免疫细胞的分离技术.ppt

免疫细胞的分离,2023/6/16,1,免疫细胞的分离,免疫细胞,1、概念 直接参与免疫应答及与免疫应答相关的所有细胞。2、分类 单核吞噬细胞系统：单核细胞/巨噬细胞 树突状细胞（DCs)淋巴细胞系统：T 淋巴细胞（Th/Tc)B 淋巴细胞 NK 细胞 粒细胞系统:中性粒细胞 噬酸性粒细胞 噬碱性粒细胞,2023/6/16,2,免疫细胞的分离,免疫细胞的分离,人外周血单个核细胞的分离淋巴细胞的分离免疫细胞亚群的分离,2023/6/16,3,免疫细胞的分离,细胞分离原理,细胞的大小和比重细胞表面标志细胞黏附于各种物质表面的特性,2023/6/16,4,免疫细胞的分离,一、人外周血单个核细胞的分离 Ficoll分层离心法,人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC):Monocyte、Lymphocyte。原理：血液中各细胞成分的比重不同，经离心沉淀，即可在分层液与血浆之间获得比较纯的单个核细胞，其中淋巴细胞占90%以上。,2023/6/16,5,免疫细胞的分离,不同细胞密度不同 红细胞和多形核白细胞 1.092 单个核细胞 1.070 分层液 1.077,2023/6/16,6,免疫细胞的分离,一、人外周血单个核细胞的分离 Ficoll分层离心法Ficoll分层液：蔗糖聚合物+泛影葡胺，密度1.077+0.001g/L。,2023/6/16,7,免疫细胞的分离,二、淋巴细胞的分离,尼龙棉柱法E花环分离法补体细胞毒法免疫荧光法,2023/6/16,8,免疫细胞的分离,二、淋巴细胞的分离 尼龙棉柱法,原理：B细胞和单核细胞具有易黏附的特性，将淋巴细胞悬液加至尼龙纤维柱上，37 作用12h后，洗脱的为非黏附性的T细胞。,2023/6/16,9,免疫细胞的分离,PBMC,尼龙纤维棉柱,B细胞单核细胞,T细胞,二、淋巴细胞的分离 E花环分离法（纯化T细胞）,原理成熟T细胞表面有绵羊红细胞受体（E受体，CD2分子），可和SRBC形成E花环，B细胞则无。E花环比重大，沉淀，经分离液分离来。E花环周围的绵羊RBC可 用低渗法除去。,三、免疫细胞亚群的分离,免疫磁珠分离法流式细胞术,2023/6/16,11,免疫细胞的分离,三、免疫细胞亚群的分离 免疫磁珠分离法,原理：将抗体交联于磁珠表面形成免疫磁珠（Immunomagnetic bead，IMB），免疫磁珠直接或者间接偶联在抗体上，从而与细胞相连，在高强度、梯度磁场中达到细胞磁性分离的目的。,2023/6/16,12,免疫细胞的分离,三、免疫细胞亚群的分离 免疫磁珠分离法,1.直接法：抗细胞表面分子抗体+磁性微球 免疫磁珠+细胞悬液 与免疫磁珠结合的细胞2.间接法：第二抗体+磁性微粒 第一抗体+细胞 特定细胞,免疫磁珠法分选装置,三、免疫细胞亚群的分离 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）,FCM将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收集。原理：细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区。当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声震动液流，使液流段裂成一连串的均匀小滴，每个小滴内最多含一个细胞，细胞经激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞类型。,2023/6/16,17,免疫细胞的分离,流式细胞仪工作原理,2023/6/16,18,免疫细胞的分离,流式细胞仪,2023/6/16,19,免疫细胞的分离,免疫细胞的分离,人外周血单个核细胞的分离Ficoll分层离 心法淋巴细胞的分离尼龙棉柱法、E花环分离法、补体细胞毒法免疫荧光法免疫细胞亚群的分离免疫磁珠分离法、流式细胞术,谢谢！,2023/6/16,21,免疫细胞的分离,