《核酸化学》课件.ppt

第五章 核酸的化学,Nucleic Acid Chemistry,第五章 核酸的化学,第一节 核酸的化学组成 第二节 核酸的分子结构 第三节 核酸的理化性质 第四节 核酸的分离和含量测定,核酸的发现和研究工作进展,1868年 Fridrich Miescher从脓细胞中提取“核素”1944年 Avery等人证实DNA是遗传物质1953年 Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构1968年 Nirenberg发现遗传密码1975年 Temin和Baltimore发现逆转录酶1981年 Gilbert和Sanger建立DNA 测序方法1985年 Mullis发明PCR 技术1990年 美国启动人类基因组计划(HGP)1994年 中国人类基因组计划启动2001年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架,遗传病 遗传物质发生改变或由致病基因 所控制的疾病,遗传病特征 具有垂直传递和终身性特征.具有由亲代向后代传递的特点.是指致病基因的传递.父母的生殖细胞携带的致病基因,通过生殖把 致病基因传给下一代表现家族性,基因疗法,基因治疗遗传病是一种根本的和有希望的方法。人类的遗传物质可以向别的生物借用即向有基因缺陷的细胞注入正常基因，以达到治疗目的。基因治疗 首先找出缺陷基因，同时制备出相应的正常基因，然后将正常基因转入细胞内替代缺陷基因，并表达正常 研究和探索阶段之中。现阶段 遗传病“表现型治疗”方法，只能消除一代人的病痛，致病基因将一如既往，传递给子孙后代。,第一节 核酸的化学组成,基本元素组成：C、H、O、N、P P的含量比较稳定，占9%-10%，核酸含量:测定P的含量来推算（定磷法）,分子量 RNA：几万几百万 DNA：1.61062.2109,核酸的分布,核酸的化学组成,核苷酸组成核酸分子的基本单位。核苷 核苷酸 戊糖 磷酸,碱基,嘧啶碱(pyrimidine)：,（一）、核苷酸中的碱基组成,嘌呤碱(purine)：,I,X,稀有碱基,稀有碱基,假尿嘧啶,二氢尿嘧啶,次黄嘌呤,（二）、戊糖与核苷,戊糖(pentose)：,OH,核苷(nucleoside),“稀有核苷”是由“稀有碱基”生成,几种稀有核苷,核苷酸的结构与命名,核苷酸(nucleotide)核苷与磷酸脱水缩合生成磷酸酯类；磷酸基缩合的位置不同而分别生成：2-核苷酸、3-核苷酸和5-核苷酸最常见的核苷酸是5-核苷酸（5常被省略）。,5-核苷酸的分子结构,核苷一磷酸,2-d-3-ADP,环化核苷酸,环一磷酸腺苷 环一磷酸鸟苷,核苷多磷酸:含有两个或两个以上磷酸基团的核苷酸,各种核苷三磷酸 在体内能量代谢中的作用：,ATP能量“货币”,UTP参加糖的互相转化与合成,CTP参加磷脂的合成,GTP参加蛋白质和嘌呤的合成,第二信使cAMP,重要的核苷酸衍生物 几种重要的辅酶,NAD 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADP 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸FAD 黄素腺嘌呤二核苷酸CoA 辅酶ACoA-SH 还原型辅酶A,-H2O,核苷酸通过3,5-磷酸二酯键相连形成的线形结构,一、核酸的一级结构,第二节 核酸的分子结构,C,G,A,书写方法,5 pApCpTpGpCpT-OH 3,5 A C T G C T 3,线条式,文字式,二级结构：两条单链DNA通过碱基互 补配对形成的双螺旋结构。DNA的碱基组成（Chargaff法则）碱基当量定律 A+G=T+C,二、DNA的二级结构,碱基互补配对：A=T G C,DNA双螺旋结构模型（double-helical structure）,1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构。,1、双螺旋结构模型的要点,（1）DNA分子由两条相互平行但走向相反的脱氧多 核苷酸链组成，一条链的方向 5 3，另一条链的方向 3 5,（2）碱基叠于螺旋内侧，与纵轴垂直，磷酸与脱氧核糖在外侧，形成DNA的骨架。糖环平面 与中轴平行 与碱基环平面成90角,0.34nm,2nm,直径,（3）螺旋直径约为2 nm，相邻两碱基间距离为 0.34nm,夹角为36螺距：10对核苷酸/圈 高度：3.4nm/圈表面：大沟及小沟相间,3.4nm,大沟与小沟是蛋白质识别DNA的碱基序列，与其发生作用的基础。,两条链沿同一轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。,2、稳定双螺旋结构的力?,（1）碱基堆集力 碱基之间的疏水作用力 内部形成强大的疏水区,与介质中的水分子隔开，有利于碱基间氢键形成。（2）氢键 碱基对之间;DNA外侧的氧 与介质中的水 或蛋白质上的-OH（3）离子键 磷酸基团上的负电荷与介质中的阳离子之 间形成离子键，减少双链间的静电排斥力。,问题：碱基配对的化学基础？,碱基对 由于几何形状的限制，只能由嘧啶和嘌呤配对才能使碱基对合适地安置在双螺旋内。若两个嘧啶配对则几何形状太小，两个嘌呤配对则几何形状又太大，为双螺旋所容纳不下。只有A-T碱基和G-C碱基对的几何形状正适合双螺旋的大小。,大沟和小沟 由于碱基对的方向性，使得碱基对占据的空间是不对称的，因此在双螺旋的表面形成二个凹下去的槽，一个槽大些，一个槽小些分别称为大沟和小沟。,问题：DNA双螺旋为什么有大沟小沟的空间构型？,Watson DNA双螺旋结构（B型）,3双螺旋的多态性,不同DNA纤维的空间结构,A-DNA和B-DNA之间可以相互转换，转录时，DNA分子发生BA的转变。,Z-DNA螺旋：左手的DNA螺旋，这种螺旋可能在基因表达或遗传重组中起作用。,三种DNA双螺旋构象比较,Z-DNA,在多核苷酸链中，脱氧核糖的五元环能折叠成多种构象。此外，CN糖苷键以及 3、5磷酸二酯键旋转都可以使具有同样碱基配对的DNA双螺旋可以采取另一些构象，DNA构象上这种差异称为多态性。,DNA空间结构多态性产生的原因？,在多聚嘧啶和多聚嘌呤区段，局部形成三股螺旋。,DNA三股螺旋（H-DNA）,该螺旋常处于真核细胞基因的表达调节区。,镜像重复序列,镜像重复序列,DNA的三股螺旋常处于双螺旋的大沟中,四链DNA：可能存在于真核细胞染色体的端粒中。,.稳定DNA的结构，保持生物遗传特性的相对连续性。.很容易对损伤进行修复，一条多核苷酸链受损后，可以根据碱基配对原则进行修复，这也使遗传特征保持稳定。,双螺旋结构的生物学意义,三、DNA的三级结构:超螺旋（supercoil）,在二级结构的基础上，进一步扭曲形成的超螺旋。,螺旋,线状DNA形成的超螺旋,闭环DNA的超螺旋形式，如 细菌质粒DNA、病毒DNA、噬菌体DNA、线粒体DNA。,闭环超螺旋结构,紧密，体积更小；能影响双螺旋的解链程序，影响DNA分子与其它分子之间的相互作用。,超螺旋的意义?,答案：压缩分子空间,真核生物染色体由DNA和蛋白质构成，其基本单位是 核小体(nucleosome)。,核小体组成：DNA 约200bp 组蛋白 H1H2A，H2BH3H4,举例：DNA超螺旋结构在染色质中的组装,核小体的结构,核心颗粒,2分子（H2A,H2B,H3,H4）构成八聚体，,DNA缠绕其外旋转1.75圈，约含140bp,核小体结构,核小体纤维：核小体再螺旋形成染色体：核小体纤维再螺旋形成,从双螺旋DNA到染色体，DNA总共压缩了约800010000倍,真核生物染色体DNA组装不同层次的结构,DNA(2nm),核小体链(11nm，每个核小体200bp),纤丝(30nm，每圈6个核小体),突环(150nm，每个突环大约75000bp),玫瑰花结(300nm，6个突环),螺旋圈(700nm，每圈30个玫瑰花),染色体(1400nm,每个染色体含10个玫瑰花200bp),DNA的功能,载体遗传信息的载体，DNA的基本功能。模板为遗传信息复制以及基因信息的转录提供。基因 DNA分子中具有特定生物学功能的片段。基因组 一个生物体的全部DNA序列称为。,四、RNA的种类和分子结构,rRNA占总量80%tRNA最小RNA占总量15%mRNA占总量3-5%,在蛋白质合成中起模板作用；,在蛋白质合成时起着携带活化氨基酸的作用。,核糖体是蛋白质合成的场所；,RNA的种类、分布、功能,RNA的结构,一单链形式存在，局部可有二级或三级结构。较DNA分子小:小者数十个核苷酸组成，大者数千个核苷酸组成 一级结构 RNA 二级结构 三级结构,RNA一级结构：AMP、GMP、CMP、UMP 3、5磷酸二酯键连成线形分子。,RNA二级结构：单链RNA自行盘绕，形成局部双螺旋 多“茎”、多“环”结构 螺旋部分“茎”或“臂”，非螺旋部分“环”。,（一）tRNA：转运氨基酸,一级结构单链小分子，含7393个核苷酸,含 1020%稀有碱基，如 DHU 沉降系数在4S左右.5 端总是磷酸化，且常是pG。3 端为CCAOH。,氨基酸臂 7对bp组成，末端含-CCAOH DHU环 8-12个核苷酸反密码环 由7个核苷酸组成额外环 3-18个核苷酸组成 T环 7个核苷酸,氨基酸臂,tRNA的二级结构 三叶草形,反密码环识别mRNA上的密码,DHU环辨认并结合氨基酰tRNA合成酶,T环识别并结合核蛋白体,额外环 大小不一 是tRNA分子 分类的指标,氨基酰tRNA,tRNA的三级结构：,进一步折叠扭曲形成倒L型结构，利于携带氨基酸的tRNA进入核糖体的特定部位。,额外环:其功能是在tRNA的L型三维结构中负责连接两个区域（D环反密码子环和TC-受体臂）。,氨酰-tRNA合成酶,识别氨酰-RNA合成酶的位点：倒L结构中 参与此作用核糖体识别位点：倒L结构中 TC环与此有关。,DHU环反密码环氨基酸臂,关于tRNA,（二）mRNA的结构,单链 大部分有突环形二级结构.分子量 几百2万个核苷酸不等，变化大。mRNA占细胞RNA总量的1%5%，代谢活跃，一级结构的研究带来一定困难。,原核和真核生物mRNA的结构不同分别讨论,顺反子：遗传学上将编码一个多肽的遗传单位称顺反子,先导区+翻译区（多顺反子）+末端序列,原核生物 mRNA的结构,原核生物mRNA结构特点：,1、多顺反子（polycistron）:一分子mRNA带有几种蛋白质的遗传信息，可以作为几种蛋白质的模板，能翻译出几种蛋白质。2、一般没有修饰碱基。,每种顺反子是一个特异的翻译区；每个翻译区与核蛋白体之间有一个独立的结合部位；各个翻译区之间借一段无编码功能的核苷酸序列相连；5 端、3 端有非编码区。,真核生物 mRNA的结构,5端有帽子结构（m7GTP）3端有尾巴结构(polyA,20200个A)有修饰碱基（甲基化)5非编码区有翻译起始信号：AUG,“帽子”+单顺反子+“尾巴”,结构特点,帽子结构,帽子结构m7G-5ppp-N-3 p,帽子功能：1.有抗5-核酸外切酶的降解作用，以增加mRNA的稳定性2.与蛋白质合成的正确起始作用有关；帮助核糖体与mRNA结合，使翻译 在AUG（起始密码子）处开始,5,5,聚A尾的功能：保护mRNA，免受核酸外切酶的作用。与mRNA从细胞核到细胞质的转移有关 与翻译有关，没有polyA翻译活性降低。新合成 聚A尾长 衰老的 聚A尾短,*mRNA的功能:抄录、模板功能,（三）、rRNA的结构与功能,rRNA是细胞中含量最多的RNA，占总量的80%rRNA与蛋白质一起构成核蛋白体（核糖体），蛋白质合成的场所，种类和大小用S表示。,在原核生物中，16S的rRNA参与构成核蛋白体的小亚基，5S和23SrRNA参与构成核蛋白体大亚基。,在真核生物中，18S的rRNA参与构成核蛋白体小亚基，其余的rRNA参与构成核蛋白体大亚基。,核糖体的组成,rRNA的二级结构,特征：单链，螺旋化程度较tRNA低 与蛋白质组成核糖体后方能发挥其功能,5sRNA的二级结构,大肠杆菌16S rRNA的二级结构,rRNA的结构研究,原核生物 16SrRNA 3端有一保守序列ACCUCCU，是mRNA的识别结合位点。5SrRNA 4347位核苷酸为CGAAC序列，可与tRNA上 GCTG互补。真核生物 5.8SrRNA上 也有相同的CGAAC序列,是与tRNA相互识别、相互作用的部位,rRNA的主要作用,具有肽酰转移酶的活性；提供结合位点 为tRNA(A位、P位和E位)；为多种蛋白质合成因子选择性地结合mRNA 在蛋白质合成起始时、肽链延伸中；核糖体大小亚单位的结合、校正阅读等作用。,细胞不同部位中其他种类的小分子RNA的统称主要包括 核内小RNA（snRNA）核仁小RNA（snoRNA）胞质小RNA（scRNA 催化性小RNA（ribozyme）小片段干涉 RNA（siRNA）,小非RNA(small non-messenger RNAs,snmRNAs),(四)、其他小分子RNA,snmRNAs的功能:参与hnRNA（核内的初级mRNA称为不均一RNA）和rRNA的加工和转运。,HnRNA：真核细胞转录生成mRNA的前体。,RNA组学研究：主要对snmRNA的种类、结构与功能的研究,不均一RNA,反义RNA（调节RNA）,与mRNA配对结合，抑制mRNA作为模板进行翻译。作为DNA复制的抑制因子，与引物RNA互补结合抑制DNA复制，在转录水平上与mRNA5端互补，阻止RNA合成转录。,碱基序列与有意义mRNA互补的RNA,作用,人工合成反义RNA，调节基因的表达,用于疾病治疗。,领头链(leading strand),随从链(lagging strand),DNA的半不连续复制,冈崎片段,RNA引物,第三节 核酸的理化性质,一、一般理化性质 1.晶形 DNA为白色纤维状固体；RNA为白色粉末状固体 2.溶解性 均溶于水；不溶于一般有机溶剂，在70%乙醇中形成沉淀；在0.14MNaCl 和 12MNaCl中 DNA-蛋白 溶解度低 溶解度高 RNA-蛋白 溶解度高 溶解度低 3.粘度 DNA粘度很大 RNA粘度小得多 4.旋光性 均很强,5.密度及沉降特性,密度：RNA双链DNA；环状DNA 开环、线状DNA单链DNA 双链DNA 沉降速度：RNA 环状DNA 开环、线状DNA,二.核酸的紫外吸收,260nm处吸收最强定量测定的基础,1.DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于:50g/ml双链DNA 40g/ml单链DNA（或RNA）20g/ml寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品:OD260/OD280=1.8 RNA纯品:OD260/OD280=2.0,OD260的应用：,核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性 具有两性电离的性质。但磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其pI偏酸性。DNA pI 45，RNA pI 2.02.5，在pH78电泳时泳向正极。,三、核酸的两性电离与等电点,四、DNA的变性、复性与分子杂交,DNA变性：指DNA分子双螺旋结构解链为无规则线 性结构。DNA变性的本质：氢键断裂，碱基间的堆积力遭 到破坏，但不涉及一级结构的改变。导致DNA变性的因素：加热、极端的pH、有机试 剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等.,（一）DNA变性(denaturation),DNA的变性过程,部分双螺旋解开 无规则线团 链内碱基配对,加热,变性DNA的特征：,溶液粘度降低：无规则单股线性结构旋光性发生变化：分子的对称性及构型改变 紫外吸收增强:双螺旋解开，碱基外露，紫外吸收增强。,增色效应指DNA变性后 紫外吸收明显增强的效应.,DNA的变性温度Tm,熔解温度(Tm):热变性过程中A260达到最大值一半时的温度.,DNA变性曲线,1.与GC所占总碱基数的百分比成正相关，(G+C)%=（Tm-69.3）2.44(经验公式),2.与核酸分子的长度有关，核酸分子越长，Tm 值越大(仅对相对较短的核酸分子)；3.与离子强度有关：离子强度较低时，Tm较低，熔点范围也较宽，反之亦然。,Tm值的影响因素,(二)DNA的复性与分子杂交,DNA复性(renaturation)在适当条件下，变性DNA的两条互补链恢复天然的双螺旋构象。,减色效应:DNA复性时，其溶液OD260降低。,退火(annealing):热变性DNA经缓慢冷却后可复性的过程。,热变性的DNA在复性过程中，碱基序列部分互补的不同的DNA-DNA之间或DNA-RNA之间形成杂化双链的现象。,核酸分子杂交(hybridization)：,变性,复性,复性,核酸分子杂交,探针技术,DNA探针RNA探针寡核苷酸探针探针50300bp为宜,带有一定标记的已知顺序的核酸片段称为探针（probe）,标记物 放射性同位素标记物 125I，3H，14C，32P，35S 32P和35S使用频率高。非放射性标记物 生物素、2-乙酰胺二苯丙茂，地高辛配体,核酸分子杂交的应用研究DNA分子中某一种基因的位置确定两种核酸分子间的序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存在与否是基因芯片技术的基础,探针技术在遗传性疾病诊断应用,地中海贫血或血红蛋白病,半乳糖血症,苯丙酮尿征,预习酶和维生素章节,谢谢,