环境毒理学常用实验方法.ppt

环境毒理学常用实验方法,急性毒性实验蓄积性毒性实验亚慢性和慢性毒性实验致突变试验致畸试验致癌试验,毒理学 实验基础,实验动物（laboratory animal）经人工培育，对其携带微生物实行控制，遗传背景明确，来源清楚，可用于科学研究的动物。温血动物(恒温动物)兔、豚鼠、大鼠、小鼠 有时也用猴、狗、猫等,实验动物的选择,狗,小鼠,大鼠,豚鼠,仓鼠,实验动物的选择,种属的选择 个体选择 年龄 体重 性别 生理状态 健康状况,实验动物的选择,种属的选择 机体反应上尽量近似于人体；易获得、易饲养、易管理；最敏感、最合适；选用几种不同种属的动物(对毒作用不清楚的化学物质)；借助已有毒理学研究资料选择。,实验动物的选择,借助已有毒理学研究资料选择 气体、蒸气对粘膜的刺激作用猫 毒物对皮肤的局部作用豚鼠或兔(皮肤对刺激物的反应近似于人)过敏性反应豚鼠(易于致敏)观察致呕吐作用的实验研究狗、猫 外界环境因素引起机体体温过高及体温过低的反应兔或猫(大鼠、小鼠对于体温调节不稳定)高血压病理狗、兔、大鼠(易出现血压变化)物质的致癌作用小鼠和大鼠 慢性中毒损害实质性脏器的毒物小鼠(实质性脏器容易罹患病变),个体选择,年龄 除特殊要求外，动物年龄一般选用初成年者。性别 根据目的，若对动物性别无特殊要求，宜选用雌雄各半。生理状态怀孕、哺乳 通常实验均不宜采用处于特殊生理状态的动物进行，为了某种特定的实验目的除外。健康状况 所用动物进入实验室后，于实验开始前应观察一周以上，以删除不健康的动物，并使实验动物适应环境。,实验动物的选择,常用染毒途径和方式,(1）经口 灌胃、喂饲、吞咽胶囊（2）经呼吸道 动物自行吸收（静式吸入染毒、动式吸入染毒）人工动物气管注入（3）经皮肤（4）其它途径 注射途径,常用染毒途径和方式,(1)经口染毒 灌胃 用灌胃器将所应投给动物的药灌到动物胃内；直接灌入胃内，不与口腔及食道接触；给予的化学物剂量准确。喂饲 将化学物溶于无害的溶液中拌入饲料或饮用水中，使动物自行摄入含化学物的饲料或水，然后依每日食入的饲料与水再推算动物实际摄入化学物的剂量。,常用染毒途径和方式,(1)经口染毒 优点：接触化学物的方式符合人类接触污染食物与水的方式，方法简便、易操作。缺点 进食时浪费、损失饲料多，摄入的量不准确；如果化学物有异味，动物可能拒食；如果化学物在室温下可以挥发，或在饲料中和水中可以水解，则剂量也不准确；有经呼吸道与皮肤交叉吸收的可能；更适宜进行多日染毒，急性毒性试验一般不用之。,(1)经口染毒 吞咽胶囊 将所需剂量的受试化学物装入药用胶囊内，强制放到动物的舌后咽部迫使其咽下。此法剂量准确，尤其适用于易挥发、易水解和有异臭的化学物。兔、猫及狗等较大动物可用此法。,常用染毒途径和方式,（2）经呼吸道染毒 凡是气态或易挥发的液态化学物均有经呼吸道吸入的可能，在生产过程中形成气溶胶的化学物也可经呼吸道吸入。类型:动物自行吸收 静式吸入染毒 动式吸入染毒 人工动物气管注入 人工动物气管注入将液态或固态外源化学物注入肺内。这是一个手术过程，仅适用于制造化学物对肺脏损伤模型的制备，而不用于一般毒性研究。,常用染毒途径和方式,静式吸入染毒 在一定容积的染毒柜内加入一定量受试物，造成含一定浓度受试物的空气环境，使受试动物在规定时间内,经吸入而达到染毒，适用于短时间染毒的试验。动式吸入染毒 采用机械通风为动力，连续不断地将含有已知浓度受试物的新鲜空气送入染毒柜内，并排出等量的污染气体，使染毒浓度保持相对稳定，这样可使染毒时间不受染毒柜(室)容积的限制，也可避免动物缺氧、CO2积聚、温度增加等对试验结果的可能影响，适用于较长时间以及反复染毒的试验使用。,常用染毒途径和方式,（3）经皮肤染毒 液态、气态和粉尘状外源化学物均有接触皮肤的机会。能经皮肤吸收的化学物主要以扩散方式经过皮肤角质层屏障，在表皮角质细胞的间质中充满非极性的脂类物质。脂溶性化学物主要通过这种途径渗透入皮肤，角质层薄的皮肤部位更易吸收。,常用染毒途径和方式,实验前详细检查去毛部位皮肤有无擦伤、红肿、皮疹等异常现象，剔除不合格动物。染毒时按单位体重确定给予所需毒剂的容量。接触时间应与人实际接触该物质的时间相仿。,常用染毒途径和方式,成年动物年老动物表皮厚度、细胞成分改变为保证不因皮肤部位不同而形成的化学物渗透率差异，一般大鼠、豚鼠、兔均使用背部皮肤。面积则依据选用动物及受试物的剂量和剂型而定。（如家兔可取5cm6cm、豚鼠取3cm4cm、大鼠取1.5cm2.0cm直径的面积，小鼠取1.0cm1.5cm直径的面积。）,（3）经皮肤染毒,（4）其它途径染毒 有时需对外源化学物进行绝对毒性或比较毒性研究，或进行一些必要的特殊研究(如静脉注射毒物动力学、代谢研究、急救药物筛选等)，往往用注射途径染毒。静脉注射:大鼠、小鼠尾静脉，兔耳缘静脉 注射途径 肌肉注射 皮下注射 腹腔注射:小动物,常用染毒途径和方式,动物实验的一般操作方法,急性毒性试验,一、急性毒性的概念,急性毒性是指机体(人或实验动物)一次或24h之内多次接触(染毒)外源化学物之后，在短期内所发生的毒性效应，包括引起死亡效应。一次：瞬间染毒，如经口染毒、经注射途径染毒，但在经呼吸道与经皮肤染毒，则是指在一个特定的期间内持续地接触化学物的过程，“一次”含有时间因素。多次：当外源化学物毒性过低，或一次染毒剂量受机体容量限制，需给予实验动物较大剂量时，则可在24h内分次染毒。,二、急性毒性试验的目的 探求化学物的致死剂量，以初步评估其对人类的可能毒害的危险性；求该化学物的剂量-反应关系，为其它毒性实验打下选择染毒剂量的基础。,表示急性毒性大小：LD50,急性毒性试验,三、急性毒性试验的内容（1）急性毒性测定 确定一次染毒的 LD50或LC50；（2）经皮肤染毒实验 考察受检化学物质能否经皮肤进入体内，LD50；（3）局部作用实验 通过使受检化学物质直接接触皮肤及眼结膜等试验，研究其对生物体局部有无刺激、腐蚀及其他危害作用。,急性毒性试验,三、急性毒性试验的内容（4）中毒症状的观察 据染毒动物症状及体征，粗略了解毒物作用的程度和可能作用部位。（5）功能及病理组织学检查 选择必要的功能指标，寻求毒作用剂量与功能改变的关系，确定急性阈剂量；通过病理组织学检查，进一步了解毒作用部位及毒害程度。,急性毒性试验,四、哺乳动物的急性毒性实验（一）半数致死量(LD50、LC50)的测定1.动物准备一般采用小动物，如小鼠、大鼠、豚鼠等。实验动物应预先观察7天左右，以了解其健康情况及正常活动状态。正式实验时，按随机分组原则分组，一般分成56个实验组(必要时备对照组)，每组510只动物(小鼠多用10只)。,急性毒性试验,四、哺乳动物的急性毒性实验（一）半数致死量(LD50、LC50)的测定2.剂量选择先查阅文献中与受试物的类似物LD50或LC50；以3倍之差的三个剂量组进行预实验，每组3只动物，求出动物全活、全死剂量；在预试验的全活全死剂量之间设56个剂量组，各组间剂量差距常按等比级数1.21.5设计。,急性毒性试验,四、哺乳动物的急性毒性实验（一）半数致死量(LD50、LC50)的测定3.药液配制及染毒给药的剂型溶解性水溶液、混悬液、油剂或乳剂在非吸入染毒实验中，多按单位体重给予等容量药液的方法给药，可以保证不同剂量组动物接受相同容量的药液。如配制实验用液中用到新溶剂、新助剂，或实验终结时需作病理组织学观察时，则应有对照组。,急性毒性试验,四、哺乳动物的急性毒性实验（一）半数致死量(LD50、LC50)的测定4.症状观察染毒开始后应观察并记录实验动物的中毒表现、生理状况变化和死亡情况。观察时间可确定为几小时、几天、一周或两周，但一般不超过二周（二周内）。,急性毒性试验,急性毒性试验,四、哺乳动物的急性毒性实验（一）半数致死量(LD50、LC50)的测定5.病理学检查观察器官是否有血、出血、水肿或其他变化，并对有变化的脏器作病理组织学检查。对存活动物在观察期满后也应做病理学检查。6.结果评价计算半致死剂量或浓度：确定绝对致死剂量或浓度、最小致死剂量或浓度和最大耐受剂量或浓度。急性毒性进行评定：与同系物或其他毒物比较，与毒性分级比较分析。,急性毒性试验,四、哺乳动物的急性毒性实验（二）急性阈剂量的测定 急性阈剂量指毒物经一次染毒后对机体产生不良作用的最小剂量，是用于评价毒物非致死性损害的参数。,急性毒性试验,四、哺乳动物的急性毒性实验（二）急性阈剂量的测定 1.观察指标的选择 应根据毒物和实验动物的特性采用不同的生理、生化及形态学的指标。（1）对于新化学物质，首先选用整体状态及非特异性作用指标，如活动能力、应激状态、条件反射等。（2）对于毒作用特点比较清楚的毒物，可选择该毒物作用引起最敏感反应指标，如有机磷农药可选胆碱酯酶活性变化。（3）对于刺激性气体和蒸气，可测定其刺激阈浓度或嗅觉阈浓度。,急性毒性试验,四、哺乳动物的急性毒性实验（二）急性阈剂量的测定 2.实验方法（1）游泳试验主要是通过观察动物的活动能力，揭示不同剂量的毒物对机体体力影响的程度，是研究阈剂量(或浓度)的常用指标。实验动物一般用小鼠或大鼠。记录每只动物自放入水中至口鼻沉没到水下5秒钟的时间，即游泳时间。在游泳过程中记录游泳速度、运动姿势等。比较染毒组与对照组游泳时间和速度以及游泳姿势上的差异并进行评价。,急性毒性试验,四、哺乳动物的急性毒性实验（二）急性阈剂量的测定 2.实验方法（2）刺激阈试验刺激性气体或蒸汽，对上呼吸道、眼睛和口腔等器官的黏膜会产生局部刺激作用，通过观察毒物在不同浓度下引起的刺激症状，可找出毒物引起刺激症状的最低浓度，即阈浓度。实验动物多用猫。观察指标除一般刺激症状，如流泪、流涕、等以外，主要观察动物的流涎出现的时间及严重程度。将50以上动物出现“有少量唾液流到口唇周围”以上程度的刺激症状的最小浓度作为阈浓度。,急性毒性试验,四、哺乳动物的急性毒性实验（三）局部作用试验 用于研究一些化学物质引起接触的皮肤和黏膜的症状，如炎症和烧伤。1.急性皮肤刺激/腐蚀试验为了确定化学物质对哺乳动物的皮肤是否具有刺激或腐蚀作用。选用白色豚鼠或家兔作为实验动物。观察涂抹部位的皮肤反应，对刺激作用给予全面完整的评价。,急性毒性试验,四、哺乳动物的急性毒性实验（三）局部作用试验 2.急性眼睛刺激/腐蚀试验结膜囊染毒试验。试验常选用家兔或豚鼠为实验动物。将受试化学物0.1mL滴人一侧眼结膜囊内，用手将眼睑压住，使闭眼几秒钟，另一侧眼滴生理盐水作对照。记录滴药后1h、12h、24h、48h、72h和96h的局部反应，如充血、水肿、流泪、怕光、角膜、结膜和眼球损害的程度以及恢复的时间等。以规定的间隔时间观察刺激或腐蚀作用的程度，同时作进一步描述以便对刺激作用给予全面、完整的评价。,急性毒性试验,五、水生动物毒性实验 一些水生生物对水质变化很敏感，反应显著。因此，在环境毒理实验中常用水生生物作为实验动物，特别在制订污水排放标准时，常进行水生生物的急性毒性实验。鱼类、甲壳动物、藻类毒性实验等方法。,急性毒性试验,鱼类毒性实验1.实验用鱼的选择必须具有一定区域代表性，便于在实验条件下饲养，对化学物质较为敏感。短期试验多采用我国的青、草、鲢、鳙四大养殖淡水鱼，一般体长7cm。较长期的试验多采用金鱼，一般在3cm以下，体长最长不应超过最小体长的1.5倍。选择行动活泼、体色光泽、鱼鳍完整舒展、逆水性强和食欲好的健康鱼，在实验室内观察一周后使用。,急性毒性试验,鱼类毒性实验2.实验条件实验容器采用玻璃缸或白搪瓷桶，其盛水量以每条鱼23L水为宜。水的pH值为6.78.5，冷水温度为1218，温水温度为2028，水温变化为2。水中溶解氧不能低于4 mg/L，可用清洁的河水、湖水或放置3d以上的自来水。,急性毒性试验,鱼类毒性实验3.半数耐受浓度的测定半数耐受浓度或半数存活浓度的测定试验设计与哺乳动物的LD50测定基本相同。先通过预备试验确定100致死浓度和不引起死亡的最大浓度，然后以此浓度范围，按l(0.65-0.9)的等比级数确定5-7个浓度组，另加一空白对照组，每组10-20尾鱼，染毒48-96h。染毒开始头8h经常观察，以后可作24h、48h、72h、96h的定期观察，记录中毒反应及死亡时间。死亡鱼立即取出剖检。试验期间水环境(DO、pH、水温)稳定。根据24h、48h、96h各组鱼的死亡数，按LD50计算方法，求出相应时间的TLm。,急性毒性试验,鱼的急性毒性实验设计,设计有机磷农药乐果对鱼的急性毒性实验,六、发光细菌急性毒性试验基本原理：发光细菌在干净水体中发光恒定，当受到污染物影响时，发光受到抑制，受抑制的程度与水体中毒物的总体浓度及毒性大小有关，故用发光光度计测定其发光强度，即可评估该水样的毒性。,急性毒性试验,梨形四膜虫(原生动物)毒性试验进行药物、有机物、无机物及水污染物毒理学评价蚯蚓急性毒性试验土壤环境毒理学试验的标准动物两栖类动物毒性试验两栖类动物对水体污染物的敏感性比其他动物更高禽、鸟类急性毒性试验食物链、对化学品的安全性评价,急性毒性试验,蓄积毒性实验,蓄积毒性实验,蓄积毒性作用低于中毒阈剂量的外来化合物，反复多次地与机体持续接触，经一定时间后使机体出现明显的中毒表现。进入速度机体消除速度不断累积毒性作用阈剂量,蓄积毒性实验,蓄积毒性作用 环境污染物在体内的蓄积作用的过程，表现为：物质蓄积：污染物不断进入机体，其吸收量排出量，以致在体内的贮留量增多；功能蓄积：不断进入机体内的环境污染物，反复作用机体，引起机体一定结构或功能的变化，并逐渐累积加重，最后导致出现损害作用。相对的区分，同时存在，互为基础,蓄积毒性实验,蓄积毒性作用环境污染物在体内的蓄积作用，是引起亚慢性和慢性毒性作用的基础。常是评估环境污染物毒性作用的指标之一；制定其在环境中的卫生标准的重要参考依据。阐明污染物有无蓄积作用及其程度有重要意义。,蓄积毒性实验,一、试验方法（一）蓄积系数法 固定剂量每天连续染毒法 剂量定期递增染毒法（二）20天蓄积试验法（三）生物半减期法,一、试验方法（一）蓄积系数法（cumulative coefficient method）分次给受试物后引起50%受试动物出现某种毒效应的总剂量（LD50(n)表示）与一次给受试物后引起50%受试动物出现同一毒效应的剂量（以LD50(1)表示）的比值，即,蓄积毒性实验,蓄积作用强度分级,蓄积毒性实验,一、试验方法（一）蓄积系数法试验方法固定剂量每天连续染毒、剂量定期递增染毒先按常规方法测定受试动物的LD50或ED50，此即LD50(1)或ED50(1)；然后另取动物进行LD50(n)或ED50(n)的测定。试验动物通常是大鼠和小鼠。,一、试验方法（一）蓄积系数法1.固定剂量每天连续染毒法固定剂量1/10-1/20LD50每天染毒一次观察死亡情况LD50(n)5个LD50时，若动物死亡数未超过半数，K5，表明蓄积作用不明显。如果染毒过程中动物相继死亡，记下受试动物出现半数死亡时的累计的染毒总剂量，按上述计算蓄积系数。分次染毒剂量为1/20 LD50时，实验时间可长达100天，分次染毒剂量为1/10 LD50时，实验还可长达50天。,蓄积毒性实验,2、剂量定期递增染毒法：以4d为一期，开始第一期每天染毒剂量为1/10 LD50，随后染毒剂量每隔4d按1.5倍递增一次。定期递增染毒剂量*表(注：表中的递增染毒剂量*为LD50)染毒日期（天）每日染毒剂量 每4天染毒总剂量 累计染毒总剂量 14 0.10 0.4 0.4 58 0.15 0.6 1.0 912 0.22 0.9 1.9 1316 0.34 1.4 3.3 1720 0.50 2.0 5.3 如果连续染毒已达20d，此时染毒的总剂量已累计达到5.30倍的LD50，受试动物中出现某种毒性效应或死亡的动物数未达到50%，则表示该受试物的蓄积毒性不明显，试验可以终止。如受试物在试验过程中，相继出现的某种毒性效应或死亡的动物数累积达到50%，即可计算出蓄积系数并可对蓄积毒性强度作出评估。,蓄积毒性实验,一、试验方法（二）20天蓄积试验法实验处理实验动物：大鼠或小鼠按LD50的1/20、1/10、1/5、l/2及0(溶剂对照)随机分成5组，每个剂量组雌雄动物各10只每天对动物进行染毒1次，连续20天，各组总剂量分别为1LD50、2LD50、4LD50、10LD50。观察停药后7天内的死亡情况。,蓄积毒性实验,一、试验方法（二）20天蓄积试验法结果评价若1/20LD50组有死亡，且各剂量组有剂量-反应关系，则有较强蓄积性；如1/20LD50组未出现死亡，则认为无明显的蓄积性。,蓄积毒性实验,一、试验方法（三）生物半减期法生物半减期（T1/2）指一种外来化合物在体内消除到原有浓度(或量)的一半所需要的时间。生物半减期越长的物质，表示越不易由体内消除，其蓄积作用的可能性就越大。测定生物半减期较为复杂，实际观测中常常仅以间接测定其在血液、尿液或器官组织中的浓度（或量）降低一半所需的时间，以代表该物质的生物半减期。,蓄积毒性实验,一、试验方法（三）生物半减期法方法机体接触受试物后，在一定时间的间隔内，分别测定血液或尿液、器官组织中该物质的浓度(或量)，依据所得结果按下式求出它的生物半减期。生物半减期(T1/2)=(t2t1)log2/(log y1log y2)式中：y1和y2分别为给受试物后在t1和t2时间取样测定的该物质的含量。根据测定生物半减期长短，判定受试物的蓄积毒性大小。,