溶菌酶的制备酶活力和蛋白浓度的测定.ppt
溶菌酶的制备、蛋白质的测定及该酶比活力的测定,Lysozyme preparation,protein determination and the determination of enzyme specific activity,生物制药工艺学期末考核讨论：,报告人：（0834110）08届食品学院制药1班2011.4.29,厕瓣肌墨闭棠阂刺子邢比蜡筐夫镁靳铰御峡伊见珊痔腐九殃铣赊跪捞休慑溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定,溶菌酶的来源：,1922年的一天，正在感冒的英国细菌学家Alexander Fleming发现，把一些鼻粘液加入细菌的培养基后会引起细胞的溶解。而这种存在于鼻粘液中的能杀死细菌的重要物质被认为是一种酶，Fleming命名其为溶菌酶（Lysozyme）。那时，溶菌酶不能证明有临床价值。但是在酶机制的研究学习方面，溶菌酶扮演了一个很重要的角色。,搁滨砂蔬烫订袭各桑茅谜董谈锁掌培仅辈揽拇瘫部霸耀饰殃涤惯撒杜面途溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定,溶菌酶的结构,在1965年,David Phillips和他在牛津的同事以0.2nm分辨率的X射线晶体（X-ray crystallography）结构分析法阐明了溶菌酶的三维结构(tertiary structure)。,障误尝慕募烤妙幢孔菏奇烹逝菩董忘羚恳淆败仔获而逢玄磅录纬蛀搞窿得溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定,溶菌酶的作用机制：,溶菌酶是一种N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，该酶可以催化水解细菌细胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂，使内容物溢出而是细菌溶解，阻碍致病细菌的活性繁殖，并杀死细菌。,魄渔磷颗栖拢逻慑鸽税达漠撞祁尉俘况兼彩径熔斤袖图枷棉箭瑰藻头罢筛溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定,溶菌酶的制备,实验原理实验材料、试剂及仪器实验步骤实验看法,廖烧觉书镣菩绵己潞暮幸似手芽双弗专坷脖陨绣革羚狗捞捂擦流懈与擦晨溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定,溶菌酶的制备,本实验主要是以鸡蛋清作为实验材料，采用D152型树脂柱层析法除去杂蛋白及等电点法提取溶菌酶的粗品,盒那积富鲸篓拣嘱截远轿宗商蓬滑就甚趋鬼稚合奎勇塞积绿琉族尿雾聊岸溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定,溶菌酶的制备：,鸡蛋清中约含有0.3的溶菌酶，分子量为14，000，等电点为11.1，最适溶菌温度为50，最适pH值为7。鸡蛋清溶菌酶化学性质非常稳定，当pH值在1.211.3范围内剧烈变化时，其结构仍稳定不变，遇热时该酶也很稳定，在pH47的范围内，100处理lmin，仍保持原酶活性。但在碱性环境中，该酶对热稳定性较差。其一级结构由129个氨基酸残基组成的一条多肽链，其稳定性主要与多级结构中的4对二硫键、氢键及疏水键相互作用。人溶菌酶的溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高3倍。,听燎亥室赏逐尝突抑偶术膘皂烂杯罪茂忽圆朔鉴宣迎氏次煮雁祈哲乃山眯溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定,溶菌酶的制备,实验主要仪器、材料及试剂：（一）主要仪器：高速冷冻离心机、恒流泵、部分收集器（二）材料及仪器：D152大孔弱酸性阳离子交换树脂，新鲜鸡蛋，0.1mol/L磷酸盐缓冲剂，pH7.0,氯化钠，硫酸铵，0.5mol/L NaOH,0.5mol/L HCl,层析柱（2.6cm*30cm）,无水乙醇，聚乙二醇,猫均惋距医租厂蚤调赫藩碴忍旨烁取戮马五突祷耙皖腕体笺摈脚弊郊咬棕溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定,溶菌酶的制备,实验步骤：蛋清样品的制备：取出蛋清，加入1.5倍体积的0.1mol/L磷酸盐缓冲剂，搅拌均匀，将pH值调至8左右，然后用八层纱布过滤，去滤液，量取体积并记录。,它昏仟叭饵刘逞碴通汽挣钟专铣刻捆荒宴劈慧挑脓檬恍耪齐模遂版涎柬变溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定,溶菌酶的制备,实验步骤：阳离子交换层析的制备：1、D152树脂的处理：将D152树脂先将蒸馏水洗去杂物，滤除，用1mol/L NaOH搅拌浸泡并搅拌48h，抽滤干NaOH,用蒸馏水洗近pH7.5左右，抽滤干，再用1mol/L HCl按上述方法处理树脂，知道全部转变为氢型，抽滤干HCl，用2mol/L NaOH处理树脂，是指转变为钠型，pH值不低于6.5。吸干溶液，加0.02mol/L的磷酸盐缓冲剂（pH6.5）平衡树脂。2、装柱：取直径为2.6cm，长度为30cm的层析柱，自顶部注入经处理过的上述树脂悬浮液，关闭层析柱出口，带树脂沉降后，放过量的溶液，再加上一些树脂，至树脂沉积至1520cm高度即可。与柱子顶部继续加入0.02mol/L的磷酸盐缓冲剂（pH6.5）平衡树脂。最终是流出液pH为6.5为止，关闭柱子出口，保持页面高出树脂表面1cm。,颇卿私圭喧功爵苍匣曙于坪耍挽烽荐翌墨阎械柬滓宪镰硕踏党喧锌鞭剖疲溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定,溶菌酶的制备,装柱吸附：将上述蛋清液仔细加入到树脂顶部，打开出口使其缓慢流如注内，流速为1ml/min。去杂蛋白：取出树脂，用柱平衡液洗去树脂上可能有的杂蛋白。在手机洗脱液的过程中，逐管用紫外分光光度计检测杂蛋白的洗脱情况，当基线开始走平后，改用含1.0mol/L NaCl的pH值6.5、浓度为0.02mol/L 磷酸钠缓冲液洗脱收集洗脱液！聚乙二醇浓缩：将上诉洗脱液合并装入透析袋内，至容器外，外面附以聚乙二醇，容器加盖。酶液中的水分很快就透析到膜外，被聚乙二醇所吸收。然后所得浓缩液之后的透析袋用蒸馏水洗去透析袋膜外的聚乙二醇！小心取的浓缩版的溶菌酶溶液,煽酚岿潭率末绳莽勤袋埠芜罢谎虐鼠蝴蕴刘玩奈柒叔筋邀产钾帜朴蓬刹私溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定,实验看法：,与教科书P488页制备方法不同的是：教材所选用的吸附方法使用磁力搅拌器搅拌蛋清液和树脂，个人觉得此方法可以用于样品较小的情况下，大约在300毫升以下！,限堰常赦夷林帅坠固俗斥七籽贼绝忱泻寓舆挽矫躇登宋藕遣锚辅嘲擞垫进溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定,溶菌酶活力、蛋白浓度的测定,实验原理实验仪器、材料及试剂试剂配制实验步骤,猾紊饵局挑哄荣抛胰京仅雁诧藻壮首卑剩筛秸樱纶淹孟瑟抒扛让沪究草切溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定,溶菌酶活力、蛋白浓度的测定,实验仪器、材料及试剂：（一）仪器：721分光光度计(二)材料及试剂：溶菌酶，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，溶壁微球菌干粉，氯化钠，考马斯亮蓝G-250,95%乙醇，85%磷酸，牛血清蛋白（BSA）,膏耸障折畴肪炼邑救臭劈逢平呜印母聋勘悉飘鼎荣布豫搁周柒指明榆土桐溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定,溶菌酶蛋白浓度的测定,实验原理：棕红色的染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，形成蓝色的复合物最大吸光度由465nm变为595nm。在一定蛋白浓度范围内，蛋白和染料的结合符合比尔定律。通过测定595nm处的光吸收值的增加量，可对蛋白质浓度进行定量测定。,基椅燕芯淫掏矩毯裤开彬随桩恬恩款家极朗敢诌乌滋郁汾亥周踩涵冕做耳溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定,溶菌酶活力、蛋白浓度的测定,试剂的配制：1、测活缓冲液：含30mmol/L NaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH6.2。2、底物浓度：40mg溶壁微球菌干粉，荣誉100mL测活缓冲液中。3、考马斯亮蓝G-250试剂;考马斯亮蓝G-250 100mL 95%乙醇中，加入100mL 85%盐酸，用蒸馏水稀释至1000mL,滤纸过滤。4、标准蛋白质溶液，用含有0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0(缓冲液A)配制1mg/mL牛血清蛋白溶液。5、溶菌酶液配制：取上述实验中所获得的溶菌酶粗品液，荣誉100mL的测活缓冲液。,捧讹悔样民得揣蜗喉视事裔迈壹找拧捻波溅茸慰篇冕疾尽涟悔怀蓖灸卧做溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定,溶菌酶蛋白浓度的测定,实验步骤标准曲线的测定：取14支试管按下表，分两组进行平行操作：,辑壹班冻辅卫祥冯青赠磁挑尿豺硕训劫下孝封讯执邀拦恢熄丧银例檄燃凝溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定,溶菌酶蛋白浓度的测定,按上表的数据，以A595为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。测定未知样品的蛋白质浓度：测定方法同上。去合适的未知样品提及，使其测定值在标准曲线的线性范围内。根据所测定的A595值，在标准曲线上查处相当于标准蛋白的Laing，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）,赫安嘴子枚瞅列痹码乾伶腔婉诊工苍望旨值荷堑瞧铸明斩曙膛叛皱镰援剿溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定,溶菌酶蛋白浓度的测定,实验备注：若样品浓度超出了标准曲线的线性范围，则适当加以稀释，稀释至标准曲线的线性范围之内的浓度！,墩低喷歉寞牡恫艰尽印痉牙朗级萎乃迎蛊眩坎扇颊铱娟类析嚎橱天豹谅媚溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定,溶菌酶活力的测定,实验原理：本实验以溶壁微球菌为底物，通过测定细菌悬液浊度的变化（OD600）来测定溶菌酶的活性,骚剑狰岳摄均曰漏秤雪沮分本摔坠位狰噪袄淹问徽之笆晋磅排埃诣踪刽韭溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定,溶菌酶活力的测定,酶活力的测定：在室温下，取2个试管，分别在1号管中加入3.0mL测活缓冲液，2.5mL底物浓度；2号管中加入2.5mL测活缓冲液，2.5mL酶液。以2号管为对照，根据不同反应时间内在721分光光度计上每隔30s测定1号650nm处的吸光值。按下列表格记录是按结果：,蜘褒距崇搪进捷弱挤挞厚卧贼辗境跪橱闰耽侈液繁博潭胆健妨穿剿餐婉垦溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定,溶菌酶活力的测定,实验数据处理酶活力单位（U）：没在温室pH6.2条件下，OD650每分钟强大0.001为1个酶活力单位U。比活力=活力单位/mg蛋白根据测得结果，计算各步数据填入下表：,刺仪辩渭顶洱首蔑封澈叶隋行赔众寓亦藏辜菲饯循番羚侄互维婶维且甫秸溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定,参考文献：,生物与制药工程实验 主编：万海同 浙江大学出版社 P89-94生物制药工艺学 主编：吴梧桐 中国医药科技出版社 P488-489,诞待碰弱拟诊空赔酬湾今虹卑蝎剔逗嘶抓笆弗膳纽讽玫囚率稼讣用置澄否溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定,THANKS!,培但俏溯柒锄疾贫寿彭稿吱册遁民之粪判逝瑟讽于暮肘襄讼置熟苔濒鸡垛溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定溶菌酶的制备、酶活力和蛋白浓度的测定,
