《细胞全能性》课件.ppt

1,绪 论,第五章 细胞培养与 次生产物生产,第四章 植物主要 组织培养技术,第八章 人工种子,第六章 原生质体培养,第二章 细胞全能性 与形态发生,第七章 体细胞杂交,第一章 基本技术,第九章 种质贮藏,第十章 动物细胞工程,第三章 体细胞 遗传变异,2,第二章 细胞全能性与形态发生,细胞全能性及其表达,器官发生,体细胞胚胎发生,3,第一节 细胞全能性及其表达,细胞全能性概述,细胞脱分化,细胞再分化,4,一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力称之为细胞的全能性。细胞全能性的绝对性与相对性:不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的培养反应;即使对于植物细胞而言，细胞全能性也并不意味着任何细胞均可以直接产生植物个体;动、植物细胞全能性的表现程度存在明显的差异。,一.细胞全能性概述,5,植物细胞按照分裂能力分为三类：第一类是始终保持分裂能力，从一个周期进入另一个周期的周期细胞。如茎尖、根尖及形成层细胞；第二类是永久失去分裂能力的细胞，为终端分化细胞。如筛管、导管、气孔保卫细胞等特化细胞；第三类是在通常情况下不分裂，但在受到外界刺激后可重新启动分裂的G0细胞。表皮细胞及各种薄壁细胞。,6,一个植物细胞向分生状态回复过程所能进行的程度，取决于它在自然部位上所处位置和生理状态。,不同类型植物细胞向分生状态回复可能进行的程度趋势,营养生长中心,形成层,薄壁细胞,厚壁细胞,退化细胞,7,植物细胞全能性表现根据细胞类型不同从强到弱:营养生长中心 形成层 薄壁细胞 厚壁细胞(木质化细胞)特化细胞(筛管、导管细胞)；根据细胞所处的组织不同从强到弱为：顶端分生组织 居间分生组织 侧生分生组织 薄壁组织(基本组织)厚角组织 输导组织 厚壁组织。,8,细胞全能性,脱分化,再分化,细胞分裂,个体再生,细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的，在大多数情况下，脱分化是细胞全能性表达的前提，再分化是细胞全能性表达的最终体现。,9,二.细 胞 脱 分 化,细胞生理与结构变化,细胞脱分化调控机理,细胞分裂与愈伤组织形成,10,培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱分化（dedifferentiation）。离体培养下，脱分化过程发生在第一次有丝分裂之前。静止细胞启动分裂是分化细胞成功脱分化的重要标志。,细胞脱分化过程中生理和结构变化,11,薄壁细胞：细胞核较小，核位于细胞边缘，细胞中央有大的液泡，细胞体内核糖体密度较低，多聚核糖体数目较少，质体为分化程度较高的叶绿体、杂色体、白色体和淀粉体。,脱分化细胞：细胞质显著变浓，大液泡消失，核体积增加并逐渐移位至细胞中央，细胞器增加。在这些变化中，液泡蛋白体的出现和质体转变为原质体被认为是细胞脱分化的重要特征。,12,根据脱分化细胞过程中细胞结构发生变化的时空顺序，细胞的脱分化过程可分为3个阶段：第一阶段为启动阶段，表现为细胞质增生，并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白体出现；第二阶段为演变阶段，此时细胞核开始向中央移动，质体演变成原质体；第三阶段为脱分化终结期，细胞回复到分生细胞状态，细胞分裂即将开始。,13,细胞脱分化的调控机理,细胞周期对脱分化的调控,激素诱导表达基因与细胞脱分化,促分裂肽的发现及其对细胞脱分化的影响,细胞脱分化与染色体解凝聚,14,细胞脱分化调控的实质即是G0期细胞回复到分裂周期的调控过程 20世纪70年代，研究者发现在哺乳动物细胞G1期中，存在有特定的调控点，称为“限制点”（R point）。在这个点之前，如果缺少外界生长信号（通常是肽生长因子）或某些必需的营养成分（如必需氨基酸），细胞会终止其G1期的进程，进入静止状态称为G0期，一旦补充了所缺少的因子之后，细胞即会从G0期回到G1期继续分裂周期。,15,2001年度的诺贝尔生理学及医学奖获得者，美国科学家Hartwell与英国科学家Hunt和Nurse的工作揭开了这一过程的调控机制。细胞周期蛋白（cyclin）和依赖周期蛋白激酶(CDK cyclin-dependent kinase)是两类主要的调控分子。细胞周期运行的动力主要来自CDK，其活性则主要通过cyclin调节和依赖周期蛋白抑制子（CKI cyclin-dependent kinase inhibitor）的负调节。,16,Cyclin,Cyclin,Cyclin,p34,CKI,CKI,p34,p34,p34,Cyclin-M,17,18,19,20,植物细胞周期的调控主要有2类CDK（CDKa、CDKb）和2类cyclin（CycB、CycD）。在环境或激素等外界条件作用下，CycD基因首先表达生成CycD，在相关调节因子的帮助下CycD与CDKa结合形成CDKa/CycD复合体使CDKa活化，进而对Rb（G1期限制点调控分子）磷酸化，使细胞通过“限制点”进入分裂周期。当细胞进入分裂周期后，则由CDKb与CycB以及相关的调节蛋白完成从S期到M期的调控。,21,22,植物激素是离体培养中所必需的条件，因此与植物激素相关的基因表达被认为是启动细胞脱分化的关键。Takahashi等（1989）从一个叶肉原生质体cDNA文库中分离到一个2,4-D诱导表达的基因，命名为par(prostate apoptosis response)。par基因在细胞从G0期转入S期的早期启动中具有功能性作用。Kyo等克隆了一组花粉富含硫蛋白(pollen-abundant phosphoproteins)基因(Nicotiana tabacum embryogenic pollen)NtEPa，NtEPb，NtEPc。其中NtEPc的表达与花粉细胞脱分化转变为胚性细胞高度偶联，认为该基因参与花粉细胞培养中细胞脱分化的过程但不参与细胞进入分裂周期后的调控过程。,23,现有研究证明，植物细胞感受生长素的信号是由生长素受体（auxin receptor）和生长素分子相结合，使生长素受体被活化而完成的，这一过程称为生长素感应(perception)。激活的受体可能引起某些特定的反应，如某些离子的吸收或释放、特定蛋白的磷酸化或去磷酸化等，进而引起一系列连锁信号传导反应，最终导致生长素诱导的基因表达。,24,1996年，日本学者Matsubyashi等从石刁柏培养细胞的培养液条件化培养基(conditioned medium，CM)中发现了PSK，它可以促进细胞的生长和增殖。植物磺肽素(phytosulfokine，简写PSK)是一种新型植物肽类生长调节物质。它是两种短肽类物质磺化的四肽(PSK-)或五肽(PSK-)，其结构为H-Tyr(SO3H)-Ile-Tyr(SO3H)-Thr-OH 或H-Tyr(SO3H)-Ile-Tyr(SO3H)-Thr-Gln-OH,25,检测分析发现，在同时有NAA和BA存在的条件下，第一次细胞分裂发生在培养96小时，而培养48小时即可检测到PSK，在培养基没有NAA和BA的培养细胞中，检测不到PSK的存在，同时细胞也停留在G0/G1期而不能启动分裂，由此推测，PSK可能介导了与生长素和细胞分裂素密切相关的信号传导途径,26,-萘乙酸，NAAC12H10O2-Naphthaleneacetic Acid,6-苄胺基嘌呤,BAC12H11N56-Benzylaminopurine,27,进一步研究表明，水稻细胞质膜存在有PSK的蛋白质受体，已分离的蛋白质受体为120kD和160kD的膜蛋白。烟草细胞纯化的120kD蛋白为一受体激酶，含有一个胞外富亮氨酸重复结构域和一个信号转导结构域，与PSK高度亲合，显示PSK和120kD受体激酶是一活跃的配体受体对。过量表达受体蛋白基因，能显著提高愈伤组织生长,28,烟草叶肉细胞脱分化过程中染色体有2次解凝聚过程。第一次解凝聚发生在细胞壁酶解过程中第二次解凝聚发生在原生质体在含有生长素和细胞分裂素的培养基中诱导培养36小时第二次解凝聚对于细胞进入S期是十分重要的，发生二次解凝聚的细胞在培养72小时后即进入S期，在不含植物激素的培养基中细胞，染色体不发生第二次解凝聚，以后迅速死亡。第一次染色体解凝聚是细胞脱分化的转换过程，通过此过程细胞关闭分化状态，而第二次解凝聚则是有丝分裂周期衔接过程。,29,PI fluorescence,30,细胞脱分化与愈伤组织形成,细胞脱分化是细胞状态的改变，但成功的脱分化必然会导致细胞分裂，在一个细胞群体培养或组织器官培养体系中，有时很难区分细胞脱分化与进入增殖状态的界限。对于单个细胞而言，分化细胞启动分裂显然是发生在细胞完全脱分化之后细胞初期分裂方式与外植体细胞类型有关，如果外植体细胞均为正常二倍体细胞，第一次分裂通常是有丝分裂，如果外植体含有高倍化细胞，脱分化的第一次分裂可能是无丝分裂。,31,器官，组织培养时细胞分裂首先发生在伤口部位,培养3天,培养5天,培养7天,32,脱分化与愈伤组织的形成在性质上是不能等同的，脱分化是细胞生理状态的改变，而形成愈伤组织是离体培养中的一个阶段。尽管细胞脱分化后进入细胞分裂的结果，在大多数情况下是形成愈伤组织，但绝不是说所有的细胞脱分化的结果都必然形成愈伤组织，许多试验表明，有些外植体的细胞脱分化以后直接形成胚性细胞进而形成体细胞胚。愈伤组织内的细胞并不是均一未分化的，即同一愈伤组织内的细胞之间其状态存在一定差异，特别是在组织器官培养时，往往出现部分细胞不完全脱分化的现象，从而使其很容易再分化再生植株，这对培养来说无疑是十分有利的。,33,三.细 胞 再 分 化,所谓细胞分化（Differentiation），是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。一个细胞在不同的发育阶段上可以有不同的形态和机能，这是在时间上的分化；同一种细胞后代，由于所处的环境不同而可以有相异的形态和机能，这是在空间上的分化。,34,从分化的遗传控制角度讲，细胞分化是各个处于不同时空条件下的细胞，基因表达与修饰差异的反应，所以，分化也可以说是相同基因型的细胞由于基因选择性表达所反应的各种不同的表现型。在离体条件下，当细胞脱分化以后，无序生长的细胞及其愈伤组织要重新进入有序生长进而才能再生个体，因此，通常把离体培养下的这一过程称为再分化（redifferentiation）。,35,细胞分化与基因组变化,TE分化及其调控,激素在细胞分化中的作用,极性与细胞分化,36,染色体的反复复制DNA的差异扩增 基因重排 基因表达产物及其调控与修饰是细胞分化的本质所在。越来越多的研究显示，细胞分化主要受基因在转录水平和转录后水平的调控，其中一些特异蛋白基因的表达调节在细胞分化过程中起到了重要作用,细胞分化中的基因组变化,37,极性（polarity）是植物细胞分化中的一个基本现象。所谓极性是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。在很多情况下，细胞的不均等分裂是是细胞极性建立的标志。,极性与细胞分化,38,墨角藻(Fucus)合子细胞不均等分裂及其早期发育（引自Bouget等，1998）,极性建立与质膜离子通道的不对称分布和细胞周质微管重排有关,39,通常把离体培养中TE（TE tracheary elements,管状分子）细胞的出现作为组织分化的标志而极性的建立似乎又是维管发生的一个信号，极性建立后生长素按极性方向流动，导致TE细胞分化 由于TE细胞在分化过程中具有细胞壁加厚，原生质体自溶等容易观察的细胞特征，从而又为植物细胞分化研究提供了模式体系,TE的形成与细胞分化,40,百日草叶肉细胞向TE细胞分化的主要调控过程（引自Fukuda，1997）,41,由百日草叶肉细胞分化形成的TE细胞（引自Motose,2001）,42,百日草叶肉细胞向TE分化过程中的基因表达分析（引自Demura等，2002）,43,激素是离体培养条件下调控细胞脱分化和再分化的主要因素，其中生长素和细胞分裂素是两类主要的调控培养条件下细胞生长和分化的植物激素。此外，在有些试验中也显示，GA3、ABA、乙烯等也在细胞分化中起到一定调节作用。,激素对细胞分化的调控作用,44,Gibberellic acid,GA3C19H22O6赤霉素,赤霉酸,920,Abscisic Acid,ABAC15H20O4脱落酸;休眠酸;脱落素;,45,Gibberellic acid,GA3C19H22O6赤霉素,赤霉酸,920,46,1949年，法国植物学家Camus，把一种菊苣小的营养芽嫁接在其根的组织培养物的上表面，几天以后，处于芽下的薄壁细胞中分化出了维管束。这些维管束与芽的维管组织相接在一起。同时，他在愈伤组织表面放置一片玻璃纸，在玻璃纸上再放置芽，切段了愈伤组织与芽之间的直接接触，结果维管组织的分化依然发生。这个试验表明，芽对维管组织的分化有刺激作用，这种刺激作用必然是由一种或几种扩散性的化学物质引起的。,47,在众多植物离体培养中证明，细胞分裂素和生长素对于细胞生长和分化具有同等重要的协同作用，它们的量与比值的不同配合，对细胞分化起着重要调节作用。,48,在离体条件下，如果用生长素和细胞分裂素处理的顺序不同，其作用也不一样。如果先用生长素处理，后用细胞分裂素处理，则有利于细胞分裂而不利于细胞分化；反之，则有利于细胞分化。如果两者同时处理，则可促使分化频率的提高。,49,Dominov等（1992）从一个烟草的悬浮培养细胞系中分离到一个同时可被生长素和细胞分裂素诱导表达到cDNA pLS216(原发性脾脏恶性淋巴瘤)在诱导表达试验中显示，只加入生长素（2,4-D）只引起mRNA短暂积累，而加入外源细胞分裂素（BA）引起的转录积累虽发生时间较迟，但可持续转录，因此他们也认为细胞分裂素可能增加了细胞对生长素的敏感性，或者能阻断生长素的反馈抑制。,50,另一个生长素诱导表达基因是p48h-10。在百日草叶肉细胞培养中，单独使用IAA时，在培养48小时后才检测到p48h-10的表达，而与BA同时使用时，培养24小时即可检测到该基因地表达，只使用BA则不能启动该基因地表达。组织印迹显示，p48h-10只在茎和根的维管束中表达，在分生组织中该基因不表达（Ye和Varner，1994）。这一结果较直接的证明了生长素与细胞分裂素在细胞分化中的协同调控作用。,51,吲哚-3-乙酸(IAA)C10H9NO2 Indole-3-aceticacid,2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)C8H6Cl2O3 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid,52,除了生长素和细胞分裂素外，赤霉酸（GA）、乙烯（EL）、脱落酸（ABA）、油菜素内酯（BR brassinosteroid）等植物激素在细胞分化中的作用也有报道。越来越多的研究显示，植物激素对细胞生长与分化的调控是一个复杂的级联调控过程，离体培养条件下，由于外植体细胞所处的生理状态不同以及内源激素水平的差异，试图寻找外源激素水平在分化中作用的共同模式可能是很困难的。,53,油菜素内酯;芸苔素内酯;24-表-芸苔素内酯;2,3,22R,23-S-四羟基-21R-甲基-高-7-氧杂-5胆甾烷-6酮;C28H48O6 BR(brassinolide;Brassins;Brassinosteroid;R-epibrassinolide),54,细胞脱分化和再分化是离体培养过程中细胞全能性表现的基本过程，了解这一过程的调控机理，最终是为再生个体奠定基础。生物个体形成是通过形态发生（morphogenesis）实现的，建立在离体培养基础上的形态发生称之为体细胞形态发生（somatic morphogenesis）。体细胞形态发生过程及其调控机理是细胞工程学研究的核心内容。,55,第二节 器官发生,植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根（adventitious roots）、不定芽（adventitious shoots）等器官的过程。,56,器官发生方式,器官发生过程,起始材料对器官分化的影响,激素对器官分化的调控,光照对器官分化的影响,器官分化的基因调控,57,器官发生方式,58,经过愈伤组织的器官发生,不经过愈伤组织的器官发生,器官发生过程,59,经过愈伤组织的器官发生过程,愈伤组织形成,生长中心形成,器官原基及器官形成,60,愈伤组织形成,61,生长中心形成,62,芽形成,63,64,不经过愈伤组织的器官发生,在有些情况下，外植体不经过典型的愈伤组织即可形成器官原基，这一途径有两种情况：一是外植体中已存在器官原基，进一步培养即形成相应组织器官进而再生植株，如茎尖、根尖分生组织培养。另一种情况是外植体某些部位的细胞在重新分裂后，直接形成分生细胞团，然后由分生细胞团形成器官原基。这种不经过愈伤组织直接发生器官的途径在以品种繁殖为目的的离体培养中具有重要的实践意义。,65,茎尖培养中芽形成,外植体直接发生芽,66,67,外植体的类型,母体植物的遗传基础,起始材料对器官分化的影响,68,总体上说，被子植物比裸子植物容易培养，在被子植物中又以茄科、秋海棠科、景天科、苦苣苔科以及十字花科植物培养成功的报道最多。通常情况下，自然繁殖以无性繁殖为主的植物在培养条件下也有较强的器官分化的能力 同种植物不同品种（基因型）的培养效果具有较大差异已是不争的事实。基因型对于培养反应的差异，器官分化能力的差异大于愈伤组织诱导的差异。,69,不同基因型大豆上胚轴器官分化能力,70,玉米不同自交系幼胚培养器官分化能力,71,外植体对诱导反应及其再生能力的影响体还现在生理状态上来源于生长活跃或生长潜力大的组织、器官的细胞更有利于培养对于多年生植物而言，以幼嫩组织为材料无论是诱导还是分化均较容易。一、二年生无性繁殖植物的取材则可塑性较大，但仍以自然繁殖器官为外植体更易成功。,72,外植体选取合理与否，不仅影响培养的难易，而且有时甚至影响分化的程度和器官类型。,花芽,营养芽，花芽,营养芽,Tran Thanh Van等，1974,73,激素对器官发生的影响,离体培养下的器官分化在大多数情况下是通过外源提供适宜的植物激素而实现的。在众多的植物激素中，生长素与细胞分裂素是2类主要的植物激素，在离体器官分化调控中占有主导地位。GA3,PSK在器官分化中也具有一定调控作用。,74,生长素/细胞分裂素高 有利于根分化生长素/细胞分裂素低 有利于芽分化生长素与细胞分裂素必须协调使用才能再生正常个体,75,离体培养中，外源激素在细胞内的吸收和代谢影响到激素的活性从而影响其培养效果。外源细胞分裂素被外植体吸收后，在细胞内被修饰和转化形成活化形式和钝化形式。一般认为，细胞分裂素自由碱基形式是活性形式，而核苷形式为钝化形式。通过细胞分裂素氧化酶对侧链的修饰可能是植物组织细胞中降低细胞分裂素活性的主要机制，在烟草细胞培养中使用二氢玉米素比使用玉米素更为有效，可能与二氢玉米素核糖苷不是细胞分裂素氧化酶的底物有关。,76,生长素进入细胞后，一部分以游离状态存在，另一部分则与氨基酸结合形成生长素氨基酸复合体。与生长素结合的氨基酸主要为天门冬氨酸，也有谷氨酸。2,4-D、NAA、IAA是常用的3种生长素，。Ribnicky等（1996）的研究显示，由于生长素种类不同，形成生长素-氨基酸复合体的量具有显著差异，从而亦表现出作为外源生长素在培养效果上的差异。,77,外源生长素在胡萝卜上胚轴培养细胞中的总量和游离生长素含量*,*引自Ribnicky等1996。,78,光照是离体培养中比较复杂的调节因子，光照时间、强度以及光质队器官分化均有影响。,光照对器官分化的影响,79,连续的光照有利于培养细胞维管组织的形成，而一定的昼夜光照周期则有利于极性建立和形态发生。培养条件下，光照的作用更大程度上是调节细胞的分化状态，而不是合成光合产物。光照对器官发生的调节可能与调节培养物的内源激素平衡有关，光照还可能影响生长素的信号转导系统，调整生长素的极性运输，从而引起器官分化。光质对器官分化的影响可能与光受体精确调节系统有关。,80,基因调控,homebox,细胞周期基因,其它,81,Kn1（KNOTTED1）是从玉米中鉴定出的第一个植物homebox基因，Kn1-like homebox（knox）基因又可分为2组（classI和classII），classII knox在各种分化组织器官中均表达，而class I knox只在分生组织中表达。在玉米和大麦离体培养中，大量不定芽生成的部位也检测到Kn1基因的大量表达。在一些转Kn1相似基因地研究中表明，转基因植株能大量产生复合芽以及不定分生组织。STM（SHOOTMERISTEMLESS）基因以及它们的直系同源（orthologues）基因均参与了茎尖分生组织的分化调控。在转Homeobox相关基因的烟草植物中还检测分析到赤霉素含量减少和生长素含量上升的内源激素变化，这也暗示，Homeobox基因可能通过一些调节因子（如激素）介导调控器官分化。,82,植物编码细胞周期依赖性激酶基因cdc2在离体培养中，调节细胞进入分裂状态的过程起着关键性作用，在玉米和大麦离体培养中，cdc2的表达高峰发生在不定芽形成的过程中，在培养初期的表达量较少，同时，该基因的表达部位处于分生组织的外层细胞，因此认为，cdc2基因对分生组织的形成和维持分生组织状态均有重要作用。,83,Banno等（2001）从拟南芥根培养再生芽的体系中克隆了一个增强芽再生能力的基因ESR1，将该基因与35S启动子连接转化拟南芥，在有细胞分裂素存在的情况下转基因外植体可以显著提高不定芽的分化率。而生长素不能诱导该基因表达，同样也不能提高不定芽分化频率。,84,从烟草温度突变体中鉴定出3个与离体器官发生有关的基因SRD1、SRD2和SRD3，当它们发生隐形突变时，在离体培养中表现出器官发生在不同时期受阻，3个基因均定位于拟南芥I号染色体上。,85,Low等（2001）通过RT-PCR技术克隆了一个含有亮氨酸拉练基因bZIP（PKSF1），该基因编码一个亮氨酸拉链转录因子，其表达发生在芽形成之前，在有不定芽形成的愈伤组织中其表达量比非分化愈伤组织高6倍,86,第三节 体细胞胚胎发生,离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。这一定义有以下几方面的界定：其一，体细胞胚是离体培养的产物，只限于离体培养范围使用，以区别于无融合生殖胚；其二，体细胞胚起源于非合子细胞，以区别于合子胚；其三，体细胞经过了胚胎发育过程，以区别与离体培中器官发生形成个体的途径。,87,体细胞胚的形成,体细胞胚的发育与结构特点,影响体细胞胚发生的因素,体细胞胚发生的生化与分子基础,88,一.体细胞胚的形成,89,体细胞胚从外植体上直接发生,1.诱导阶段,2.胚胎发育阶段,90,经过愈伤组织的体细胞胚形成,经过悬浮细胞的体细胞胚形成,间接发生,91,诱导愈伤组织形成,愈伤组织胚性化,球性胚形成,子叶胚期,92,93,体细胞胚发育的细胞学特点,体细胞胚的结构特点,二.体细胞胚的发育与结构特点,94,类似于植物合子胚的发育,95,类似于动物胚胎早期的发育,96,结 构 特 点,与器官发生形成个体的途径相比，体细胞胚发育再生植株有两个明显的特点：一是体细胞胚具有双极性（doulble polarity）；二是体细胞胚形成后与母体的维管束系统连系较少，即出现所谓的生理隔离（physiological isolation）现象。,97,与合子胚比较：合子胚在发育初期具有明显的胚柄，而体细胞胚一般没有真正的胚柄只有类似胚柄的结构。合子胚的子叶是相当规范的，可以作为分类的依据，体细胞胚的子叶常不规范。与相同植物比较体细胞胚的体积明显小于合子胚，在一些贮藏物质的含量上也存在较大差异。并且，体细胞胚不能有明显的脱水干燥过程。合子胚在胚胎发育完全进入子叶期胚以后，经过一系列的物质积累和脱水就进入休眠，而体细胞胚则直接形成植株，在不同的培养条件和植株种类中，形成植株的胚胎时期有所不同，一般在心形期以后的各个阶段均可直接发育成小植株。,98,三.影响体细胞胚发生的因素,激素的调控作用,培养基及培养条件的影响,基因型的影响,99,2,4-D是应用最为广泛的生长素。2,4-D的应用有着规律性的变化，首先是在较高浓度下诱导胚性细胞的形成，然后在降低2,4-D的浓度下产生早期胚胎，一般在球形胚形成后，除去生长素有利于体细胞胚的继续发育。现有研究证明，在球形胚期形成的生长素极性运输对于体细胞胚的进一步发育尤为重要，如果球形胚阻断生长素的极性运输或改变生长素的极性运输方向，均会影响体细胞胚的正常发育。,激素的调控作用,100,细胞分裂素对体细胞胚发育的影响研究报道较少，但几乎所有的有关体细胞胚胎发生的培养基配方中，均有细胞分裂素的配合使用。细胞分裂素在促进细胞分裂，维持细胞活跃生长中具有重要生理功能，而完成体细胞胚胎发育细胞分裂是基本前体，当胚胎结构建立后，细胞分裂素对于维持分生组织正常发育具有重要作用。,101,培养基中的氮源亦会显著影响离体条件下的胚胎发生，据Halperin和Wetherell的报道，体细胞胚的产生要求培养基中含有一定浓度的还原态氮。Vesco和Guerra在Feijoa(非油果,凤榴)植物体细胞胚诱导的试验也证明，培养基氮源影响体细胞胚的发生频率。在NH4+和NO3-(1534)的培养基中，每个外植体的体细胞胚可达10个以上，而培养基只有NH4+或NO3-时，体细胞胚发生频率很低。一些氨基酸可以代替还原态氮的作用，上述Feijoa植物的体细胞胚培养体系，在只含NO3-的培养基中，如果加入4mM的甘氨酸，可以显著提高体细胞胚的发生频率。,培养基及培养条件的影响,102,一些体细胞胚规模生产模式的试验还发现，球形胚形成后，如果降低培养基无机盐浓度，可以显著促进体细胞胚的进一步发育。Choi等（2002）在西伯利亚人参（E.senticosus）培养中证明，在体细胞胚培养后期，降低培养基无机盐浓度，可显著提高体细胞胚的成苗率。在一些试验中还发现，体细胞胚发育后期降低蔗糖浓度，也有利于胚的继续发育和提高体细胞胚的成苗率。,103,Lee等（2001）在改进胡萝卜体细胞胚生产程序的试验中，将胚性愈伤组织转入减少浓度的MS培养基中诱导体细胞胚，结果显示，当胚性愈伤组织形成后，在只含1/2MS无机盐浓度的培养基中，体细胞胚形成可以比在MS培养基中高3-4倍。,104,Choi等（2002）在西伯利亚人参(E.senticosus)培养中也证明，在体细胞胚培养后期，降低培养基无机盐浓度，可显著提高体细胞胚的成苗率。,105,马铃薯不同基因型体细胞胚形成能力比较,基因型的影响,106,内源激素,调控基因,特异蛋白,四.体细胞胚胎发生的生化与分子基础,107,外源生长素的对体细胞胚产生和发育的调控是通过调节内源激素的合成、代谢、极性运输和平衡而起作用的。Ribnicky等在胡萝卜上胚轴培养中证明，体细胞胚形成初期细胞内具有较高浓度的游离态生长素，外源2,4-D和NAA比IAA诱导体细胞胚效果好，体细胞胚诱导初期，细胞内高浓度的游离生长素是必要条件，直接添加外源IAA对其合成有反馈抑制，从而也影响体细胞胚的形成，而2,4-D对IAA的合成不存在反馈抑制，其结果也提高了体细胞胚的发生频率。水稻胚性细胞的诱导也证明，高浓度的2,4-D引诱导细胞内IAA含量升高，当加入外源IAA或阻止细胞内IAA渗出而提高细胞内IAA含量时，均可促进胚性愈伤组织形成。,内源激素,108,胡萝卜胚发育过程中内源IAA的变化,内源激素,109,生长素不仅影响体细胞胚的早期发生，同时也影响体细胞胚的后期发育。生长素对体细胞胚后期发育的影响是通过极性运输实现的。在合子胚的发育中，这种极性运输严重影响胚形态的建立。Liu等（1993）利用拟南芥幼胚培养体系，揭示了生长素极性运输由球形胚期得轴向对称转向心形胚期的两侧对称的过程，如果这一过程受阻，则导致子叶异常发育成筒状子叶，而不是正常的2个子叶。在生长素极性运输突变体pin1中证实了上述结果，已克隆的pin同源基因研究显示，生长素的极性运输及其对胚胎发育的调控，是一系列胚胎发育相关基因有序表达到结果。,内源激素,110,有关体细胞胚形成中蛋白质含量和组分的变化，尽管不同研究在绝对含量上不尽相同，但总体趋势均表现出体细胞胚形成过程中水溶性蛋白明显增加。李中奎等（1993）比较水稻胚性与非胚性愈伤组织的蛋白质含量变化显示，两种愈伤组织蛋白质含量的差异主要表现为胚性愈伤组织的水溶性和盐溶性蛋白高于非胚性愈伤组织，而醇溶性蛋白则低于非胚性愈伤组织。,特异蛋白,111,水稻不同愈伤组织（干重）可溶性蛋白质含量（g/mg）,特异蛋白,112,伴随体细胞胚发育的特异蛋白,特异蛋白,113,阿拉伯半乳糖蛋白（AGPs）是植物中广泛存在的糖蛋白，大多数AGPs存在有Ala-Hyp重复序列或类似重复序列，暗示AGPs可能作为调控蛋白调控某些基因的转录。在细胞中，AGPs主要分布在细胞壁和质膜上，利用一系列单克隆抗体已鉴定出一些与特殊发育相关和特殊组织相关的AGPs，其中与单克隆抗体JIM8抗体结合的AGPs在油菜中主要存在性细胞中、胚胎发育早期的胚柄中。在胡萝卜体细胞胚发育中，这种抗体检测的AGPs存在于胚性细胞和早期体细胞胚中，在非胚性细胞中没有AGPs，如果在一些非胚性悬浮细胞系中加入这类AGPs，则可使其恢复胚胎发生能力，显示AGPs在植物体细胞胚发生过程中起到了调控作用。,特异蛋白,114,近年来的研究发现，某些病程相关蛋白可能也与体细胞胚的形成有关。van Hengel（1998）在胡萝卜悬浮培养细胞衍生的原生质体培养诱导体细胞胚过程中，随着体细胞胚的形成在培养基中检测到几丁酯酶（chitinases）和AGPs的积累；Dubois等（1991）在菊芋的体细胞胚诱导中发现，-1,3-葡聚糖酶（-1,3-glucanases）与愈伤葡聚糖降解有关，推测该酶可能与体细胞胚形成有关。Helleboid等（2000）在菊芋悬浮细胞培养中比较了胚性和非胚性细胞蛋白质组分差异，结果显示，胚性细胞中3种不同组分（38kD、32kD、25kD）的蛋白质显著高于非胚性细胞。进一步分析显示，这些组分的蛋白质主要是-1,3-葡聚糖酶、几丁酯酶和渗透相似蛋白（osmotin-like protein）。,特异蛋白,115,胡萝卜体细胞胚形成相关的部分基因,调控基因,116,从已鉴定的基因表达时序分析，可分为3类：第一类是涉及到胚性细胞转变和体细胞胚早期形态建立的基因，如ECP31、ECP40、EP2、EP3、DC9.1、EF1-a等，这类基因对体细胞胚的早期发育极为重要，一些突变体分析显示，当这些基因突变时，则体细胞胚不能正常形成。第二类是体细胞胚胎的整个发生和发育过程中始终表达到基因，有的甚至持续到再生植株，如Gea31。第三类就是与体细胞胚发育过程有关的基因，如DC8、DC59、DC3、EMB-1、DC2.1、DC7.1、Gea41等，在此类基因中，不同基因在胚胎发育的不同时期其表达强度和表达顺序亦有差异，如EMB-1、Gea41和DC7.1只在球形胚至心形胚期间表达，而DC8和DC59只在心形胚期间表达。,调控基因,