提取与沉淀分离技术.ppt

1,第一章 提取与沉淀分离技术,生物物质，尤其是生物大分子物质：蛋白质（包括酶），核酸，脂类，糖类等生物大分子的制备分四个阶段：选择材料和预处理细胞的破碎及细胞组分的分离 提取和纯化 浓缩，干燥和保存,2,生物大分子物质及其性质,生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断,3,动物，植物，微生物都可作为制备生物大分子的原材料，所选用的材料主要依据试验目的来确定。有效成份是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。而有效成分以外的其它物质则统称杂质。,生物材料的选择,4,在动、植物和微生物材料中，有效成分的含量一般较少；稳定性较差，大多数对酸、碱、高温和高浓度有机溶剂等因子较敏感；易被微生物分解变质。材料的采集会大大影响实验的成败,选用的材料不同，有效成分的含量就不同；同一材料的部位或生长期不同，有效成分的含量也不尽相同。总的来说，材料选择应遵循的原则是，有效成分含量多、稳定性好；来源丰富、保持新鲜；提取工艺简单、有综合利用价值等。,5,1、动物脏器：冰冻：-10冰库（短期保存）-70低温冰箱（数月）干燥：可长期保存 2、植物组织：10小时内置-4-30冰箱储藏备用3、微生物：胞外产物（如发酵液），低温短时储藏。胞内产物，则应收集菌体或细胞，制成冻干粉于4保存（数月不变质）除了体液和微生物胞外的某些蛋白质和多肽以外,大多数生物大分子都存在于细胞之内.为了将细胞内的生物大分子提取和分离,就得将细胞或组织破碎.,生物材料处理,6,1、动物组织：选材：必须选择有效成分含量丰富且易分离的脏器组织为原材料。如磷酸单酯酶，从含量看，虽然在胰脏、肝脏和脾脏中较丰富，但是因其与磷酸二酯酶共存，进行提纯时，这两种酶很难分开。所以实践中常选用含磷酸单酯酶少，但几乎不含磷酸二酯酶的前列腺作材料。脱脂：脏器中含量较高的脂肪，容易氧化酸败，导致原料变质影响纯度操作和制品的率。常用的脱脂方法有：人工剥去脏器外的脂肪组织；浸泡在脂溶性的有机溶剂（丙酮，乙醚）中脱脂；采用快速加热（50左右），快速冷却的方法，使溶化的油滴冷却后凝聚成油块而被除去。,7,保存：对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存。冰冻：剥去脂肪和筋皮等结缔组织，短期保存：10的冰箱内；长期保存：70低温冰箱内。干燥：对于像脑垂体一类小组织，可置丙酮液中脱水，干燥后磨粉储存备 用；对于含耐高温有效成分（如：肝素）的肠粘膜，可在沸水蒸煮处理，烘干后能长期保存。冰箱的除霜循环，可能对细胞造成伤害，要特别小心。解冻时要越快越好，但避免局部过热。,8,2、植物材料：选材：注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。种子须泡胀或粉碎才可使用。含油脂较多的也要进行脱脂处理。a.提取核DNA：选用黄化苗（生长710天小麦，水稻），防止叶绿体DNA的干扰 b.提取RNA：根据实验目的选用生长幼嫩组织为好。保存：冷冻采样后尽快放于420冰箱内。DNA,RNA 采样后，用液氮速冻，至70冰箱。对RNA样，如不立即使用，冷冻保存尤为重要。,9,3.微生物：选材：应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：利用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等。一般用离心法收集上清液，上清液只能在低温下短期保存 利用菌体含有的生化物质，如：蛋白质，核酸和胞内酶等。需破碎菌体细胞分离，湿菌体可低温短期保存，冻干粉可在4保存数月。3,10,第一节 细胞破碎,细菌细胞结构,细菌细胞壁的主要成分：肽聚糖磷壁酸脂多糖蛋白质等,11,第一节 细胞破碎,细菌细胞结构,12,第一节 细胞破碎,酵母细胞结构,外层：甘露聚糖（约占30%，以-糖苷键联结（并非所有酵母菌都有）内层：葡聚糖（约占30-40%，由D-葡萄糖以-糖苷键联结）中间层：蛋白质（含6-8%，多为酶类）,细胞壁,壁外成分：有些菌壁外含有由多糖构成的类似荚膜的结构。包括异多糖、甘露聚糖和淀粉类物质。,细胞壁的少量组分脂类和几丁质几丁质（chitin)：为聚乙酰氨基葡萄糖几丁质并不是所有的酵母菌中都有，其含量也因种而异。裂殖酵母一般不含几丁质，酿酒酵母含12%，有的假菌丝酵母含量超过了2%。,13,第一节 细胞破碎,植物细胞结构,构成细胞壁的成分中，90%左右是多糖，10%左右是蛋白质、酶类以及脂肪酸等。细胞壁中的多糖主要是纤维素、半纤维素和果胶类，它们是由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸等聚合而成。次生细胞壁中还有大量木质素。,14,第一节 细胞破碎,动物细胞结构,15,第一节 细胞破碎,细胞破碎的方法,酶学破碎法：外加酶制剂、自溶法。机械破碎法：高速捣碎法、高速均浆法、高速磨珠法 物理破碎法：温差法、压差法、超声波 化学破碎法：有机溶剂法、表面活性剂（SDS 等）、金属螯合剂（Mg2+、Ca2+、EDTA）、化学变性剂。,16,第一节 细胞破碎,1.机械破碎：(1)研磨法：剪碎的动物组织如鼠肝、兔肝等置研钵中，用研磨棒研碎。为了提高研磨效果，可加入一定量的石英砂。用匀浆器处理，也能破碎动物细胞。此法较温和，适宜实验室使用。但加石英砂时，要注意其对有效成分的吸附作用。如系大规模生产时，可用电动研磨法。细菌和植物组织的细胞破碎均可用此法。,17,第一节 细胞破碎,(2)组织捣碎器法：用捣碎器(转速8000-10000r/m)处理30-45s可将植物和动物细胞完全破碎。如用其破碎酵母菌和细菌的细胞时，须加入石英砂才有效。但是在捣碎期间必须保持低温，捣碎的时间不易太长，以防温度升高引起有效成分变性。现在多用细胞破碎仪。(3)超声波法：借助声波的震动力破碎细胞壁和细胞器的有效方法。多用于微生物细胞的破碎，一般输出功率100-200W，破碎时间315min。如果在细胞悬浮液中加石英砂则可缩短时间。为了防止电器长时间运转产生过多的热量，常采用间歇处理和降低温度的方法进行。,18,第一节 细胞破碎,2.溶涨和自溶：溶涨：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液如低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，引起细胞膜发生胀破的现象称溶胀。例如红血球置清水中会迅速溶胀破裂并释放出血红素。自溶：细胞结构在本身所具有的各种水解酶如蛋白酶和酯酶等作用下，发生溶解的现象称自溶。应用此法时要特别小心操作，因为水解酶不仅可使细胞壁、细胞膜破坏，同时也可将某些有效成分在自溶时分解。3.化学处理：用脂溶性的溶剂(如丙酮、氯仿、甲苯)或表面活性剂(如十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠)处理细胞时，可将细胞壁、细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放出各种酶类或DNA等物质，并导致整个细胞破碎。,19,第一节 细胞破碎,4.生物酶降解：生物酶(如溶菌酶)有降解细菌细胞壁的功能。在用此法处理细菌细胞时，先是细胞壁消解，随之而来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。例如从某些细菌细胞提取质粒DNA时，不少方法都采用了加溶菌酶(来自蛋清)破坏细胞壁的步骤。当有些细菌对溶菌酶不敏感时，可加巯基乙醇（ME）或者8mol/L的尿素，以促进细胞壁的消化。另外，也可加入蛋白酶K来提高破壁效果。而在破坏酵母菌的细胞时，可采用蜗牛酶进行。一般对数期的酵母细胞对该酶较敏感。将酵母细胞悬于0.1mol/L柠檬酸/磷酸氢二钠缓冲液(pH5.4)中，加入1%蜗牛酶，在30处理30分钟，即可使大部分细胞壁破裂，如同时加入0.2%巯基乙醇效果更好。,20,第一节 细胞破碎,5、压榨法：是一种温和、彻底破碎细胞的方法。用30MPa左右的压力迫使几十毫升细胞悬液通过一个小孔(细胞直径的孔)，致使其被挤破、压碎。6、冻融法：将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下(或40左右)迅速融化。如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀、破碎。,21,第二节 提取,抽提通常是指用适当的溶剂和方法从原材料中把有效成分分离出来的过程。经过处理的原材料中的有效成分可用缓冲液、稀酸、稀碱、或有机溶剂（如丙酮、乙醇）等抽提，有时还可用蒸馏水抽提。一般理想的抽提液应具备下述条件：对有效成分溶解度大，破坏作用小；对杂质不溶解或溶解度很小；来源广泛、价格低廉、操作安全等。,提取的含义,22,第二节 提取,在抽提阶段，pH值、金属离子、溶剂的浓度和极性等因子，可明显影响有效成分的性质和数量。因此选择抽提液必须考虑这些因素。1、pH值：改变溶质解离状态。对蛋白质或酶等具有等电点的两性电解质物质，一般选择抽提液的pH值应在偏离等电点的稳定范围内。通常碱性蛋白质选用低pH值的溶液抽提，酸性蛋白质选用高pH值的溶液抽提，或者用调至一定pH值的有机溶剂抽提。注意：当用酸，碱控制溶液pH值时，要边加边搅，防止局部出现过高的酸，碱浓度造成蛋白变性。,抽提的影响因子,23,第二节 提取,2、溶剂的极性和离子强度：有些生物大分子在极性大、离子强度高的溶液中稳定；有些则在极性小、离子强度低的溶液中稳定。例如提取刀豆球蛋白A时，用0.15mol/L甚至更高浓度的NaCl溶液，都可使其从刀豆粉中溶解出来，稳定存在。而抽提脾磷酸二酯酶时，则需用0.2 mol/L蔗糖水溶液。一种物质溶解度大小与溶剂性质密切相关（相似相溶原理）；离子强度通过影响溶质的带电性也影响溶质的溶解度。降低极性：在水溶液中加蔗糖，甘油，二甲亚砜，二甲基甲酰氨。,抽提的影响因子,24,第二节 提取,提高离子强度：在水溶液中加中性盐（KCl,NaCl,NH4Cl,(NH4)2SO4）一般离子强度较低的中性盐溶液可促进蛋白溶解（盐溶），高离子强度的中性盐可引起蛋白质沉淀，析出（盐析）。高离子强度使DNA溶解度增加；低离子强度使RNA溶解度增加（核酸分离依据）。常用的盐溶液是NaCl溶液，浓度以0.15mol/L为宜。但是在提取核蛋白或细胞器中的蛋白质时，为促使蛋白质与核酸、蛋白质与细胞器分离，则宜用高浓度(0.5-2.0mol/L)的盐溶液。,抽提的影响因子,25,第二节 提取,3、水解酶：细胞破裂后，许多水解酶释放出来。水解酶与欲抽提的蛋白质或核酸接触时，一旦条件适宜，就会发生反应，导致蛋白质或核酸分解，而使实验失败。为此，必须采用加入抑制剂，调节抽提液的pH、离子浓度或极性等方法，使这些酶丧失活性。如：提取，纯化胰岛素时，为阻止胰蛋白酶活化，采用68的乙醇溶液（pH2.5-3.0,用草酸调节），在1315抽提3h，可得到较高的回收率。因为68乙醇可使胰蛋白酶暂时失活，草酸可除去蛋白酶的激活剂Ca2+，酸性环境也抑制酶蛋白活性。,抽提的影响因子,26,第二节 提取,4、温度：一般认为蛋白质或酶制品在低温(如0左右)时最稳定。例如：在生产人绒毛膜促性腺激素(HCG，糖蛋白)制品时，一定要在低温下进行。当温度低于8时，从200公斤孕妇尿中可提取约100克HCG粗品(活力为160u/mg)；当温度高于20时，从400公斤孕妇尿中都提取不到100克粗品，而且活力很低。此外，高温下制备的HCG粗品很难进一步纯化至3500u/mg，原因是高温会使HCG受到微生物和/或糖苷酶的破坏。一般提高温度，溶解度增加，但易使大分子物质变性失活。小分子物质：5070；生物大分子：010，最好控制在04,抽提的影响因子,27,第二节 提取,5、搅拌：搅拌能促使欲抽提物与抽提液的接触，并能增加溶解度。但是，一般宜采用温和的搅拌方法，速度太快时容易产生泡沫，导致某些酶类变性失活。6、氧化：一般蛋白质都含相当数量的巯基，该基团常常是酶和蛋白质的必须基团，若抽提液中存在氧化剂或氧分子时，会使巯基形成分子内或分子间的二硫键，导致酶(或蛋白质)失活(或变性)。在提取液中加入巯基乙醇，半胱氨酸。还原性谷胱甘肽等还原剂，可防止巯基发生氧化，使蛋白，酶失活。,抽提的影响因子,28,第二节 提取,7、金属离子：蛋白质的巯基除易受氧化剂作用外，还能和金属离子如铅、铁或铜作用，产生沉淀复合物。这些金属离子主要来源于制备缓冲液的试剂中。解决的办法：用无离子水或重蒸水配制试剂；在配制的试剂中加入1-3mmol/L的EDTA(金属离子络合剂)。8、抽提液与抽提物的比例：在抽提时，抽提液与抽提物的比例要适当，一般以51为宜。如抽提液过多，则有利于有效成分的提取，但不利于纯化工序的进行。,抽提的影响因子,29,第三节 沉淀分离,1、盐析的原理 定义：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶；而当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析作用。在同一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。原理：盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。,盐析沉淀法,30,第三节 沉淀分离,盐析沉淀法,31,第三节 沉淀分离,盐能够改变蛋白质的溶解度，蛋白质的溶解度与溶液中离子强度有密切关系。两者的关系可用下式表示：lg（S/So）=-KsI S为蛋白质在离子强度为I时的溶解度(g/L)；So为蛋白质在离子强度为0时的溶解度；Ks为盐析常数；I为离子强度。在温度一定的条件下，某一蛋白质在某一pH值的水溶液中的溶解度为一常数So。故上式可 改写为：lgS=lgSo KsI=KsI=lgSo为一常数值主要取决于蛋白质的性质，也与溶液的温度和pH值有关；盐析常数Ks主要与盐的性质(离子价数、平均半径等)和蛋白质的结构有关，Ks越大，盐析效果越好。,盐析沉淀法,32,第三节 沉淀分离,所以对某一蛋白质来说，在温度和pH值等盐析条件确定(即确定)，所采用的盐确定(即Ks确定)以后，蛋白质的溶解度决定于离子强度I,可用下式计算：I=1/2 miZi2 mi:溶液中离子的摩尔浓度 Zi：离子的价数 对于多种蛋白质或酶的混合液，可采用分段盐析法进行分离纯化。,盐析沉淀法,33,第三节 沉淀分离,2.盐的选择：蛋白质的盐析通常采用中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等，其中应用最广的是硫酸铵。硫酸铵是一中性盐，对蛋白质有相当好的安定作用。又因为其离子容积较大，吸走水分子的能力也大，成为有效的盐析工具。硫酸铵在水中的溶解度大而温度的影响小(25时溶解度为4.1mo l/L，即767g/L;0时溶解度为3.7mol/L，即697g/L)，而且价廉易得，不易引起蛋白质变性，分离效果比其他盐好。但是，用硫酸铵盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子会干扰蛋白氮的测定，故有时也要用其他盐来进行盐析。磷酸钾和硫酸钠的盐析系数Ks较大，但由于在较低温度下的溶解度太低,受温度影响大，故应用不广泛。,盐析沉淀法,34,第三节 沉淀分离,3.硫酸铵浓度的计算与调整方法:通常硫酸铵的添加以百分饱和度来表示(不是浓度百分比)，例如大部分蛋白质可在 80%硫酸铵饱和度下沉淀。因为硫酸铵加入的体积很大，会改变最后的总体积，很难由浓度百分比来计算，因此使用百分饱和度作为沉淀蛋白质的度量。,盐析沉淀法,35,用硫酸铵进行盐析时，蛋白质溶液中硫酸铵浓度的调整方法主要有二种：1）、加入饱和溶液法 要求：蛋白质溶液体积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高 V=V0(S2-S1)/（1-S2）V:所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；V0:原溶液体积；S2：所需达到的硫酸铵饱和度；S1:原溶液的硫酸铵饱和度。饱和硫酸铵的配制方法：在一定量的水中加入过量的硫酸铵，加热至5060，趁热滤去沉淀，再在0或室温平衡12天，有固体析出时达100饱和度。,36,第三节 沉淀分离,2）、加入固体盐法 要求：饱和度高，不增大溶液体积 t=G(S2-S1)/（1-AS2）S2，S1:分别代表所需达到的硫酸铵饱和度和原溶液的硫酸铵饱和度；t：将1L S1饱和度的溶液提高到S2饱和度时所需加进的硫酸铵克数；G,A：常数，与温度有关。实际使用时，t可直接查表得到。（注意：0，25两张表，室温用25）,盐析沉淀法,37,第三节 沉淀分离,盐析沉淀法,38,第三节 沉淀分离,盐析沉淀法,4.影响蛋白质盐析的因素：1）、蛋白质浓度 蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2530g/L。2）、离子强度和离子类型的影响离子强度增加，溶解度下降，盐析易发生不同蛋白质盐析时所需离子强度不同，可采用分步盐析，通过逐步增加离子强度，使不同蛋白分步沉淀出来离子强度相同时，高价离子，半径小的离子盐析力强,39,第三节 沉淀分离,盐析沉淀法,3）、pH的影响 大多数蛋白质在等点电时，在盐溶液中的溶解度最低。所以盐析时溶液pH值调到等电点效果最好。4）、温度的影响在低离子强度或纯水中，温度升高，溶解度增加；在高盐溶液中，温度升高，溶解度降低。一般在室温下进行盐析;温度敏感的蛋白质在低温4进行;也有个别酶在低温时失活，高温有活性,如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在25比0时溶解度低，更容易盐析。实际使用：制备初期：pH，温度一定，改变盐浓度（离子强度）（Ks分段盐析）；纯化，结晶：离子强度一定，改变pH，温度（分段盐析）,40,第三节 沉淀分离,盐析沉淀法,5、盐析时的注意事项：添加的硫酸铵的纯度要高，添加后，要放30min以上使其充分溶解，且要不断搅拌，防止局部过浓，发生共沉淀；同一溶液中欲分离几种蛋白质时，可采用分段盐析的方法。盐析通常与等电点沉淀法配合使用。选择好温度，一般在室温下进行；蛋白浓度不易过高，一般2530g/L；低浓度盐析，可用离心分离；高浓度盐析（7080），用过滤（因为粘度大，离心操作慢）；盐析沉淀得到的蛋白质含量较高，纯品需经脱盐处理，如透析，凝胶过滤等。,41,第三节 沉淀分离,等电沉淀法,利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同等电点一这特性，对蛋白质进行分离纯化的方法称为等电点沉淀法。在等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，消除了分子间的静电斥力，但由于水膜的存在，蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。单独使用等电点法主要是用于去除等电点相距较大的杂蛋白。在加酸或加碱调节pH的过程中，要一边搅拌一边慢慢加入，以防止局部过酸或过碱。,42,第三节 沉淀分离,有机溶剂沉淀法,作用机理：（1）降低水溶液的介电常数，使溶质溶解度降低；（2）破坏大分子周围水膜，使溶解度降低。利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离的方法，称为有机溶剂沉淀法。经常使用的有机溶剂是乙醇和丙酮。优点：比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离，分辨力比盐析法好，溶剂也容易除去。,43,第三节 沉淀分离,有机溶剂沉淀法,缺点：有机溶剂沉淀法易使蛋白质和酶变性，所以操作必须在低温条件下进行。蛋白质和酶沉淀分离后，应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度，避免变性。中性盐可减少有机溶剂引起的蛋白质变性，提高分离效果，一般添加0.05mol/L的中性盐。由于中性盐会增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，故中性盐不宜添加太多。有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法联合使用。即操作时溶液的pH值应控制在欲分离蛋白质的等电点附近。,44,第三节 沉淀分离,有机溶剂沉淀法,注意：（1)低温操作（2）样品浓度过大，易变性，共沉淀作用大，分离效果差；过小，易产生变性，回收率低。（3）样品稳定结构范围内，选择溶解度最低处的pH，与等电点共沉淀结合使用。（4)注意离子强度，离子种类的影响。,45,第三节 沉淀分离,选择性变性沉淀法,选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法称为选择性变性沉淀法。例如：利用加热，改变pH或加进某些重金属离子等使杂蛋白变性沉淀而除去。应用此法，应对欲提纯蛋白质和杂蛋白的理化性质有较全面的了解。,46,第三节 沉淀分离,非离子多聚物沉淀法,聚乙二醇（PEG），葡聚糖，右旋糖苷硫酸钠等非离子多聚物可以沉淀蛋白质和细菌。沉淀机理：空间位置排斥效应。试剂溶解度大，在水中占据大部分空间，将需沉淀物相互靠近，增加碰撞机率。优点：（1）操作条件温和，不易引起变性；（2）具有极高的沉淀效率；（3）沉淀后多聚物容易除去。应用：沉淀分离细菌，病毒蛋白；质粒纯化（做洋葱表皮瞬时表达）。,47,第四节 核酸的提取与沉淀分离,核酸类化合物都溶于水而不溶于有机溶剂。所以核酸可用水溶液提取，而用有机溶剂沉淀法沉淀分离。从生物材料中分离出的DNA和RNA，往往是以DNA-蛋白质（DNP）或RNA-蛋白质（RNP）复合物形式存在。因此，要制备初步纯化的核酸时，首先要分离出DNP或RNP，再将复合物解聚，除去蛋白质，然后通过沉淀法得到核酸。,核酸提取与沉淀分离,48,在0.14mol/L的氯化钠溶液中，RNP 的溶解度相当大，而DNP的溶解度仅为在水中溶解度的1%；当氯化钠的浓度达到1mol/L的时候，RNP的溶解度小，而DNP的溶解度比在水中的溶解度大2倍。所以，常选用0.14mol/L的氯化钠溶液提取RNP，而选用1mol/L的氯化钠溶液提取DNP。,49,第四节 核酸的提取与沉淀分离,主要采用加入去污剂、有机溶剂和蛋白水解酶等试剂来实现。去污剂：在破碎细胞的溶液中，加入适量的阴离子去污剂SDS、Triton X-100、Tween 40 和 NP-40 等，有利于膜蛋白和脂肪溶解，将DNP/RNP复合物解聚，进而释放出核酸。有机溶剂：苯酚、氯仿等是蛋白质的变性剂。根据抽提液中蛋白质的含量和溶剂的纯度，用变性剂反复处理抽提液，直到离心后，上层水相（含核酸）和下层有机相之间的界面处无变性蛋白为止。蛋白水解酶：用此法除去复合物中的蛋白质的操作比较温和，常用的水解酶有溶菌酶、蛋白酶,DNP/RNP复合物的解聚,50,第四节 核酸的提取与沉淀分离,采用动物或植物作材料提取核酸时，动物在宰杀前饥饿12h，植物在取材前暗室培养数天，其体内的糖原和淀粉类物质均会减少。混杂于核酸提取液中的多糖类物质，一般可用选择性沉淀剂如异丙醇、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）可达到分离目的。或用等体积的2.5mol/L磷酸缓冲液和等体积的乙二醇甲醚处理，离心后，多糖位于中部，核酸存在上层乙二醇甲醚中。,多糖的消除,51,第四节 核酸的提取与沉淀分离,tRNA(约占细胞内RNA的15%)的相对分子质量较小，在细胞破碎以后溶解在水溶液中，滤液用酸处理，调节到pH5得到的沉淀的中可分离得到tRNA。mRNA占细胞RNA的5%左右，很不稳定，提取条件要严格控制。rRNA约占细胞内RNA的80%，一般提取的RNA主要是rRNA。由于RNA是基因表达过程中非常重要的生物分子，如mRNA携带了DNA为蛋白质编码的信息。RNA的分离是研究基因功能的重要基础之一，在分子生物学中占有重要的地位。RNA的提取方法主要有稀盐溶液提取和苯酚溶液提取。,RNA的提取,52,第四节 核酸的提取与沉淀分离,稀盐溶液提取：将细胞破碎制成细胞匀浆，然后用0.14mol/L的氯化钠溶液反复抽提，得到核糖核蛋白提取液，再进一步与脱氧核糖核蛋白、蛋白质、多糖等分离，可得RNA。苯酚溶液提取：在细胞破碎制成匀浆后，用SDS变性蛋白并抑制RNase活性，经多次酚/氯仿在一定条件下振荡一定时间，抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAc和乙醇沉淀RNA，将RNA与蛋白质分开。,RNA的提取,53,第四节 核酸的提取与沉淀分离,从细胞中提取DNA，一般在细胞破碎后用浓盐法提取。即用1mol/L的氯化钠溶液从细胞匀浆中提取脱氧核糖核蛋白，再与含有少量辛醇或戊醇的氯仿一起振荡除去蛋白质。或者先以0.14mol/L氯化钠溶液(也可用0.1mol/L NaCl加上0.05mol/L柠檬酸代替)反复洗涤除去核糖核蛋白后，再用1mol/L氯化钠溶液提取脱氧核糖核蛋白，经氯仿戊醇(辛醇)或水饱和酚处理，除去蛋白质，而得到DNA。,DNA的提取,54,第四节 核酸的提取与沉淀分离,核酸分离纯化应维持在0-4的低温度条件下，以防止核酸的变性和降解。为防止核酸酶引起的水解作用，可加入十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、8-羟基喹啉、柠檬酸钠等以抑制核酸酶的活性。常用的沉淀分离法有：有机溶剂沉淀法等电点沉淀法钙盐沉淀法选择性溶剂沉淀法,核酸的沉淀分离,55,第四节 核酸的提取与沉淀分离,（1）有机溶剂沉淀法：由于核酸都不溶于有机溶剂，所以可在核酸提取液中加入乙醇、异丙醇或2-乙氧基乙醇，使DNA或RNA沉淀下来。核酸沉淀的形状与其相对分子质量密切相关，相对分子质量106Da的双链DNA可以丝状纤维缠绕在玻棒上；相对分子质量稍小的双链DNA或单链DNA、RNA则以凝胶形式存在，这些核酸经离心后存在于沉淀中，用70%乙醇洗涤，除去其它盐和小分子物质，干燥后即为核酸制品。(2)等电点沉淀法：脱氧核糖核蛋白的等电点为pH4.2；核糖核蛋白的等电点力；tRNA的等电点为pH5。所以将核酸提取液调节到一定的pH，就可使不同的核酸或核蛋白分别沉淀而分离。,核酸的沉淀分离,56,第四节 核酸的提取与沉淀分离,(3)钙盐沉淀法：在核酸提取液中加入一定体积比(一般为1/10)的10%氯化钙溶液，使DNA和 RNA均成为钙盐形式，再加进1/5体积的乙醇，DNA钙盐即形成沉淀析出。(4)选择性溶剂沉淀法：选择适宜的溶剂，使蛋白质等杂质形成沉淀而与核酸分离，这种方法称为选择性溶剂沉淀法。在核酸提取液中加入氯仿/异戊醇或氯仿/辛醇，振荡一段时间，使蛋白质在氯仿/水界面上形成凝胶状沉淀而离心除去，核酸仍留在水溶液中。在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，核酸的苯酚水溶液提取液中，DNA和RNA都进入水层，而蛋白质沉淀于苯酚层中被分离除去。在DNA与RNA的混合液中，用异丙醇选择性地沉淀DNA而与留在溶液中的RNA分离。,核酸的沉淀分离,57,第四节 核酸的提取与沉淀分离,核酸提取注意事项：,尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4-10的条件下进行；减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。机械剪切力包括强力高速的溶液振荡、搅拌，使溶液快速地通过狭长的孔道，细胞突然置于低渗液中，细胞爆炸式破裂以及DNA样本的反复冻贮。高温如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的有些化学键也有破坏作用。防止核酸的生物降解，细胞内或外来的各种核酸酶消化核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构，其中DNA酶，需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，使用EDTA、柠檬酸盐螯合金属二价离子，基本可以抑制DNA酶活性。而RNA酶不但分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱、不易失活，所以是生物降解RNA提取过程的主要危害因素。,58,第四节 核酸的提取与沉淀分离,技术1：基因组总DNA的大量提取 本方法通过液氮研磨粉碎动植物组织、裂解液裂解细胞、有机溶剂抽提，使进入水相的核酸与蛋白成分分开，在RNA酶作用下，降解RNA，得纯度较高的DNA样品。仪器：高速冷冻离心机、台式离心机、恒温水浴、低温冰箱或冰柜、冷冻真空干燥器、取液器、电泳仪、水平电泳槽、紫外分光光度计。试剂：细胞裂解液（100mM Tris-HCl 5mM EDTA 500mM NaCl 1%SDS pH 7.5）；饱和酚；氯仿/异戊醇；异丙醇；70%及无水乙醇；3M NaAC（pH5.2）；RNA酶；TAE缓冲液；载样缓冲液,核酸提取技术,59,第四节 核酸的提取与沉淀分离,操作：动植物材料10g(鲜组织)0.5g(干冻组织),液氮，研碎,10ml裂解液(含1/10体积酚),(65预热),(加入等体积氯仿),(65，30min间隔510min轻摇一次),离心(12000-15000rpm,15min),上清液,(0.6体积冷异丙醇),(0.1体积3MpH5,2乙酸钠）,60,2mlTE(或水)10ulRNase，65,10-30分复溶和除RNA,挑取絮状体,（70%冷乙醇洗涤,真空干燥）,（5000RPM，5min）,等体积酚/氯仿,氯仿抽提,（轻轻混匀、冰浴沉淀5min）,2倍无水乙醇、1/10体积醋酸钠,上清液,第四节 核酸的提取与沉淀分离,61,(10000RPM,10min),(-80，30min),(70冷乙醇洗),沉淀,基因组DNA干粉,(真空干燥),保存：干粉-20保存，或复溶于0.5-1mlTE或水中,分装成小体积,-20或4保存,第四节 核酸的提取与沉淀分离,62,第四节 核酸的提取与沉淀分离,注意:裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解；2.各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解；3.取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰；4.异丙醇,乙醇，醋酸钠，醋酸钾等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀；5.本方法适用于以DNA片段的酶切分析、Southern印迹等中，具有快速、省时、省钱的特点。,63,技术2：细菌质粒DNA的提取法 本方法包括SDS裂解细胞，蛋白酶降解蛋白，CTAB去除多糖成分等内容。仪器：同技术1；试剂：TE、TAE缓冲液；10%SDS；NaCL；20mg/ml蛋白酶；CTAB/NaCL溶液(10%CTAB，0.7M NaCL 4.1gNaCL 溶于80ml水中，缓慢加入10gCTAB，加热溶解)；酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)；氯仿/异戊醇(24：1)；异丙醇；70及100%乙醇,第四节 核酸的提取与沉淀分离,64,1.5ml 对数生长期细菌,100l NaCL(5M)，混匀,30l 10%SDS,3L蛋白酶，混匀,沉淀，溶于500l TE缓冲液中，混匀,(37,1小时),(5000rpm,1min离心),80l的CTAB/NaCL,混匀；65 10min（可不做）,第四节 核酸的提取与沉淀分离,操作：,65,加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液,取上清，以下操作与技术1中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除RNA、复溶等步骤一致,(混匀),(离心12000rpm,4-5min),上清,第四节 核酸的提取与沉淀分离,66,第四节 核酸的提取与沉淀分离,技术3：酵母菌基因组RNA的提取仪器：同技术1；试剂：SE缓冲液（1M山梨醇，0.1M EDTA pH7.5）；溶菌酶（50mg/ml）；20PVP；蛋白酶K缓冲液（10mM Tris pH7.6 0.5%SDS 1mM EDTA）；其余同前,67,1.5ml 对数生长期细菌,溶于590ulSE缓冲液中混匀,(12000rpm,8-10min离心),(12000rpm,1-2min离心),加入1.2ml的CTAB/NaCL,200l20%PVP 混匀,(加入10ul溶菌酶37,1小时),溶于100ulNaCL中混匀,(加入0.5l蛋白酶，37,1小时),第四节 核酸的提取与沉淀分离,操作：,68,等体积酚/氯仿/异戊醇混合液,混匀,(65 30min),(12000rpm,4-5min离心),上清,以下操作与技术1中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除RNA、复溶等步骤一致。,第四节 核酸的提取与沉淀分离,69,为了保证核酸结构与功能的研究，完整的一级结构是最基本的要求，因为遗传信息全部贮存在一级结构之中，核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其它生物大分子结合的方式。对于核酸的纯化应达到以下三点要求：1核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；2其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度；3排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，反之亦然。,第四节 核酸的提取与沉淀分离,