细菌与酵母表面展示技术.ppt

细菌表面展示技术酵母表面展示技术第七组,二蜡咐瘩且荤枯酮巍丛扔辊皿郝佃家农租煤冕勺咋掳娘瓮备验熔托士茶填细菌与酵母表面展示技术细菌与酵母表面展示技术,定义：细菌表面展示技术是利用基因工程手段将某一蛋白或短肽段（靶蛋白）与微生物外膜蛋白（载体蛋白）以融合蛋白的形式呈现在细胞表面。,歌讣省认娜婴遣量旧沁艇碎侣座劝若椰毅盏堕矣蜕易闭晨周顶钞乘丫摆衣细菌与酵母表面展示技术细菌与酵母表面展示技术,外源蛋白与载体蛋白结合方式,C端融合(N端锚定在外膜)N端融合(C端锚定在外膜)夹心融合(有些蛋白本身具有信号肽序列及锚定于外膜的序列，内部合适位点插 入外源蛋白),小短戒刊侯喜礁芋忌约羹晚变认狂喂拭闰乐姑侦玖忽酗迄子俗俄宦邻臭纹细菌与酵母表面展示技术细菌与酵母表面展示技术,细菌表面展示系统,传统：细菌的外膜蛋白、脂蛋白、表面附属结构亚单位（如菌毛、鞭毛等）近年：冰晶核蛋白、自体运转蛋白、S2层蛋白等每种展示系统都有自身的缺点（如展示蛋白大小的限制、错误定位、形成包涵体、外膜不稳定等），因此需要开发新的系统，以进一步优化表面展示系统。,惨狞嗓络冈狡饶片躁帐也屁疙铅帝害丙绘款敢酶警硅孵芯叹挚朋质雾燎蓉细菌与酵母表面展示技术细菌与酵母表面展示技术,早期研究多集中在革兰氏阴性菌。原因是遗传背景清楚，便于控制蛋白展示。,但是从应用上来看，革兰氏阳性菌的某些特性更适合于表面展示。如下表：,换巨稠桐魄众星阉舍喉扎淬狼晰财厂申寅恳旋勤驮绝苍蔷疯俄士忿贯彪北细菌与酵母表面展示技术细菌与酵母表面展示技术,缺点：转化率低，限制构建较大容量的肽库；一些革兰氏阳性菌分泌大量蛋白酶，这会给应用带来麻烦。,紧驻捧勃雍菇刚较镜炬缚皂从捂猾针钦竿眨扳憨殷敲篡兼筋粱帧职浴稻虚细菌与酵母表面展示技术细菌与酵母表面展示技术,细菌表面展示技术，结合荧光激活细胞筛选仪或流式细胞筛选仪，是非常有效的高通量筛选方法。,优点：1、能够决定突变体库中每个克隆的功能特性。2、目前唯一能够定量检验单细胞水平和大量突变体催化活性的方法。3、定量分析酶活性 4、同时检测多个参数并且对每个观察到的克隆进行记录。与噬菌体相比：细菌表面展示技术在疫苗应用上具有独特优势；进行更快速更高效筛选,绞剔襟爬高矛隶圭喇琳溪窘却藐逮弃华女侍簧贰乳巷气毡驱痈锥城箔胯沟细菌与酵母表面展示技术细菌与酵母表面展示技术,与传统的生物陶选技术相比，荧光激活细胞筛选仪具有以下特色高富集比高阳性率避免“亲和效应”,匆蚜末雏摇娟秘拈芍银雷菠醇哺喇采纹屎壮里驰大哟拖踊庙越涎蚂沟别其细菌与酵母表面展示技术细菌与酵母表面展示技术,基于冰核蛋白的狂犬病毒糖蛋白细菌表面展示,冰核蛋白是丁香假单胞菌的外膜蛋白，可加速纯水的冰晶形成，它通过糖基磷脂酰肌醇锚定在细菌表面，利于大分子蛋白的表面呈现。狂犬病毒糖蛋白是病毒与宿主细胞结合的配体，介导病毒与靶细胞结合。而且是狂犬病毒的主要保护性抗原，能刺激机体产生抗体，保护机体抵抗病毒感染。方法：1 冰核蛋白N末端序列的PCR扩增2 狂犬病毒糖蛋白序列的PCR扩增3 重组表达载体的构建4 重组载体的表达（可以导入大肠埃希菌培养、菌体裂解）5 蛋白表面展示的初步鉴定（结合ELISA，分光光度法鉴定重组蛋白是否成功展示在细胞表面）,狰癌苑仙耽译鲁饿胖浆矢奶犬胁壮卸财整忿妻磨术隆补士侍蒙测涝瞄霖蛮细菌与酵母表面展示技术细菌与酵母表面展示技术,综上所述，细菌表面展示系统灵活多样，操作简便，在多个领域显示出广泛的应用前景，随着新的载体系统的发展和其自身的不断完善，细菌表面展示技术必将在实践中发挥更大的作用。,港艇撼挑邹荣擒百吃胚帕蛙蕉戚鹅棍卿孙糊咨顷马刑撮鹏梭彪礼营亭扫坛细菌与酵母表面展示技术细菌与酵母表面展示技术,酵母表面展示技术,骡榜毡将屁茶喻序措椿绰异硷瞻国醒埠粳鹿崖浦键洼蛀惑震稚搏写奴拱亿细菌与酵母表面展示技术细菌与酵母表面展示技术,原理,酵母细胞表面展示技 术是近年来发展较快的一种真核蛋白表达系统，其基本原理是将外源靶蛋白基因(外源蛋白)与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞，利用酵母细胞内蛋白转运到膜表面的机制使靶蛋白固定化表达在酵母细胞表面。,涸腾漆鲤昼驼滨尺引用包袍阜几弯雌蹄瘫章抠漏拥萄馋凋焊幌呛皑揽堪捶细菌与酵母表面展示技术细菌与酵母表面展示技术,简介：酵母表面展示系统是继噬菌体展示技术创立以后发展起来的展示系统。酵母的蛋白质折叠和分泌机制与哺乳动物的细胞非常相似，对人的蛋白质表达和展示具有优越性。酵母细胞颗粒大，可用流式细胞仪进行筛选和分离。目前报道的两种酵母展示系统分别以-凝集素作为融合骨架。,衫芽孵滔腔赠晨葬杜瘩麦吹词夫咋讣州悄舒投佃漱禽丰跺洱惫翔杠哥恬埔细菌与酵母表面展示技术细菌与酵母表面展示技术,1.目的蛋白-凝集素表面展示系统,此系统将目的蛋白作为N端，与-凝集素C端部分融合，目的蛋白经-凝集素展示酵母细胞表面。-凝集素共价连接到细胞壁的葡聚糖上，其锚定部位由蛋白质C端320个氨基酸组成，富含Ser/Thr残基。Ser/Thr富集区因广泛存在的O-糖基化而拥有的一个杆状构象，可作为空间支持无发挥作用。迄今，已有多个应用-凝集素的C端作为融合蛋白的报道。第一个通过此系统表达的异源蛋白是-半乳糖苷酶。,糙炙驮吧属蹄脯赏合檀苑衡绎钉劈募翻拯随众体集屁弄板枚盗深竞囚魁逾细菌与酵母表面展示技术细菌与酵母表面展示技术,Schreuder等将来自瓜儿豆胶的-半乳糖苷酶的基因插入到酿酒酵母转化酶分泌信号和-凝集素C端部分编码序列之间。-半乳糖苷酶和-半乳糖苷酶-凝集素（-Gal-ACI）融合蛋白，均由固有的磷酸果糖激酶(PGK)启动子控制，并且是多拷贝的。批量培养过程中检测了细胞和生长介质中的酶活性，-半乳糖苷酶被高效分泌入培养介质，而Gal-ACI融合蛋白主要与细胞有关。,壳末忿涎弄帽元店沪膘没恶墨惹掸告眼委撬粤正摔阉怨淀强诈釜恨千迸咎细菌与酵母表面展示技术细菌与酵母表面展示技术,2.-凝集素-目的蛋白表面展示系统,这是一种将目的蛋白作为C端与-凝集素Aga2p亚基的N端融合的表面展示系统。-凝集素通过与-凝集素相似的连接锚定在细胞壁上。与-凝集素不同，-凝集素由两个亚单位的糖蛋白组成。酵母表面展示系统应用在酿酒酵母的-凝集素将外源蛋白质展示与细胞表面。-凝集素由核心亚单位(Agalp)和结合亚单位(Aga2p)两个亚单位组成，Agalp 共725个氨基酸，合成后被分泌到细胞外，与酵母细胞壁共价连接。Aga2p通过两个二硫键与Agalp结合，外源蛋白通过与Aga2p的C端融合可展示在酵母细胞表面。,予郊烬葛滇蚁乾哎嘎豪迈乡肋憎茵辉榷订蹿援如饭镐沫捎意搐坐自舆澈纸细菌与酵母表面展示技术细菌与酵母表面展示技术,天然-凝集素结合活性部位在Aga2p的C端，因此，此处代表了一个细胞外大分子的可及性区域和展示固定蛋白质的有用位点。酵母有两种交配类型MATa和MATa的单倍体细胞，这两种细胞之间的相互交配融合是通过细胞表达-凝集素和-凝集素的相互作用介导的。,靠恿主肇镰啼萄裴甸豢字林共从透怖象吁驯跺然糊己核渤木宗缄泳撮信冶细菌与酵母表面展示技术细菌与酵母表面展示技术,目前，酵母表面展示技术被广泛应用于蛋白质分子的相互识别、定向进化以及新型疫苗的研制等发面。蛋白质的定向进化：酵母表面展示系统用于蛋白质亲和力和稳定性的定型进化已有成功报道，最先被用于抗体的亲和力成熟;活的口服疫苗：在细胞表面表达的蛋白质易于接近抗体，因此，可被免疫系统识别，即使很小的肽，当展示在细胞表面时，也具有免疫原型。因而可通过在酵母表面表达异质性的抗原蛋白来发展疫苗。酵母是个足够大的颗粒，可用流式细胞仪进行筛选和分离，这就使得基于特异定量亲和力改变的的突变体分离成为可能。由于酵母展示的蛋白质是紧密锚定在细胞壁上，可以耐受SDS等的抽取，同时酵母有发酵特性且生长快，因此在工业上具有很好的应用前景。,才诊绍尹窃题绞蝴赞靡玩江譬把财盏括曾缴腥皆趟折了帛爷钥吕膘徽闪源细菌与酵母表面展示技术细菌与酵母表面展示技术,前景：表面展示技术日新月异，酵母展示系统在不断的完善和改进，在多个领域得到广泛应用。由于其是真核细胞展示系统，对于哺乳动物蛋白质，尤其是人的蛋白质的展示具有独特的优越性，相信随着此技术的不断完善，在蛋白质分子的研究方面发挥越来越重要的作用。,刃还趴认薛繁斌给稍迈砰吉勺右倒晓裳讶奖藻琶捡岛及橇渊英署繁生漏阶细菌与酵母表面展示技术细菌与酵母表面展示技术,谢谢观赏,翰叛标峭射颈滤致汇侦句蹿瑶拱泣皇板曲完错紊涟晌跨负舒队褂厨师迫赞细菌与酵母表面展示技术细菌与酵母表面展示技术,