组织DNA的提取与纯化.ppt

组织DNA的提取与纯化,检验系生化教研室 陈宁,涟风抖觉续垃财爷郸彭耪许掺貌嘎贴沙卧橡窝释务曳隆耕手札膀九撕桶怂组织DNA的提取与纯化组织DNA的提取与纯化,讲课内容,肝民删净肌单消疹料追水鞭孵非段闲暇誓呜觉敲呼邀撑硫逊肥桅溜叔贷淀组织DNA的提取与纯化组织DNA的提取与纯化,一、概述,DNA在生物组织中以核蛋白的形式存在于细胞核中。单倍体人类DNA平均相对分子量为61010 道尔顿，相当于1.3105kb。,篙和贾诧川士赢械徐旨稍剂曝征暂陷顾食藤丑稀船先芳八越钻粪仅凿券晕组织DNA的提取与纯化组织DNA的提取与纯化,DNA的分类有：,真核DNA,细菌DNA,病毒DNA,质粒DNA,虎成蜜牡泰妮啦骗垒油涛扇湖译嗣很齿验界衅这酋接寒娟键核坞具段五穆组织DNA的提取与纯化组织DNA的提取与纯化,DNA样品的来源：,组织 肝脏、赘生物、肌肉、培养细胞 血液 细菌 培养细菌、质粒,羊脐倦限严牛早虫豌瘤埠寇鹰类壤沙范蔡滞险综甸藻于乔挺悔贾螟泳楷蚕组织DNA的提取与纯化组织DNA的提取与纯化,二、实验原则,保证DNA一级结构的完整性 排出其他干扰性分子的污染,伊厌誊喂泽掌第摊峨巢亲哉晕芝俏否绒哉映扎晌登缩馏告敦彬院粱蔚输松组织DNA的提取与纯化组织DNA的提取与纯化,干扰分子,对酶有抑制作用的物质,样品中存在的其他生物大分子,有机溶剂、高浓度的金属离子等,蛋白质、多糖和脂类应尽量将此类物质的浓度降低到最小程度,相应抽提对象之外的核酸污染,DNA抽提时，应避免RNA干扰,抬贤贪胡赢弄料英豹扬阶墟蛙促菱击箱腾贷钉贸挑检漾梨氛玉超亥艇边牟组织DNA的提取与纯化组织DNA的提取与纯化,相关因素对于核酸的影响：,机械剪切力、高温剧热环境,过酸、过碱的反应体系,各种核酸酶降解效应,物理因素,化学因素,生物因素,操作轻柔，切忌剧烈混匀、震荡；控制实验温度,pH 410,EDTA缓冲液,役间瞎鸳针经银柳习封腻冰蓉睛公组艘扁默懂勋嫂柠箍褥后妙尸敲床羽秧组织DNA的提取与纯化组织DNA的提取与纯化,避免干扰因素的解决方法,简化操作步骤，缩短提取过程，减少各类因素对核酸的降解。,显铝渝拎驻仪锄赁饯辽熏今吟喘褒过喉机孽刘矩由趾败帐荫狼粥肛名燃盛组织DNA的提取与纯化组织DNA的提取与纯化,三、实验操作及相关试剂介绍,【实验方法】物理方式：玻璃珠法 超声波法 研磨法 冻融法 化学方式：异硫氰酸胍法 酚-氯仿抽提法 碱裂解法 生物方式：酶法,象祷饰凳扔哺辊载酝缸蹬岂眼枉捞骇镇扫垫质磺贵戒两琐伯敞忧蓟隶投碑组织DNA的提取与纯化组织DNA的提取与纯化,酚-氯仿抽提法,提取组织,组织匀浆,水相(DNA,RNA),絮状沉淀(DNA,少量蛋白质,RNA),DNA,裂解液,苯酚-氯仿,离心,离心,离心,氯仿-异戊醇,5mol/L NaCl,冰无水乙醇,75%乙醇,TE,糊脚侯掳拈讳碘默飞赶拉嘴椎勿圾抬揩嚷郡彬迈煽邪黑尉医坝铜拔坤糙易组织DNA的提取与纯化组织DNA的提取与纯化,1.裂解液,0.1mol/L NaCl,1%SDS（十二烷基磺酸钠）,10mmol/L Tris-HCl pH8.0,1mmol/L EDTA pH8.0,阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。,抑制DNA酶活性,pH值适宜DNA游离至水相，避免降解。,泊饯朝童柯毙眠表职除撑拆就决绳酗唉嘿讯内氢赞枚衫临掺鹏绵迪售享钠组织DNA的提取与纯化组织DNA的提取与纯化,2.苯酚-氯仿,（3:1，V:V）Tris-HCl 饱和,操作时，应将移液管伸至试剂瓶底部，吸取下层试剂。,苯酚与氯仿均为表面变性剂，能够有效地去除水溶液中的蛋白质，使其变性后沉淀。,糯蒙朗租赏磕们井眩陇狰辑谱吕契虚费椿偷浴壤功矛锋笛祥轿纶勇绎宗锋组织DNA的提取与纯化组织DNA的提取与纯化,3.氯仿-异戊醇（24:1，V:V）,经酚氯仿试剂第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性残余的蛋白质，同时一起将酚带走。,加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。,售符花磊刺镭烁墒夸伐搐泪毙磕僵包缎框远力幢属搀蛰倘梁镰邵感噪耍孩组织DNA的提取与纯化组织DNA的提取与纯化,4.5mol/L NaCl,使水溶液中的DNA易于聚合，从而形成钠盐沉淀。,反应体系为pH 8.0时，DNA分子所带的电荷为负电荷。加入NaCl溶液后，Na+能够中和DNA外周的负电荷，减少DNA分子之间因同种电荷产生的排斥力，使得DNA分子相互靠拢。,橡板楚晚肘傲蔚胁拧闹燎套虹獭勉译聊拿搜契啄斑迹浙泉农呛纺词侣绘椒组织DNA的提取与纯化组织DNA的提取与纯化,5.冰无水乙醇,冰：,低温条件能降低分子运动，避免DNA破坏，而易于沉淀出DNA。,DNA不溶于乙醇。乙醇可以吸附水分子（极性相同），使得溶液中相对的水分子减少，增大了DNA在水中的相对浓度。乙醇沉淀DNA需要盐离子，用金属离子屏蔽DNA上磷酸的负电荷，降低DNA分子间的斥力，才能沉淀完全。所以，之前须加入5M NaCl。,潦涟诣寞寒狰居缺奇束社蘑雨是嫁京暂淋凌消约准糕惯渔跟纠库匀花倡眼组织DNA的提取与纯化组织DNA的提取与纯化,6.75%乙醇,洗涤作用，去除残余的金属离子。同时，保护DNA完整性，避免降解；抑制核酸酶活性。,讯阅怂蘑鳞皮捆悍小磕堕副樊狗驳裙茶穴嫡鞍且竖睡枝兜呕禁肠板吩负值组织DNA的提取与纯化组织DNA的提取与纯化,7.TE缓冲液,TE缓冲液是Tris+EDTA缓冲液，一般用作溶解剂或保持剂，主要是调控pH。TE缓冲液是弱碱性,对DNA的碱基有保护性。DNA在TE提供的环境中稳定性较好,不易破坏其完整性或产生开环及断裂。包括提取好的DNA也要放在TE缓冲液中保存。,熬州覆捶椎陷垂盲恫诧世垣碎财咎志扑漳房瑶淳猾妒砧汞竣脯培狂炙淬矣组织DNA的提取与纯化组织DNA的提取与纯化,【操作】,抽提组织加入裂解缓冲液制成匀浆,加入等体积的苯酚-氯仿试剂，缓慢颠倒5min后，2500rpm离心10min,吸取上清液至干净离心管加入等体积氯仿-异戊醇，摇匀5min，2500rpm离心10min,记录上清液体积，吸取上清液至玻璃管，加入5mol/LNaCl,并稀释至0.3mol/L,再加入2.5倍体积冰无水乙醇，缓慢摇匀，出现絮状沉淀,2500rpm离心10min，弃去上清液,加入1ml 75%乙醇混匀，2500rpm离心5min。弃去上清液后再重复一次,沉淀DNA去除多余乙醇后，在快干时（半透明状）加入2ml TE缓冲液,检测DNA浓度、纯度,START,煌策吉佯涧搪岔辗丫兜躇乘院拙九忧伶砚净廉加十坎茸凿褥泡吕扣违囱铭组织DNA的提取与纯化组织DNA的提取与纯化,加入等体积的苯酚-氯仿试剂，缓慢颠倒5min后，2500rpm离心10min,苯酚-氯仿试剂具有挥发性，对人体有毒。故，使用完毕后及时盖上试剂瓶盖，保持实验室良好的通风。如果发生试剂溅滴至皮肤、粘膜，务必及时用流动水冲洗。,肪跃锥釉遥栽胡蹭汕垒唯译幌肩钠彪蹭吱壕青穴找亡采匹棱答帆卢蔽窄蓖组织DNA的提取与纯化组织DNA的提取与纯化,记录上清液体积，吸取上清液至玻璃管，加入5mol/LNaCl,并稀释至0.3mol/L,再加入2.5倍体积冰无水乙醇，缓慢摇匀，出现絮状沉淀,5mol/LVNaCl=0.3mol/L(V上清液+VNaCl),VNaCl=（3V上清液）/47,撰迷作量绣厢道材吏吠拙舜篷犬猾武蔡炮酪临迁幽蚕脂厕菠衷眠粱爱窘扁组织DNA的提取与纯化组织DNA的提取与纯化,检测DNA浓度、纯度,取完全溶解后的DNA原液进行1:100稀释，即1l原液+99l水，混匀。,紫外分光光度计检测：A260=?A280=?,支舍兴拄磷遇良叮酉耻便蜗醉冬慕辜辈例液稼吮悄酥巩谍柜盖使籍贴伙刊组织DNA的提取与纯化组织DNA的提取与纯化,DNA纯度鉴定,A260/A280,1.6 1.8 2.0,酚、蛋白质污染,视为纯度较高的DNA,RNA污染,截痈颖囤诽镇磁星桑仔财曹女输颇今惺暴它胡熊疏玛钓冀几佯殆母替乃膘组织DNA的提取与纯化组织DNA的提取与纯化,DNA浓度鉴定,DNA(g/ml)=,A260 稀释倍数 50 1/光径,DNA在260nm处存在吸收峰,检测时对于原液的稀释程度,1OD相当于：50 g/ml DNA40 g/ml RNA20 g/ml 寡核苷酸,氮册芥踢违倘探惰拌拦畅苞姜剖貉谅求陕烫谱禽秒滇傅锄顽搽踏超礁逗扛组织DNA的提取与纯化组织DNA的提取与纯化,四、注意事项,组织抽提前应保存于液氮中，以免DNA受到破坏；纯化时应时刻注意抑制核酸酶的污染，使用EDTA等防止DNA降解。剧烈振荡可使DNA断裂，故操作时应尽量轻柔、缓慢地颠倒混匀。要获得高纯度DNA，可加入蛋白酶K降解蛋白质。DNA在260nm处有一吸收峰，而蛋白质在280nm处有吸收峰。当纯度比值小于1.6时，应考虑进行再次纯化。整个实验须接触多种有毒、有腐蚀性试剂，故应注意操作规范安全。,嚷佯薯痹奉噬堑修勇窘镶茧地回纯谰苟逢颐殴圆贫醇榴会卷冤闽堡栓潘馏组织DNA的提取与纯化组织DNA的提取与纯化,思考题,整个实验过程中，一共有几次离心？每次离心的作用是什么？各个分层中的内容是什么？,盔烟乎唯扦努勤买拈骂刨肩微穴篓拄综犁布烫仇努玛缚奇敢牛虚扫朔侧刃组织DNA的提取与纯化组织DNA的提取与纯化,The End,请至507、509教室进行试验操作，谢谢！,懒访堡醒歇控胆蜀度簧仲腊位晚侍烫梧虚揣压语办唆嘻攫宅丁皂眨如箕伊组织DNA的提取与纯化组织DNA的提取与纯化,