中药制剂分析-第四章-卫生学检查医学.ppt

第四章 中药制剂的卫生学检查,第一节 概述第二节 微生物限度检查法第三节 活螨检查法第四节 热原检查法第五节 无菌检查法第六节 细菌内毒素检查法,第一节 概述,一、细菌二、真菌,一、细菌,（一）细菌1.细菌的大小与基本形态 细菌个体微小，通常以微米(m)为计量单位。需用显微镜放大几百倍或上千倍才能看到。各种细菌大小不一，同种细菌也因菌龄和环境不同而有差异。细菌的种类不同，形态也多种多样，其基本形态有三类：即球菌、杆菌和螺形菌。2.细菌的结构 各种细菌共有的结构包括细胞壁、细胞膜、细胞质、核质等。细胞壁是细菌的最外层结构，与细胞膜紧密相连。其主要功能是维持细菌的形态，保护细菌，与细胞膜共同完成菌体内外的物质交换。革兰氏阳性菌细胞壁较厚，其主要成分为肽聚糖、磷壁酸和少量表面蛋白质；革兰氏阴性菌细胞壁较薄，肽聚糖含量少，肽聚糖外层还有由脂蛋白和脂多糖组成的多层结构。细胞膜位于细胞壁内侧，是半渗透性生物膜，主要成分是蛋白质、磷脂和少量的糖。膜上有许多特异性的酶，可高度选择性地吸收营养物质，排泄废物，维持渗透压平衡。细胞质为无色透明的胶状物质，基本成分为水、无机盐、核酸、蛋白质和脂类等。细胞质内常含有核蛋白体、质粒和胞浆颗粒等多种内含物。细菌的细胞核没有核膜和核仁，但在细胞浆中有固定的核区，称核质。核质是由裸露的双股脱氧核糖核酸链组成的，主要功能是控制细菌的遗传和变异性状。某些细菌具有荚膜、芽胞、鞭毛和菌毛。其中芽胞对热、干燥、化学药品与辐射均有较强的抵抗力。因此，在消毒灭菌时应以杀死芽胞作为彻底灭菌的指标。,一、细菌,3.细菌的形态学检查观察细菌的形态和结构，通常有不染色法和染色法两种。前者适用于观察细菌的动力、形态和大小，常用的方法有压滴法、悬滴法、暗视野荧光法等；后者适用于观察细菌的形态、大小、排列和染色特性，尚可鉴别细菌的结构。由于细菌的等电点较低，约在pH25之间，故在中性、碱性和弱酸性溶液中，带负电荷，易与带正电荷的碱性染料结合而着色。染色标本制作的基本步骤如下：(1)涂片：于洁净载玻片上加一滴生理盐水，再用取菌环挑取菌落少许，均匀涂布于载玻片上。(2)干燥：在空气中自然干燥。必要时，可将标本面向上，在火焰上烘干，但应注意，切勿紧靠火焰，以免标本烤焦。(3)固定：固定的目的是杀死细菌，使细菌粘附在玻片上，增强染料对细菌的通透性，便于染料着色。方法是将已干燥的玻片来回通过火焰三次，以热而不烫为宜。,一、细菌,(4)染色：根据检验目的的不同，选用不同的染色方法进行染色。单染法：只用一种染料染色，如常用的美蓝染色。单染法只能将各种细菌染成一种颜色，可观察细菌的大小与排列，不能显示细菌的结构与染色特性，对鉴别细菌意义不大。复染法：用两种以上的染料先后进行染色，可将不同的细菌染成不同的颜色，既能观察细菌的大小、形态与排列，又能鉴别不同细菌的染色特性，对鉴别细菌的种类有重要意义。常用的革兰氏染色步骤如下：将结晶紫染液滴加在已固定的细菌涂片上，染1min后水洗；滴加卢戈氏碘液，1min后水洗；滴加乙醇，摇动玻片至无明显紫色脱落为止，水洗；滴加复染液(如沙黄染液)复染30s1min，水洗，自然干燥或用滤纸吸干后镜检。革兰氏阳性(G+)菌染成紫色；革兰氏阴性(G-)菌染成红色。4.细菌生长繁殖的条件 细菌和其他生物一样，必须不断地从外界环境吸收营养物质，用以合成自身的细胞成分和获得能量，同时排泄废物，进行新陈代谢，以维持自身的生长和繁殖。细菌生长繁殖的条件有：充足的营养：细菌生长繁殖所需的营养物质有水、无机盐、碳源、氮源和生长因子。生长因子是许多细菌生长过程中必需、但不能自身合成的因子，如某些特殊氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶等。适宜的酸碱度：不同种类的细菌，生长时的最适酸碱度有差异。多数病原菌的最适pH7.27.6。但有些细菌，如霍乱弧菌在pH8.49.2生长良好；乳酸杆菌的最适pH为5.0左右。适宜的温度：不同种类的细菌，对温度的适应性不同，一般在1540条件下均能生长。大多数病原菌生长的最适温度为37。必要的气体环境：细菌生长繁殖所需的气体主要是氧气和二氧化碳。按对氧气的要求不同，可将细菌分为三类：只能在有氧条件下生长的细菌称为专性需氧菌，如霍乱弧菌；只能在无氧环境下才能生长的细菌称为专性厌氧菌，如破伤风杆菌；在有氧和无氧条件下均能生长的细菌称为兼性厌氧菌，多数病原菌属此类型，如葡萄球菌。,一、细菌,5.细菌的代谢产物 细菌在代谢过程中产生多种代谢产物，其中有些产物可供鉴别细菌用，有些与细菌的致病性有关，有些可用于防治疾病。(1)合成代谢产物毒素及侵袭性酶：细菌能产生对机体有害的毒素。内毒素由G-菌产生；外毒素大多由G+菌产生，但少数G-菌也能产生外毒素。某些细菌还能产生具有侵袭性的酶，损伤机体组织，如金黄色葡萄球菌产生的血浆凝固酶等。热原质：许多G-杆菌及少数G+杆菌，能产生一种耐热物质，注入人或动物体内可致发热反应，故称热原质。它耐高温，一般的高压蒸气灭菌法不易使之破坏。可用蒸馏、吸附、滤过等方法除去液体中大部分热原质。生物制品、静脉滴注用注射剂应不含有热原质。色素：许多细菌在一定条件下能产生各种色素，如金黄色葡萄球菌产生的金黄色脂溶性色素和铜绿假单胞菌产生的绿色水溶性色素等，这些特征有助于鉴别细菌。抗生素：是指某些微生物在代谢过程中产生的，能选择性抑制和杀死它种生物细胞的代谢产物。抗生素主要由放线菌和真菌产生。细菌素：某些细菌能产生一类具有抗菌作用的蛋白质，其抗菌范围狭窄，仅对近缘细菌有抗菌作用。主要用于细菌的分型和流行病学调查。维生素：人体肠道内的某些细菌如大肠杆菌，能合成维生素B和维生素K，可供人体利用。,一、细菌,(2)分解代谢产物：各种细菌具有不同的酶，对物质的分解利用能力和代谢产物有所不同。利用这些生化特性来鉴别细菌，统称为细菌的生化反应。糖代谢产物：糖的分解产物主要是酸类(甲酸、醋酸和乳酸)、醇类(乙醇、丁醇、乙酰甲基甲醇等)、酮类和气体(二氧化碳、氢气)等。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖，产酸并产气；而伤寒杆菌则不能分解乳糖，分解葡萄糖只产酸不产气，据此可用于细菌的鉴别。蛋白质代谢产物：不同细菌对蛋白质和氨基酸的分解能力不同，如大肠杆菌能分解色氨酸产生靛基质；沙门氏菌能分解胱氨酸等含硫氨基酸产生硫化氢气体，据此可帮助鉴别细菌。,一、细菌,6.细菌的生理学检验(1)培养基的种类：培养基是根据细菌的生长需要，人工配制的营养环境。按其性状分为固体、半固体和液体培养基。按其用途可分为以下几类：基础培养基：含有细菌需要的最基本营养成分，可供大多数细菌生长。如普通肉汤培养基、普通琼脂培养基。营养培养基：在基础培养基中加入葡萄糖、血液、血清和某些生长因子等，可供营养要求较高的细菌生长，如血平板、血清肉汤等。选择培养基：利用不同种类细菌对各种化学物质的敏感性不同，制成有利于选择欲分离细菌而抑制其他细菌生长的培养基。例如加入煌绿、胆盐等的沙门氏、志贺氏菌属琼脂培养基(SS培养基)，能抑制G+菌和大肠杆菌，有利于G-肠道致病菌生长。,一、细菌,鉴别培养基：在培养基中加入某些特定成分(如糖、醇类的指示剂等)，用于观察细菌的各种生化反应。厌氧培养基：专性厌氧菌须在无氧条件下才生长，因此需制备与氧隔绝或在细菌生长时达到无氧环境的培养基，如疱肉培养基。(2)常用培养基的制备程序：制备一般培养基的主要程序可分为配料、溶化、调整pH值、澄清过滤、分装、灭菌、检定、保存等步骤。(3)细菌的接种方法：接种细菌采用接种针(环)来沾取细菌标本，进行接种。接种环与接种针以白金丝最为理想，也可用镍铬丝代替，二者均能耐高温且传热快，经火焰灭菌后冷却快。,一、细菌,平板曲线划线法：先将标本涂于平板表面的一角，然后用接种环自此开始，向左右两侧划线并逐渐向下移动，连续划成若干条分散的平行线。斜面接种法：主要用于鉴定或保存菌种。以左手持培养基，右手持接种环(针)，通过火焰灭菌后冷却挑取菌落；左手立即换取斜面培养基管，以右手小指和无名指拔取棉塞，夹持于手指间。立即将管口通过火焰灭菌后将接种环伸入斜面管内，先从斜面底部到顶端拖一条接种线，再自下而上划曲线接种。倾注平板法：常用于液体标本的细菌计数。取原标本或经适当稀释的标本1ml，置于直径9cm无菌平皿内，倾注已熔化并冷却至50左右的培养基约1315ml，立即混匀，待凝固后倒置，于37培养1824h，作菌落计数。穿刺接种法：多用于观察细菌动力及某些生化反应。方法与斜面接种类似。以接种针挑取菌落少许，插入半固体培养基的中央，穿刺至培养基底部，然后沿原穿刺线退出接种针。液体接种法：以接种环挑取菌落，在试管内壁与液面交界处轻轻研磨，使细菌混匀在液体培养基中。,一、细菌,(4)细菌的培养方法：细菌的培养方法有以下三种：一般培养法：又称需氧培养法，在3037温箱中培养普通需氧或兼性厌氧菌。二氧化碳培养法：将某些在有二氧化碳环境下才能生长的细菌(如脑膜炎球菌)，放在二氧化碳环境中进行培养的方法。厌氧培养法：厌氧菌由于对氧敏感，在其分离及鉴定过程中均需在无氧的环境下培养，否则就不能生长甚至死亡。(5)细菌在培养基中的生长现象：将细菌接种到培养基中，经37培养1824h，即可出现肉眼可见的生长现象。在液体培养基中，可出现均匀混浊、沉淀及形成菌膜等。若将细菌接种于固体培养基的表面，经培养后，可形成单一的肉眼可见的细菌集团，称为菌落。菌落的大小、形状、色泽等因细菌种类的不同而异，有助于细菌的鉴别(见图3-10)。当细菌在固体培养基表面密集生长时，多个菌落融合在一起，称为菌苔。细菌在半固体培养基中生长时，无鞭毛的细菌，沿穿刺线生长；有鞭毛的细菌则沿穿刺线向周围扩散呈云雾状混浊生长，借此可判断细菌有无动力。图3-10 细菌的菌落形态,二、真菌,真菌为真核生物，无根、茎、叶的分化，也无叶绿体，以腐生或寄生方式生长，进行有性或无性繁殖。真菌的结构比细菌复杂，有细胞壁、细胞质和细胞核。细胞核具有核膜、核质和核仁。真菌的基本形态有单细胞和多细胞两种，单细胞真菌呈圆形或椭圆形，常见的有酵母菌或类酵母菌；多细胞真菌由菌丝和孢子组成，菌丝分枝交织形成菌丝体，孢子是真菌的繁殖结构。真菌种类繁多，形态大小不一。革兰氏染色为阳性。大多数真菌不需复杂的营养就能生长，适宜生长温度为2228，生长时需要较高的湿度和氧气。虽繁殖力较强，但生长速度较慢。一般需数日至十几日才能长出菌落。真菌的菌落有单细胞真菌的酵母型菌落、酵母样菌落，多细胞真菌的丝状菌落三种。,二、真菌,1.酵母型菌落 类似一般细菌菌落，菌落光滑、湿润、柔软、致密，显微镜检查可见圆形或椭圆形芽生细胞，酵母菌及隐球菌多为此种菌落。2.酵母样菌落 外观性状同酵母型菌落。但在菌落表面除有芽生细胞外，还有假菌丝伸入培养基中，如白色念珠菌。3.丝状菌落 菌落疏松，呈棉絮状、绒毛状或粉末状，菌落正面和背面可显示各种不同的颜色，如白色、黄色、红色、紫色或灰色等，常作为鉴定菌种的参考。毛霉菌和皮肤丝状菌等多细胞真菌产生此型菌落。霉菌、酵母菌与细菌在营养琼脂及玫瑰红钠琼脂平板上的菌落形态区别，见表36。,二、真菌,第二节 微生物限度检查法,一、染菌限度检验原则二、常用稀释液、试液、指示液及培养基三、细菌、霉菌及酵母菌计数四、控制菌检查五、微生物限度标准,一、染菌限度检验原则,染菌限度检验是以规定的方法与步骤，测定药品中染菌的程度。必须遵循下述基本准则：1.供试品抽样、保存及检验量供试品一般按批号随机抽样。每批取检验用量的3倍量。每批抽样应至少含有2个以上最小包装单位。抽样时，凡发现有异常的样品，应先抽取有疑问的样品；但机械损伤、明显破裂的包装，不能抽作样品。肉眼可见长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，无需再抽样检查，可直接判为不合格品。供试品在检验前不得任意开启，以防再污染。所需样品必须保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防引起原染菌状况发生变化。各种药品检验取样量都有明确规定。所有剂型的检验量必须取自2个以上的包装单位，大蜜丸、膜剂应取4丸(片)以上样品；固体和半固体制剂检验量为10g；液体制剂检验量为10ml；中药膜剂检验量为3050cm2。贵重的或微量包装的供试品检验量可酌减，但口服用药不得低于3g，外用药不得低于5g，液体制剂采用原液直接测定者不得低于6ml，采用供试液稀释者，不得低于3ml。,一、染菌限度检验原则,2.检验条件(1)培养温度：除另有规定外，细菌培养温度为3037，霉菌、酵母菌培养温度为2528，控制菌培养温度为361。取供试液检验时，应注意摇匀，以便均匀取液。检品制成供试液后应在12h内进行检验。(2)阴性对照：在药品卫生检查之前应先做阴性对照试验，以确定无菌技术的可靠性。方法是：取供试液用的稀释剂，分别按照细菌数、霉菌数及各控制菌检验方法培养，均无菌生长，说明无菌技术可靠；否则，说明无菌技术不过关，应查明原因。(3)阳性对照：在规定控制菌检查中，应做阳性对照试验，目的是检查供试品对控制菌生长有无干扰，培养条件是否适宜。方法是：将供试液分为两组，一组中加入一定数量标准对照菌株，另一组不加对照菌株，两组平行培养，观察培养结果。如果已知阳性菌未检出，供试品的阴性结果应认为无效，而阳性结果需做具体分析或实验再作结论。,一、染菌限度检验原则,国家规定的各种控制菌的标准菌株是：大肠杆菌CMCC(B)44102、沙门氏菌CMCC(B)50094、铜绿假单胞菌CMCC(B)10104 及金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003。对照用菌液的制备方法是：取相应菌株的新鲜培养物1取菌环，接种至营养肉汤培养基内，培养1820h后，稀释至1:106。对照菌的加入量为50100个。,一、染菌限度检验原则,3.供试液的制备(1)液体中药制剂：取供试品10ml，加入90ml稀释剂中，混匀，作为1:10供试液。油剂可加入适量聚山梨酯-80；气雾剂以适量方法使抛射剂导出后，加入适量稀释剂，混匀，吸取相当10g或10ml供试品，再稀释成100ml做供试液；含蜂王浆或蜂蜜的合剂及滴眼剂可以原液为供试液。(2)固体或半固体中药制剂：取供试品10g，置0.9无菌生理盐水100ml中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀后，作为供试液。在制备过程中，必要时可加适量聚山梨酯-80，并适当加温，但不应超过45。非水溶性中药制剂：取供试品5g(5ml)，加入含溶化的无菌司盘-80 5g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯-80 10g混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入450.9无菌氯化钠溶液约80ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为供试液(1:20)。不溶于水的膜剂：取3050cm2，剪碎，加稀释剂100ml(必要时可增加稀释剂)，浸泡，振摇，即得。肠溶胶囊(片)：取供试品10g，置含无菌磷酸盐缓冲液(pH6.8)100ml的锥形瓶内，于451水浴中，振摇，溶解，即得。,一、染菌限度检验原则,(3)含抑菌成分的中药制剂：供试品如干扰控制菌检验，按以下方法处理后，依法检查。稀释法：将供试液接种入较多的培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度。离心沉淀集菌法：取规定量的供试液高速(3000r/min)离心沉淀30min，弃去上清液，留底部集菌液约2ml，再稀释成原规定量的供试液。如有不溶性药渣，可先低速(500r/min)离心沉淀5min，取全部上清液，再行集菌处理。薄膜过滤法：取规定量的供试液，置稀释剂100ml中，摇匀，以无菌操作加入装有直径约50mm、孔径不大于0.45m0.02m微孔滤膜的过滤器内，减压抽干后，用稀释剂冲洗滤膜三次，每次50100ml，取出滤膜备检。,一、染菌限度检验原则,中和法：凡含有硫胺、汞、砷类或防腐剂的中药制剂，可用相应的试剂中和毒性后制成供试液。4.检验报告单位(1)细菌、霉菌、酵母菌数：个(菌落数)/g(ml)。(2)膜剂：个/cm2或“未检出”。(3)控制菌：以1g、1ml或10cm2为单位，报告“检出”或“未检出”。,二、常用稀释液、试液、指示液及培养基,三、细菌、霉菌及酵母菌计数,细菌、霉菌、酵母菌计数是检测规定单位的非灭菌药品制剂中污染活菌的数量，是判定药品受到微生物污染程度的重要指标，同时，也是对生产单位的药品原辅料、设备器具、工艺流程、生产环境和操作人员卫生状况进行卫生学评价的综合依据之一。细菌、霉菌与酵母菌计数均采用平板菌落计数法。由于检验中细菌计数用营养琼脂在3037需氧培养，霉菌与酵母菌计数用玫瑰红钠琼脂或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂在2528需氧培养，厌氧菌和嗜冷菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的菌也受到限制，因而测定数只包括一群能在上述培养基上生长的嗜中温、需氧和兼性厌氧菌的菌落总数。因此，测定时，必须严格按规定的条件操作，以免产生实验误差。,三、细菌、霉菌及酵母菌计数,1.培养基与试剂营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)、0.9无菌氯化钠或pH7.2的无菌磷酸盐缓冲液。2.检验程序供试品10g(ml)1:10供试液（平皿23个）1:102供试液（平皿23个）1:103供试液营养肉汤（平皿23个）（培养1824h）3035倾注培养48h2h或2528倾注培养72h2h菌落计数报告。3.操作步骤(1)供试液制备：各类制剂按前述方法制备1:10供试液。(2)供试液的稀释与注皿：用1ml无菌吸管，吸取混匀的供试液1ml，沿管壁注入装有9ml无菌稀释剂的试管内，混成1:100的稀释液。按同法依次10倍递增稀释成1:1000、1:10000的稀释液备用。每一次稀释更换一支1ml吸管。根据对供试品污染程度的估计，选择23个适宜稀释度，用一支1ml无菌吸管，按高倍稀释至低倍稀释的顺序分别取各稀释度的液体1ml，注入平皿内。每个稀释度应作23个平皿。,三、细菌、霉菌及酵母菌计数,(3)倾注培养基：将预先配制好的培养基(细菌计数用营养琼脂，霉菌、酵母菌计数一般用玫瑰红钠琼脂，含蜂蜜、蜂王浆液体制剂另加用YPD琼脂)熔化，冷却至45时，倾注上述各平皿约15ml，旋摇平皿使混合均匀。置水平台上待冷凝固。(4)培养：细菌计数平板倒置于3037培养箱中培养48h；霉菌、酵母菌计数平板于2528培养箱中培养72h。,三、细菌、霉菌及酵母菌计数,4.菌落计数(1)一般将平板置菌落计数器上或以肉眼仔细观察点计。不要漏计琼脂层内和平板边缘生长的菌落。注意细菌菌落和酵母菌菌落以及它们与药渣、培养基的沉淀物、气泡等的区别。必要时用放大镜检查或挑取可疑物涂片镜检。(2)若平板上有2个或2个以上的菌落重迭，肉眼可辨别时仍以2个或2个以上菌落计数。有片状菌落或花斑样菌落蔓延生长及平板已被污染，不宜作为计数用。(3)记录各稀释级平板的菌落数，求取各稀释级2或3个平板菌落的均数。当菌落数在15以上，同稀释级2个平板菌落数又相差1倍以上时，该稀释级不宜采用；当2个平板菌落数均在15以下(含15)时，每个平板菌落数的差值允许范围为04，17，29，310，412，514，615。超出以上范围即视为操作误差，不得作为计数依据。(4)供试品按营养琼脂平板点计细菌菌落数；固体供试品按玫瑰红钠琼脂平板点计霉菌数，一般液体供试品按玫瑰红钠琼脂平板点计霉菌及酵母菌总数；含蜂蜜及蜂王浆的合剂按玫瑰红钠琼脂平板点计霉菌菌落数，按YPD琼脂平板点计酵母菌菌落数，二者合并为霉菌及酵母菌数。,三、细菌、霉菌及酵母菌计数,5.菌数报告原则细菌宜选取平均菌落数在30300之间的稀释级，霉菌、酵母菌宜选取平均菌落数在30100之间的稀释级作为菌数的依据。细菌总数报告原则如下：(1)若有一个稀释级的平均菌落数在30300时，将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告(见表4-2例1)。(2)若有两个稀释级，其生长菌落数均在30300，先计算两稀释级菌落数的比值，比值若其比值2，应报告其平均数；若比值2，则以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告(见表),三、细菌、霉菌及酵母菌计数,(3)若有3个稀释级的平均菌落数均在30300之间时，采用后2个稀释级计算级间比值报告(见表4-2例4及例5)。(4)若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应该按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告(见表4-2例6)。(5)若所有稀释度的平均菌落数均不在30300间，以最接近30或300的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告(见表4-2例7)。(6)若所有稀释度的平均菌落数均少于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告。但若用原液为供试液，当1:10稀释级平均菌落数等于或大于原液时，应以培养基稀释法测定，按测定结果报告(见表4-2例8及例9)。培养基稀释法：吸取供试液(原液或1:10供试液)1ml，注入5个平皿内(每皿各0.2ml)共作3份，共15个平皿。每皿注熔化并冷至45左右的琼脂培养基约,三、细菌、霉菌及酵母菌计数,15ml，混匀，冷凝后按规定培养温度与时限培养，计数。每1ml注入的5个平板的菌落数之和，即为1ml的菌落数，共得3组数据，取其平均值乘以稀释倍数报告。(7)若各稀释级的平板均无菌落生长或测定数在10个以下时，报告菌数为10个/g(ml)霉菌(酵母菌)总数报告原则与细菌总数报告原则基本相同。如供试品原液平板均未生长霉菌及酵母菌，报告每毫升未检出霉菌及酵母菌。6.菌落数的报告(1)菌落数在100以内时，按实有数据报告。(2)菌落数大于100时，采用两位有效数字报告，第三位按数字修约规则处理。为简便计算，也可用10的指数报告。,三、细菌、霉菌及酵母菌计数,7.复试供试品细菌数、霉菌及酵母菌数中任何一项一次检验不合格，应重新取2 倍包装量供试品，依法作单项复试两份，以三次检验结果的均值报告。8.注意事项一般情况下，以营养琼脂平板计数细菌数，玫瑰红钠琼脂平板计数霉菌、酵母菌数。但如果营养琼脂平板生长了霉菌、酵母菌，且多于玫瑰红钠琼脂平板的霉菌和酵母菌菌落数，则以营养琼脂平板的霉菌、酵母菌数报告；反之，如果玫瑰红钠琼脂平板生长了细菌，且多于营养琼脂平板的细菌菌落数，则以玫瑰红钠琼脂平板的细菌数报告。,三、细菌、霉菌及酵母菌计数,9.检验结论 按下列方式书写检验结论:本品按中国药典2000年版微生物限度检查法标准检验，结果符合（或不符合）规定。（三）大肠杆菌检查法大肠杆菌为肠杆菌科埃希氏菌属细菌，主要寄生于人和动物的肠道内，随粪便排出体外。药品中检出大肠杆菌，证明已被粪便污染，即可能污染肠道病原体。因此，大肠杆菌被列为粪便污染指示菌，是口服药品的控制菌之一。1.培养基与试剂普通肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、乳糖发酵管或5%乳糖发酵管、蛋白胨水培养基、磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基、枸橼酸盐培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、麦康凯培养基(MacC)、三糖铁琼脂（TSI）、欧-波氏试剂、甲基红指示剂、V-P试剂、革兰氏染色液。,三、细菌、霉菌及酵母菌计数,2.检验程序供试品供试液BL增菌液（培养1824h）EMB或MacC平板（培养1824h）无菌落生长，报告；有疑似菌落TSI（培养1824h）革兰氏染色镜检；或乳糖发酵；或IMViC试验报告。3.操作步骤(1)增菌培养：取均匀供试液10ml，加入备妥的100mlBL增菌液内，培养1824h。(2)分离培养：将上述增菌液摇匀，再用接种环沾取12环在EMB或MacC平板上划线接种，培养1824h，观察菌落生长情况。大肠杆菌在EMB琼脂平板上的典型菌落呈紫黑色或中心紫黑色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽；在MacC平板上的典型菌落呈桃红色或中心桃红，圆形扁平，光滑湿润。但从药品中分离的菌株，常出现非典型的菌落，在EMB平板上呈浅紫色或粉红色，无明显暗红色中心，无金属光泽；在MacC平板上呈微紫色或粉色。因此，以上形态均应作为疑似菌落进行鉴定，切勿漏检。分离平板上无菌落生长或无疑似菌落生长，可做出未检出报告。(3)纯培养：用接种针从疑似菌落中心沾出少许，接种于三糖铁琼脂斜面上，培养1824h，供各鉴别试验用。(4)革兰氏染色：取上述疑似大肠杆菌的纯培养物涂片，作革兰氏染色镜检。大肠杆菌为G无芽胞短杆菌。,三、细菌、霉菌及酵母菌计数,(5)生化反应乳糖发酵试验：取上述斜面培养物接种于乳糖发酵管，培养2448h，取出观察结果。大肠杆菌应发酵乳糖产酸产气，或产酸不产气。产酸者，以酸性复红为指示剂的培养基显红色；以溴甲酚紫为指示剂的培养基显黄色。产气者，倒管内有气泡。为避免迟缓发酵乳糖造成假阴性，可选用5乳糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌可于24h出现阳性。,三、细菌、霉菌及酵母菌计数,IMViC试验：靛基质试验(I)：取斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基，培养2448h，沿管壁加入欧-波氏试剂数滴，轻微摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。甲基红试验(M)：取斜面培养物接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，培养48h。每1ml培养物中加入甲基红试剂1滴摇匀，立即观察结果，呈鲜红色或桔红色为阳性，呈黄色为阴性。V-P试验(Vi)：取斜面培养物接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基中，培养48h，每2ml培养液中加入V-P试剂甲液(6-萘酚乙醇溶液)1ml，混匀，再加V-P试剂乙液(40KOH)0.4ml，充分振摇，如在4h内出现红色为阳性，无红色为阴性。枸橼酸盐利用试验(C)：取斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基斜面上，培养48h，观察结果。斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变，无菌苔生长为阴性。大肠杆菌IMViC反应模式为+-或-+-。4.结果报告：完全符合以下结果时，判定为检出大肠杆菌：染色镜检是G-无芽胞杆菌；发酵乳糖产酸产气，或产酸不产气；IMViC试验反应为+-或-+-。,四、控制菌检查,五、微生物限度标准,第三节 活螨检查法,一、活螨的检查二、活螨卵的检查,一、活螨的检查,螨属于节肢动物门蛛形纲蜱螨目，其种类多，分布广，在土壤、水、动植物、食品和药品中均可发现。药品可因其原料、生产过程、包装、运输、贮存等条件不良，受到螨的污染。药品染螨后，可在短期内发霉变质失效，一些螨类还可直接引起皮炎、肺螨、肠螨等疾病,传播疾病或危害人体健康。药典规定，药品特别是中成药，不得检出活螨。（一）螨的形态特征螨的体形小，多在1mm以下，肉眼可察见，但需用放大镜或显微镜才能观察鉴别。螨的形状一般呈卵圆形或椭圆形，无头、胸、腹界限。幼虫足三对，成螨足多数为四对。足通常有六节组成。口器向前端突出，螯肢常呈螯钳状，有齿，由23节组成。须肢节数因种类而异，由15节组成。有些种类在躯体前端或两侧有12对眼。躯体两侧对称，表面被有坚硬的几丁质的板。体表有刚毛。螨的形态因种类而异（见图）。螨类与蜘蛛、昆虫（如书虱），外形比较近似，应注意区别（见表4-1）。图中药材中常见的螨,一、活螨的检查,一、活螨的检查,（二）活螨的检查1.活螨的一般检查方法（1）漂浮法：将供试品放入盛有适量饱和盐水的漂浮瓶中，搅拌均匀。再缓慢加入饱和盐水，至液面略高于瓶口（为防止水溢出，可将漂浮瓶放在培养皿内），上覆以洁净的载玻片，使玻片与液面接触沾取液面上的漂浮物，将载玻片迅速翻转，置显微镜下观察。,一、活螨的检查,（2）直检法：取供试品先用肉眼观察，若有疑似活螨的白点或其他颜色的点状物，可用510倍放大镜或实体显微镜检查。有螨者，用解剖针或发丝针或小毛笔挑取活螨放在滴有一滴稀甘油的载玻片上，置显微镜下观察。（3）分离法：也称烤螨法，将供试品置于附有适宜孔径筛网的玻璃漏斗内，利用活螨避光、怕热的习性，在漏斗的广口上面放一个60100W的灯泡，距离药品6cm处，照射12h。活螨可沿漏斗底部细颈内壁向下爬，用小烧杯装半杯稀甘油，放在漏斗的下口处，收集爬出的活螨。发丝针的制作：取长约10cm的小金属棒一根和长约1.5cm的头发丝一根，以头发丝长度的一半紧贴在金属棒的尖端上，用细线将其缠紧，然后粘上加拿大树脂或油漆晾干，即得。,一、活螨的检查,2.各型中药制剂活螨的检查各剂型供试品，每批应抽取2瓶或2盒以上的包装单位；贵重或微量包装的供试品，取样量可酌减。必要时，可再次抽样，或选取有疑问的样品进行检查。（1）大蜜丸：将药丸外壳（蜡壳或纸蜡壳）置酒精灯小火焰上，转动，适当烧灼（杀灭外壳可能污染的活螨）后，小心打开。表面完好的药丸，用消毒的解剖针刺入药丸，手持解剖针，在放大镜或实体显微镜下检查。同时注意检查丸壳的内壁或包丸的油纸有无活螨。有虫粉的药丸，可用放大镜或实体显微镜直接检查，也可用漂浮法检查。（2）小蜜丸、水丸：表面完好的药丸，可将供试品放在预先衬有洁净黑纸的培养皿或小搪瓷盘中，用直检法检查。如未能检出活螨时，可再用漂浮法或烤螨法检查；有虫粉的药丸，可用直检法或漂浮法检查，同时注意检查药瓶内壁及内盖有无活螨。,一、活螨的检查,（3）散剂、颗粒剂和胶囊剂：先直接检查药品内盖及塑料薄膜袋的内侧有无活螨。后将药品放在衬有洁净黑纸的培养皿或搪瓷盘中，使成薄层，直接检查。必要时可再用漂浮法检查。并注意检查药瓶口及内壁是否有螨。（4）块状冲剂：直接检查供试品的包装蜡纸、玻璃纸或塑料薄膜的内侧有无活螨。有虫粉者，用直检法配合漂浮法检查。（5）液体制剂及半固体膏剂：先用75%乙醇将药瓶的外盖螺口周围消毒后小心旋开外盖，用直检法，检查药瓶外盖内侧及瓶口内外的周围与内盖有无活螨。必要时配合漂浮法和烤螨法检查。,二、活螨卵的检查,螨卵极小，一般在0.1mm以下，乳白色，卵圆形。显微镜下才能察见。对可疑供试品，未检出活螨时，应注意检查活螨卵。可采用检查活螨的直检法或漂浮法检查。如发现可疑螨卵时，小心挑取，放入中央滴有2滴稀甘油的载玻片上，置显微镜下检查。为确证挑取物是否为活螨卵，可将上述载玻片置培养皿中，加盖。2530培养10d，每天上、下午定时用显微镜检查，如在稀甘油中孵出幼螨，则判断为检出活螨卵。,（四）检验报告供试品按上述规定检查，检出活螨，应作检出活螨报告；未检出活螨，但检出活螨卵，也按检出活螨处理。为保留阳性结果备查，可将检出的螨按下法处理保存：将活螨放在预先滴有1滴75%乳酸液的载玻片上，盖上盖玻片，在酒精灯小火焰上来回移动，缓缓加热片刻，使其适当透化，即可镜检。鉴定后的螨体，可放入70%的乙醇中保存，或作固定处理。,第四节 热原检查法,一、供试用家兔二、试验前的准备三、检查方法四、结果判断,一、供试用家兔,二、试验前的准备,三、检查方法,按规定作好实验前的准备。检查时，取适用的家兔3只，测定其正常体温后15min内，自耳静脉缓缓注入规定剂量并温热至约38的供试品溶液，然后每隔30min测量其体温1次，共测6次，以6次中最高的一次体温减去正常体温，即为该家兔体温的升高。如3只家兔中有一只体温升高0.6或0.6以上，或3只家兔体温升高均低于0.6，但体温升高的总和达1.4或1.4以上，应另取5只家兔复试。如果初试的3只家兔体温升高均低于0.6，并且3只家兔体温升高的总和低于1.4，或在复试中，体温升高为0.6或0.6以上的家兔仅有1只，并且初、复试的8只家兔体温升高总和为3.5或3.5以下，均认为供试品的热原检查合格，否则为不合格。,四、结果判断,第五节 无菌检查法,一、直接接种法二、薄膜滤过法,一、直接接种法,直接接种法适用于非抗菌作用的供试品。检查时按中国药典规定的最低检验量取样后，分别接种于需气菌、厌气菌培养基6管，其中1管接种金色葡萄球菌对照用菌液lml，作为阳性对照，另接种于真菌培养基5管。轻轻摇动，使供试品与培养基混合。需气菌、厌气菌培养基管置3035，真菌培养基管置2025，培养7日。阳性对照管在24h内应有菌生长，需气菌、厌气菌和真菌培养基管均为澄清或虽显混浊但经证明并非有菌生长，则判断为供试品合格。如培养基中有1管显混浊并确证有菌生长，应重新取2倍供试品，依法复试，除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为供试品不合格。,二、薄膜滤过法,如供试品有抗菌作用，用薄膜过滤法检查。检查时取规定量的供试品，加入0.9无菌氯化钠溶液或其它适宜的溶剂至少l00ml中，混合后，通过装有孔径不大于0.45m的薄膜过滤器，再用0.9无菌氯化钠溶液或其它溶剂冲洗滤膜至阳性对照菌正常生长，将需气菌、厌气菌培养基，真菌培养基以及阳性对照分别加至薄膜过滤器内，或取出滤膜分成3等份，分别加入上述培养基中，阳性对照管应加入相应的对照菌液lml。按规定时间培养，判断的方法同直接接种法。即阳性对照管在24h48h内应有菌生长，需气菌、厌气菌和真菌培养基管均为澄清或虽显混浊但经证明并非有菌生长，则判断为供试品合格。如培养基中有l管显混浊并确证有菌生长，应重新取2倍供试品，依法复试，除阳性对照管外，其他各管均不得有菌生长，否则应判为供试品不合格。,第六节 细菌内毒素检查法,本法是利用鲎制剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的量是否符合规定。此法为中国药典采用的细菌内毒素检查法 细菌内毒素(bacterial endotoxins)：细菌内毒素是细菌细胞壁的组分，由脂多糖组成，热原主要来源于细菌内毒素，内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。细菌内毒素的检查方法是：取装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm75mm试管5支，其中2支加入0.1ml按最大有效稀释倍数稀释的供试品溶液，1支加入0.1ml内毒素溶液作为阳性对照管，1支加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照管，1支加入供试品阳性对照溶液(供试品溶液加细菌内毒素溶液)作为供试品阳性对照管。将试管轻轻混匀后，封闭管口，垂直放人371的恒温器中，保温602min后，将试管取出，缓缓倒转180，若管内凝胶不变形，不从管壁脱落为阳性(+)，凝胶不能保持完整并从管壁脱落为阴性（-）。供试品2管均为（-），认为合格；2管均为（+），认为不合格；若2支中1支为（+），1支为（-）则另取4支复试，4支中有1支为（+）即认为不合格。阳性对照管和供试品阳性对照管就为（+），阴性对照管应为（-），否则试验无效。,复习思考题,1简述固体与液体中药制剂的常规质量检查项目。2为什么要对中药制剂（尤其是固体中药制剂）进行水分含量的测定？其检查方法及其适用的范围是什么？3说出测定崩解（溶散）时限的意义及方法。4说出测定重量差异及装量差异的意义及方法。5说出均匀度、粒度、溶化性能、不溶物及脆碎度的检查各属于哪些剂型的检查项目？为什么？6折光仪使用时，需要注意哪些方面？7用管长为2dm的测定管，测得某未知浓度的葡萄糖溶液的旋光度为+9.45o。已知葡萄糖的D20为+52.5o+53o(取平均值+52.75o)，求该葡萄糖溶液的百分浓度。8今有一批二冬膏(煎膏剂)需检查其相对密度，方法如下：称取二冬膏10.26g，加水20.53g混匀，作为供试液，照相对密度检查法测定，已知比重瓶(20ml)重24.26g，充满供试液后共重46.48g，充满水后共重44.26g，请计算二冬膏的相对密度。9写出熔点测定法的注意事项。10细菌有哪些基本结构和特殊结构？各有哪些功能？11细菌的生长繁殖需要哪些条件？繁殖方式和速度怎样？12真菌菌落有几种形态？各种形态的特点是什么？13为什么要对非灭菌制剂进行染菌量检查？如何检查？14如何根据试验结果判断药品中有无大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等控制菌？15中药制剂为什么不得含有活螨？活螨及活螨卵的检查方法有哪几种？,