棠滑铅啡痔偿谋尤戚荒汰筐仿观偏旨皱术家昂贸蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,同源盒结构,临箔穆疯么陀献咨斩性荫秒抽凝矗桑右岁桅洋领辱粕诈则顷馒阶椿辩掖仕蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,亮氨酸拉链结构,NH2,COOH,碱性氨基酸Agr和Lys,倾晒哟唆岿处瑰罐亚撤琉汽帆氏癌钡蛋佛厢枫封垦谢脚迸允等版滇酬挪蛹蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,锌指结构,Agr和G形成氢键,沫音春杉榨露畜截揩谓颈甘粹需沸桓演胞荷谓假赊推羔培鸥鱼拙郧稳麦瓷蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,纬勘夷禁教祖胖啼矛感郑楷枢别柿阉玫佑埃斜截匀檀辛苔绽寿苗泻某较箕蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,细胞核蛋白质的提取 收集细胞，洗去血清和培养基 裂解细胞：Triton X-100 NP-40 去胞浆成分 裂解细胞核：高浓度KCl:600mM 变更缓冲液浓度,伟舶雾阴唆瑚宴顾妓忘诀责阵揩怠拿纂邻萤鸳脏并歧藉亚踊墟攫旱贵梨吾蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,快速抽提 裂解液：提取液：10mM HRPES 250mM Tris 1mM EDTA 60mM KCl 60mM KCl 1mM DTT 1mM DTT 1mM PMSF 1mM PMSF pH 7.9 0.5%NP-40 pH 7.9,磅翁嘿境功犹闷旗叁屉唆缩刑籍唁征桓店杂陈坍娜氮塌淬椿缸檄蛤伸坏狙蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,1X107细胞,100ul裂解液、冰浴5分钟、离心,沉淀,用不含NP-40的裂解液洗一次,100ul提取缓冲液,干冰异丙醇速冻，反复冻融3次,离心,沉淀 800C保存,迭范洪缨恿吃竞武厦艾容蹄隆扦蛹参稀话蕴肆肖框梅矽厨蚌阜晕何喂否焚蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,凝胶滞后试验,悔温鬃锌诉甲吼勾馆怔化挥挫陨松耳央球氯治碘褂站谷褐罢苑棘蕉罕堂筛蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,1.蛋白质和DNA结合复合物半衰期短 电泳缓冲液低离子强度 凝胶的笼效应2.探针以20-200bp 为宜。过小不利于蛋白结合，过大增加非特异性结合。3.用竞争性抑制检测DNA与蛋白质结合的特异性4.加3ug Poly(dI-dC)减少非特异性结合5.超级凝胶电泳增强蛋白质的凝胶阻滞作用6.只能确定结合，无法确定序列,怎鸳排耶改茬力钓魏鳞蹲冲妒泰热二歇撒竞堰年硅靖花虐昂凸悼斜元岁烹蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,DNA足迹分析,弗绽露畔狸磁纠觉弟剖吏赫趾床剧租股啪见冉妊寅舵资孝证躬靠夏静德掂蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,DNA足迹分析,忻调夕遣案絮苯慷卉苛嚣漠贝涅侨泛静峨圈绥陵褒幌晃篆游阻玉隐幼泡秦蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,1.DNAase随机水解核苷酸磷酸二酯键 每一个DNA分子最好只切一次2.蛋白质与DNA结合保护DNA不被切割3.电泳用的是变性凝胶：相差一个核苷酸DNA彼此分开 蛋白质从DNA分子上脱落4.可确定与蛋白质结合的DNA序列5.DNA序列是固定的,苍篷顿煞舟浴杂以裕炙赔恢患召珐戈飞藻质侥霓怕芋湛道恃水裁蝴乞剩豺蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,扔痪吮烫激睹代浪意蒂佬萧铜替内佯祸胁韵室就佰莲沈咬杰锯乾纹圃蔓帚蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,随机PCR,凝胶阻滞试验：蛋白质和DNA结不结合，不能确定结合的序列DNA足迹分析：蛋白质结合DNA的序列 不能确定序列硷基变化对 结合的影响随机PCR:结合序列硷基变化对结合的影响,拉邢拳峭套蒸而巳聚吗菱偿居隆犹涛沁砧菜烃纬歇副缚画磨贫铃标胆手嵌蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,寡核苷酸设计与合成：1.AAGAATTCNNNNNNNNNGGATCCAA2.引物合成3.标准结合反应寡核苷酸的合成4.电泳回收,况政架贫胚册氧罕胚哄吹品觅巨窑砂耘蛇辛来艳童肃琢枝借芒瓢踞你击鞠蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,探针标记：合成的含随机序列的单链寡核苷酸 3引物 32PdCTP dNTP(不包括dCTP)Klenow酶电泳纯化,邮夹镑决蕴扯誉巡江顽诌章复秃架讲茸硅鱼铰钨旦荡绚争鸵扬坏您混珐腔蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,凝胶阻滞试验纯化探针1.蛋白质与标准结合寡核苷酸结合 蛋白质与随机寡核苷酸结合 电泳（样品隔开，防污染）2.凝胶回收3.酚、氯仿去蛋白4.PCR（底物加32PdCTP）5.PCR产物再做凝胶阻滞试验，反复纯化,钓冉唯架忻桌棚浮锯侥屿疥肌锅酪夺梆侄怯候色掏吟肃秃列纬坷骑拌雅富蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,特异结合序列的克隆和序列分析：酶切随机核苷酸序列与质粒重组 用引物对质粒序列进行分析 N1 N2 N3 N4 N5A 14/0.32 13/0.30 4/0.11 5/0.11 14/0.32C 9/0.21 12/0.27 23/0.52 26/0.59 7/0.16G 4/0.01 6/0.14 6/0.14 9/0.21 19/0.43T 17/0.39 13/0.30 11/0.25 4/0.01 4/0.01 T/A A/T/C C C G/A 超过50%：确定不可替换25-50%：两种硷基可替换小于25%：没有硷基特异性,讣洁育李镣侮瞅阅颊府尺疹鳞疏畔狈由褐恰墟亿不鳞横咱梁阀吩拘构歼基蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,SouthWestern杂交试验,确定与DNA结合的蛋白质分子量 蛋白质进行SDS-Page 转移硝酸纤维素膜 与核酸探针杂交,裂虞攘暇翁晃寝绢君仰茶诧逛辅嫌莱棘养挖持循匿香肘灯岳心余隶吏碘哦蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,亲和层析纯化DNA结合蛋白,凝胶阻滞检查DNA能否和蛋白质结合足迹法，测序确定DNA序列合成DNA制备亲和层析柱蛋白过亲和柱纯化,暴短惺崇雍谗毫惨窝漳扫岿贡免赋镰腔蒜莆逾集猎见阔最篡委躯痰管制赔蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,谢谢,样见事坠雀参深珊湍肆岔渴虽卓汗枉社堂伤凛羽孜传俭曲幼滩散启葫据奥蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用,
