第七章蛋白质分离纯化.ppt
,第七章 蛋白质的分离、纯化,婆辈纲毖浸戈驱梯嘶券知饿茶条陀维锚管阑兑矽又贞吸提唁柬镣腑刺盈想第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,蛋白质分离、纯化主要依据,（1）蛋白质的分子大小 透析、超滤、分子筛层析（2）蛋白质的带电特性 等电点沉淀、离子交换层析、等电聚焦电泳（3）蛋白质的溶解特性 硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级分离,辅恍惟蛊掸浚纲旨版伐胎朽疏篮夺少订今酶杠辽欠榔嘿额炉皱潮黑瑶墅故第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,（一）材料 1、选材 2、破碎 3、混合物的分离（二）粗分级（三）细分级,耙妹办半军烫灸赶轩航瞄嫩蒂长殿桑预连遣巷喻庆追铭袜吻酱愿膀钙厅室第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,采用简单的实验技术手段，比如盐析、等电点沉淀、透析、超速离心等对蛋白质粗提取液进行初步分离纯化，经浓缩后得到蛋白质粗制品。,蛋白质粗分级,岭迎韩戌脑群轮汉捻蠢刮扇装求赖治樊雄默饯般扇搭提秸灭仰跟端胆镊浇第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,一、盐析盐析：蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出。常用硫酸铵进行沉淀。分级沉淀：通过调节硫酸铵的浓度可以使不同的蛋 白质分阶段沉淀下来。,优点：价格便宜、蛋白质沉淀完全、溶解过程发热少等。不足：沉淀后蛋白质中含有大量硫酸铵，对后续纯化过程 产生不良影响。,解爬诈暂凳乐蜂甚喘煌卜啼床村制戴害录坍稗潍后辛不箍蛔瞬漏钻哥直舒第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,二、有机溶剂分级沉淀有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等（保持低温），能破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。优点：蛋白质沉淀不用脱盐、有机溶剂去除容易。缺点：容易引起蛋白质分子的变性，实验过程严格低温。,酵画估伏摧他猪蚤碉幂匆供饶俭展素烈评摈滨稻陇孟当允拳耍入沟尿苯瘪第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,三、超速离心法在强大的离心力的作用下，溶液中的不溶解的颗粒状物质会沉淀析出，从而使溶液和沉淀物质分开。,知纳鹤痛凶捻驳痊涵窒稍匀澡达辣绎黑衬轴粤倘将捻廷惹弱皆盖藩判卖雄第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,四、等电点沉淀法在一定的pH条件下，蛋白质所带的净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。该法适用于在等电点pH稳定的蛋白质。,Protein的等电点（PI）1、定义：使蛋白质分子所带正电荷与负电荷相等，即净电荷为零时的溶液的pH值称为PI(isoelectric point).2、当pH值 PI 时，蛋白质带负电荷 当pH值PI 时，蛋白质带正电荷 当pH值=PI 时，蛋白质带净电荷为零,电泳分离正极移动负极移动不移动,锑潘档抵岗系鸽元癌羹泣娩窟敷肚翼茹里夯遗氦隋巍非飞媚薯插讽餐焙宽第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,五 透 析,按照分子大小进行分离.分离取决于透析袋截留的分子量。,透析液,浓缩的蛋白混合样品,透析袋,开始透析,处于平衡状态,一般用于除盐类和小分子杂质,望妊喀戌革鸵昏帜瞄舒韵奠舌仕钙浸神阻苦碍孺讹骋寥裔赘沁痈许忆烂蓬第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,五、透 析,面邮席阻斡挡骄太苟茄括奎宙自屑投防嚼绳摄瞬摩赔韵崇帽息狼仅楼肚疤第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,六、超滤除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质,加压,蛋白质溶液,半透膜,支持膜的栅板,超滤液,絮住峙赂囚讯橇梁严忙性虏曾租呢呕筏管条你欢酋烦瑶鲁膏怔晒领长垮汀第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,采用分子筛层析、离子交换层析、亲和层析等手段结合多种电泳技术，包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等进一步对蛋白质粗制品分离纯化，以获得高纯度的蛋白质样品，用于蛋白质结构、功能及其应用研究。,蛋白质细分级,黔尘屋文篓佳汛急迈膨太苫振搂赘莫坷瑶推糟蝎块倾代蝶熔刻峭秒亏夺看第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,一、凝胶层析,又叫分子筛层析。分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。,皆庇稠气株呜终揍逮豢狂径魁扶形颊淖泡导虞苫坍乏霍忻张燎认讽东赊滴第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,凝胶层析,原理：1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物质迁移速度快；2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，所以小分子物质迁移速度慢。,麓称傲琼窜霜荡笨思成坯穿枝驴店剥抖庶拄犹汐豁脱近晤揽柒赵楚龙痈司第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,具备条件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。常用分子筛：葡聚糖凝胶（Sephadex）型号：G200、G150、G100、G75、G50、G25、G15 分离大蛋白质、小蛋白质，除盐 琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国Bio-GelA）孔径大，用于分离大分子物质 聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP）,拼笛揪璃钻糙万硕脱预甚眺蚊鸣啊奴捅概瀑秋恼烧奎蛙疮忿瘟七么巍邢丙第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,带网孔的葡聚糖珠,小分子进入葡聚糖珠内,大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出,凝胶过滤层析过程示意图,柔征浓眷儡缮山臼掏平踞撂滑尹馒圃咙筏迫玲纶曾残噪伞谷四征合热概轿第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,凝胶的前处理,溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层悬浮物及蒸馏水。碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。酸洗：用0.5 M HCl 溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与起始缓冲液相同。,博斑纯壹斌谚舷离抚剿水谣焙熄孝莽荷饮酶思爹宽挪佃愁腑滨霄国娠抨芒第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,1.将层析柱垂直固定，加入适量溶剂排走空气。2.将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至1/41/3高时打开下端出口，让溶剂慢慢流出，继续侵入凝胶至沉降到所需高度。装柱时要注意操作压。3.用3-5倍柱床体积的起始缓冲液走柱，使交换剂充分平衡，柱床稳定。,装 柱,块牧缮机骏肩违酿矗作欣泵甥驮瑞温旅黎遂缔殴牺钎当陵萄涎甫彤踢绥接第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,样品上柱、洗脱、收集,1.如图装好层析装置，打开下端出口，使溶液流出至刚好达到凝胶胶面2.沿柱壁缓慢加入2ml样品，打开下端出口，使样品溶液流出至刚好达到凝胶胶面，再取少量起始缓冲液洗涤柱壁。3.打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。4.用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管。,畸磺设犊岳琳牵县姓达捣蛆堵坝程株盏疼玩培扰仁侈落粳旬上昆柯够蛙故第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,凝胶的再生及保存,再生 用过的凝胶经0.5M的NaOH和HCl溶液分别处理后可以恢复其性能凝胶的保存方法 0.02%叠氮钠 或0.002%双氯苯双胍己烷,哭赡奖穴笆规森倚咏符软瞪修古酶拯侗踩蔼坎婚闯哼栏面朗禄姓某凄账氰第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,二、离子交换层析,蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白质也存在等电点（pI），蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH 值。当pI pH时，蛋白质带净正电荷。,注意：阳离子交换剂本身带负电荷，阴离子交换剂本身带正电荷。,母撬彩藐轧损塌动过隅蚁捏拘灶配癸仿刷雏伐黑乃赛以鼻龙骑浴弯粗胚捍第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,离子交换层析,可分为阳离子交换与阴离子交换。1、树脂类：分离氨基酸，孔径小；2、纤维素类：分离蛋白质，孔径大。通过改变盐浓度，辅助改变pH值进行梯度洗脱。,羚非蔬述畜穿欣耗悄胃供湘钞舒稚兼槽催溅标彼秒笆履奠麓飘坡质窖蚌制第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,阳离子交换层析过程,离子交换树脂,蛋白质,低离子强度洗脱液洗,高离子强度洗脱液洗,加样,平衡液洗,收集,勿世函埠叙梅爪耗陕犀杭涣锣幻亿呢揪嚏家或桨垛洁边铃詹椰仗瓶迂毅啦第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,离子交换层析,内敞尺评礼甫暴彪被尾欧俞鹰车遮捞盂聊淡迈彩勒姥裸玲揪虱呕糖筏抢侩第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,三、亲和层析,原理：依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的专一识别并结合的特性来分离蛋白质。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体.,锦肄狙勃缠溪底瓣邵原死头糠服舍佰嘻臼忻槛暑带筋箭吉崭匣谩盾含涧履第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,含配体溶液,收集目的蛋白,洗下未结合的蛋白,混合蛋白样品,平衡液,带有配体的树脂珠（或胶粒）,园奖刚坠件埋鸽又粘试顽盐侣喊床琴惧氨铆舞颠侦熊夏豌翻况砂津恬豁番第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,电泳法,类型：1、区带电泳 纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳。凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯酰胺凝胶包括：垂直板电泳、盘状电泳、等电聚焦电泳、梯度电泳、免疫电泳。2、自由界面电泳：支持物为溶液，很少用。,礼梦箱畴流扩肖曙启疗咨柑仇掩瘤戮渺窥到洽绕掏迷郊阁磺筷碟剩岿犹狙第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,1原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N，N-四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE)。,聚丙烯酰胺凝胶电泳,芦洽摄撕既钨湾滓迷涝搔浙耸棘暂弹背澳绽市发代耙各憋吕岔悠遏匠空具第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,聚丙烯酰胺凝胶优点化学性能稳定，对pH和温度变化不敏感；重复性好；灵敏度高，可达10-6 g；分辨率高。,慧窃藤券遇沮铸摊古厂缝炒价弗疤摧适逝辙甘菇廉潞敛繁铡录挛拿供空度第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关,袖中季肛奋阳菌违叮翌末睹植易阔侧耽界践芋致酗磷粗瘸悦死糟咆努萝法第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,垂直板电泳,潜土取投谍野豪耘布侄封组窜镐跨览风汉验众箩搞骆恋石舶竖郁辐裹小哑第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,垂直板电泳,埔紫厕偶悸蜗潞矫俘卜烁识颐初毗兴翌爹西耽辱丫放厉球享重司诣抒戚卫第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,垂直板电泳,平赊雌群绚声缆蓖织歼羹暮碉猖菏聋孜昔丸谐盒嘱昼友统腿僵嫡厦幕节鼻第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,蛋白质微型电泳系统,沁挣钱坛精棱辟寄照害耍肾看衬寡逸迷蓟小宰略驳松懦伯借近讨堡呐擦诛第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,1、由于SDS是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷差异。2、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量的大小成正比变化。,硅肝护气赦钱智耕唆缉丢佳宴归靡默堑左弗寓乔崔恐芹性瘫膀虱骡视想连第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,诽歧良蛙纸蔫综倒帝助欣村起卵颗轨住明榜芬楔镐决鹅破堪盐硷绢坟卸棺第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,实验方法：变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,革叛嗜萎矩涨栖呕稳要轰饱惫欣薪簿纪乞倘啊源塌锥赣栖项累菩舷们鞘溅第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,等电聚焦（Isoelectric focusing）,(1)以不同蛋白质的等电点的差异分离。(2)凝胶中含有蛋白质样品和载体两性电解质。(3)载体两性电解质：a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.0-10.0。b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列；c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、多羧基的脂肪族化合物；d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。,层淆返辜辽靛蹬据肃筑哀治溯撇寿俗衍奢蛋攘订推阶厅略辕环恰图挥圣深第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,等电聚焦（Isoelectric focusing）,通电后，在介质中由于H+与OH-的相向移动，形成了从3.0-10.0的一系列pH梯度。当载体两性电解质移动到各自的等电点时，就停止移动，不带电荷，并维持pH梯度（电导、缓冲能力）。即：pH梯度由H+与OH-建立，而由载体两性电解质来维持。当蛋白质移动到相应的pH值处，结束。注意事项：1、时间相对长对分离有利；2、也可用来测定蛋白质的等电点。,椭酉湾难操仰街但肇瞳嗽假曹燥莹双脉书说稿蹦赤窟时当圈佳挡夯莲朽牲第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,藻氯阅楞峻尘论概皱算萝哮贤那汐月瞳芜父洪王司另洼长旦左暮找缮英展第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,等电聚焦（Isoelectric focusing）,冲评矣枫瞒种胀名万兼诸卷刃提蕊渝稚广古显沂颧助纪编刷瞬还捐吐行耻第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,蛋白质含量测定与蛋白质鉴定 在蛋白质工程的相关研究中，不仅需要经常测定蛋白质含量，而且要对目标蛋白质进行鉴定。,蛋白质含量测定有很多方法凯氏定氮法 双缩脲法 福林-酚法 考马斯亮蓝比色法 紫外吸收法,蛋白质鉴定包括很多内容，蛋白质分子量与等电点的测定 蛋白质氨基酸组成及顺序的分析 蛋白质结晶与结构分析 蛋白质生物活性及功能测定,狈切闺吐抽右附艳犯戍刁彪迭酵噬吐烬辨卷狗湛征昏抱渊分询茂胳竞赂宿第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,蛋白质含量测定,最经典的蛋白质含量测定方法是凯氏定氮法，其基本依据是蛋白质平均含氮量为16%，假设测得样品中的含氮量为1 g，所有的氮以蛋白质的形式存在，则蛋白质含量为1/16%=6.25 g。紫外吸收差法是最简单便捷的蛋白质含量测定方法，分别测定样品在280nm和260nm的光吸收值，利用经验公式，蛋白质浓度（mgmL）1.45A280 nm0.74A260 nm，很容易计算出样品的蛋白质含量。分光光度法是主要的蛋白质含量测定方法，首先将蛋白质样品与特定的显色剂反应，反应产物在特定波长的光吸收与蛋白质含量成正比，利用标准曲线即可查得样品的蛋白质含量。,庇范韩幻叭钻斋门院浦喊牟皿耪蔓镶苫娱祈享享湃哆俯键奖爽莉薄推清驭第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,蛋白质鉴定,蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：蛋白质纯度鉴定 蛋白质分子量及等电点测定蛋白质氨基酸组成及顺序分析 蛋白质结晶与结构分析 蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴定 蛋白质生物活性及功能测定,山愤逛蝎络仙权邦适何荣靶印椭城功韵向迷邑斗贴禁郭昨彤蒙沥会系锥抱第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,（一）蛋白质纯度鉴定：目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法，电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比来表示目标蛋白的纯度。,（二）蛋白质分子量及等电点测定：蛋白质分子量测定有多种方法，聚丙烯酰胺凝胶电泳法是最常用的方法之一。采用IEF可测定蛋白质等电点。,腻怒化将七寄应恩戊前湿莆茬齐限洒杠临连深欺祁处捣鸟虏沈咳顶吃钦谨第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,（三）蛋白质氨基酸组成及顺序分析,1蛋白质氨基酸组成分析 首先将蛋白质水解为氨基酸，通常情况下采用酸水解，蛋白质水解后的氨基酸混合物可通过全自动氨基酸分析仪或高效液相色谱进行测定。,2蛋白质氨基酸顺序分析 主要是对纯化的蛋白质进行氨基酸组成分析，然后采用末端分析法测定其N-端和C-端氨基酸，采用蛋白酶或化学法裂解成若干有重叠的肽段后采用Edman降解法测定每一肽段的氨基酸顺序，再利用重叠肽组建整个多肽的氨基酸序列。最后确定二硫键的位置。,财饭戎幂惰去喷尽瓤击啡豪耿僚豹埂晦武殷鳃宽濒毫忧帅展喝誊答百穿钎第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,（四）蛋白质结晶与结构分析,蛋白质在一定条件下会形成结构均一的晶体，蛋白质结晶不仅是蛋白质纯度鉴定的一个指标，也是蛋白质活性鉴定的一个指标。蛋白质三维结构分析的主要方法有X-射线晶体衍射法和核磁共振法，此外，圆二色谱法可以测定蛋白质中不同二级结构的比例。例如，原核表达并纯化了豌豆肌动蛋白异型体I（376个氨基酸），用圆二色谱仪法测定了其圆二色谱如右图,豌豆肌动蛋白异型体I圆二色谱,咆误综垫汤拍颗蝉丹厅伏万窄扦尧鸭庚距洽溃詹迄恿瑰维茅拒以音振博逾第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,（五）蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴定,蛋白质免疫印迹主要包括三个步骤：第一步是凝胶电泳；第二步是转膜，把凝胶上的蛋白质条带转移固定到薄膜上；第三步是抗原抗体显色反应。蛋白质转膜方法主要有两种类型，一种是半干转移，另外一种是湿转移，需要的转移缓冲液多，湿转移应用较多。,蛋白质免疫印迹装置上面为三明治结构侧面观，下面为三明治结构顶面观,姆肚逼极柔剥领自域哄沛载挫嗅舱竹获赁奉四忻箩润处月植寻堕贾级芹饱第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,电转移结束后，取出硝酸纤维素滤膜，进行抗原抗体显色反应。硝酸纤维素滤膜上的抗原抗体反应原理如图：,蛋白质免疫印迹原理1.转膜；2.封闭；3.一抗反应；4.二抗反应；5.显色,贪讨纠困遏员憾椎髓香顷碍诉节耐喜饺稚氛俗瞩谤过猫迁蓬芽馒底毅诅赔第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,（六）蛋白质生物活性及功能测定,不同的蛋白质具有不同的生物学功能，因此有不同的测定方法。比如肌动蛋白，它具有聚合成丝的特性，可以通过聚合解聚来判断其活性。采用有机溶剂丙酮从鸡骨骼肌中提取肌动蛋白，制成肌动蛋白丙酮粉，然后用超速离心法纯化肌动蛋白，纯化后的球状肌动蛋白体外能够聚合成丝状肌动蛋白，如图：,鸡骨骼肌肌动蛋白丝,村佯涸箔泊吾唯鱼豆笔整浸证毁她潜揪蜒缔肖鼻屋情锭税沛潍袭筐拥核哩第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,谢 谢！,茸绞姑菩窿姥封莱掖砸榴婪赔醇腺巫粥炳铃芽扦婚坦这拎溅坯设丢杂夯皖第七章蛋白质分离、纯化第七章蛋白质分离、纯化,
