植物细胞工程课件第六章植物细胞次生产物生产.ppt

植物细胞次生产物生产,第六章,细胞工程电子课件,华中农业大学生命科学技术学院,自然条件下植物次生代谢产物积累特点,培养系统的建立,培养细胞的次生代谢及产物积累,植物细胞培养的应用潜力,主要内容,6.1 自然条件下植物次生 代谢产物积累特点,次生产物的主要类型次生产物在植物体内的积累特点重要的植物资源,6.1.1 次生产物的主要类型,按照用途主要分为色素、香精、药物和酶等；按照分子结构包括生物碱、类黄酮、香豆素、蒽醌、萜类、甾体、蛋白质和多肽等化合物。,已知的植物次生代谢产物大约有100 000 种，并且每年大约还有4 000 种新的化合物被发现。植物次生代谢物质中含有许多药用成分，现代药物中大约有25%来自于植物。,色素：类胡萝卜素：从胡萝卜、单冠毛菊、薄荷、蔷薇、万寿菊等植物的愈组织中提取。叶黄素：从胡萝卜、薄荷、蔷薇、万寿菊中提取。生物碱：麻醉药品：如从颠茄根愈伤组织中提取的莨菪烷、莨菪碱和从茎愈伤组织中提取东莨菪烷。降压药：从鸭脚树种子愈伤组织中提取的利血平。甾体：激素类药品：如性激素、可的松中的核皂甙元和从薯蓣愈伤组织中提取的地奥皂甙元。,植物次生代谢的概念是1891年由Kossel明确提出的，现代植物生理学根据代谢活动与细胞生命活动的关系，将植物代谢分为初生代谢和次生代谢。,6.1.2 次生产物在植物体内的积累特点,植物初生代谢及其产物是维持细胞生命活动必需的，初生代谢受阻将直接影响植物的生长和发育。而次生代谢及其产物一般认为关非细胞生命活动所必需。,次生代谢产物是一类小分子有机化合物，其分布具有种、属、器官、组织以及发育阶段的特异性。次生代谢产物虽然是由初生代谢物衍生而来，但与初生产物相比，产量上更加有限。次生代谢物只能由特定时期的特化细胞合成，与初生代谢物由全株或整个器官中获得相比起来，其提取、纯化更加困难。,在15%的陆地植物中已发现5000多种生物碱，分布在150多个科中，如：夹竹桃科、罂粟科、茜草科、茴香科和茄科等。蒽 醌广泛公布于植物界，主要的科有：蓼科、鼠李科和茜草科等。挥发性石油醌仅在约20个科目的高等植物中发现，如凤仙花科、毛毡苔科等。,6.1.3 重要的植物资源,树脂主要分布于艾菊属、阿魏属、桉树、柑橘、茴香属等。乳胶主要分布于木瓜属、大戟属植物中。类固醇广泛分布在单子叶植物中，如：百合科、石蒜科和薯蓣属，及双子叶植物中，如：玄参科和茄属。,特殊味道和颜色的次生代谢物分布在含精油类植物：如豆蔻、丁香、柑桔、薄荷，或含不可挥发性类脂的精油类植物：如红辣椒、胡荽、香菜、肉豆蔻和芹菜，或含刺激成分的植物:如辣椒、生姜、胡椒，或含色素的植物：如姜黄，或含氨基酸的衍生物的植物：如洋葱、大蒜、咖啡、可可等。,表1 植物来源的次生代谢物,没药,胡黄连(玄参科),颠茄,毛曼陀罗,莨菪（茄科）,烟草 茄科,银杏（银杏科）,人参（五加科）,罂粟（罂粟科）,宁树(楝科),吐根(茜草科),洋地黄(参科),叶下珠(大戟科),萝芙木(夹竹桃科）,芸香（芸香科）,狗牙花（夹竹桃科）,6.2 培养系统的建立,植物细胞的获取,悬浮系的建立与细胞的同步化,6.2.1 植物细胞的获取,外植体的选择与预处理从外植体直接分离植物细胞通过愈伤组织诱导获取植物细胞,6.2.1.1 外植体的选择与预处理,一、外植体的选择用于直接分离植物细胞的外植体，必须选择适当生长期的健康植株，并选择细胞之间粘连程度较小的植物组织、器官。幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体。叶片组织是直接分离单细胞的最好材料。,（一）消毒处理（二）其它处理,二、外植体的预处理,预培养黑暗处理低温或高温处理萎蔫处理抗氧化剂处理高渗透压处理,6.2.1.2 从外植体直接分离植物细胞,机械捣碎法 方法：先将叶片等外植体轻轻捣碎，然后通过过滤和离心分离细胞。优点：获得的植物细胞没有通过其它物质作用，不会受到伤害；不需要经过质壁分离，有利于生理和生化研究。缺点：由于受到机械的作用，细胞结构会受到一定的伤害，获得完整的细胞团或细胞数量少，其使用不普遍。,利用果胶酶、纤维素酶等处理，分离出具有代谢活性的细胞。注意：该法不仅能降解中胶层，还能软化细胞壁。必须对细胞给予渗透压保护。,酶解法,愈伤组织的要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。,6.2.1.3 通过愈伤组织诱导获取植物细胞,6.2.2 悬浮系的建立与细胞的同步化,细胞悬浮培养系统的建立悬浮细胞的生长动态细胞同步化,悬浮培养(suspension culture)是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交换，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作，生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供了技术基础。,6.2.2.1 细胞悬浮培养系统的建立,一是增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；二是在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害；三是振荡培养可以适当改善气体的交换。,悬浮培养与固体培养比较有三个优点：,悬浮系的建立与继代培养,悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在3050个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般23天甚至更短时间便可增加一倍。,成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：,良好的悬浮细胞系状态,显微镜下细胞系的细胞状态,6.2.2.2 悬浮细胞的生长动态,根据不同培养时间的细胞数变化，或细胞重量变化，即可构成该培养体系的基本参数。生长速率（p）一般通过不同时间细胞密度（x）的自然对数与起始密度（x0）的自然对数之差与培养时间（t）的比来衡量。p=（lnx lnx0）/t 单位体积的细胞重量测定细胞生长情况。细胞重量采用鲜重和干重来衡量。一般鲜重只能反应细胞的生长情况，而干重则在一定程度上反应了细胞质量。鲜重和干重的测定方法比较简单，只需按一定体积取样，经真空过滤后称重即可得到鲜重，然后在80 条件下烘干细胞至恒重即可获得细胞干重。,起始愈伤组织的质量接种细胞密度：接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长，悬浮细胞的起始密度一般在0.52.5105个细胞/毫升，低于这一密度则会使细胞生长延迟。培养条件：方式、温度、继代周期,影响悬浮细胞生长的因素：,6.2.2.3 细胞同步化,细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚并进入不同程度的分化状态，因此，要达到完全同步化对于植物细胞培养来讲是十分困难的。,也正是因为同一培养体系的植物细胞通常并不能处于同一细胞周期，这种差异使悬浮细胞的分裂、代谢以及生理生化状态等更趋复杂化。通过一定的理化措施可以使同一体系中的细胞达到相对同步化。,饥饿法：饥饿也是调整细胞同步化的方法之一。在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期，当在培养基中加入所缺乏的成分或者将饥饿细胞转入完整培养基中继代培养时，则细胞分裂又可重新恢复。,饥饿导致的细胞分裂受阻常常是使细胞不能合成DNA，即不能进入S期，或细胞分裂不能进行，即不能进入M期。因此，通过饥饿法可以获得处于G1和G2期的同步化细胞。研究显示，当细胞处于氮饥饿时，通常获得G1期的同步化细胞，当细胞处于磷和碳饥饿时，则获得G1和G2期的同步化细胞（Chawla，1999）。,抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期G1期的同步化细胞。常用抑制主要有5氟脱氧尿苷（5-flouorodeoxyuridine，FudR）和羟基尿（hydoxyurea，HU）。,通过抑制剂获得的同步化细胞基本处于同一个细胞周期，在除去抑制剂后可以不进行分选直接培养，用羟基尿处理获得同步化细胞的方法在小麦、玉米、西芹等植物细胞培养中均有成功应用。,分选法：通过细胞体积大小分级是直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中，从而可能保持相同培养体系中的细胞具有较好的一致性。这种方法的优点是操作简单，不影响细胞活力。精细度较差。,常规细胞分选定方法是采用梯度离心的方法。流式细胞仪的使用可以大大提高分选效率和精确程度，但由于仪器的昂贵和操作的复杂性的限制，这一技术短期内很难普遍使用。,低温处理：冷处理也可以提高培养体系中细胞同步化的程度。Okamura等曾采用此途径使胡萝卜悬浮细胞较好的同步化。梅兴国等（2001）采用6低温处理红豆杉细胞也获得较明显得同步化效果。,6.3 培养细胞的次生代谢及产物积累,培养条件下的植物细胞次生产物积累特性提高细胞次生产物产量的途径次生产物生产实例,6.3.1 培养条件下的植物细胞次生产物积累特性,根据植物细胞生长与产物合成的关系可分为三大类型:,产物合成与细胞生长成正比。如长春花属植物中的长春花碱的合成、烟草细胞的烟碱合成、薯蓣属植物中的薯蓣皂甙的合成等；,产物仅在细胞生长下降时合成，细胞处于指数生长期或停止生长产物都不合成。蒽醌类物质合成的植物细胞，托品类生物碱类合成的植物细胞等属于此类型；,产物合成在细胞生长停止以后。如紫草宁的合成。,中间型,非生长偶联型,生长偶联型,植物细胞生长于次生产物积累的相关性（引自Endress R，1994）,6.3.2 提高细胞次生产物产量的途径,1选择适宜的起始材料,起始培养材料还应考虑器官和组织特异性，通常选取自然状态下能够积累次生产物部位的细胞，这样的细胞经过培养以后常常具有合成目的产物的能力，或比较容易诱导合成目的产物。,首先必须选择能够高效合成目的产物的植物种类。,2植物细胞的特性、细胞系的选择次生代谢物的积累与培养细胞的分化程度之间存在正相关。,而在生长迅速、高度分散的细胞悬浮培养系统中，细胞所处的环境既无极性也无梯度，虽然可以获得迅速增长的生物量，但只有在细胞生长的相对静止期才能积累较多产物。,愈伤组织的培养具有初步分化或部分分化的结构，可以积累较多的产物，但是，它在形成连续生产方面却极为不利。,这些现象说明，慢速生长、分化或部分分化的组织或组织团块，才能积累较多的次生产物。,细胞组系选择；培养细胞种群的结构大小、核型、代谢行为不同，可能与培养的外植体有关，不过大部分变化是由培养行为产生的。实现植物细胞次生代谢的大规模工业化生产，首要条件是提高次生代谢物质在细胞中的含量。可以通过筛选、诱变等手段获得次生代谢物合成能力稳定的高产细胞系加以解决。,培养基的营养成分一方面要满足植物细胞的生物量增长，另一方面要使细胞能合成和积累次生产物。一般来说，增加培养基的N、P和K的浓度能促进细胞生长，而适当增加糖浓度则有利于次生产物的合成。,2培养基成分的影响,培养基中加入外源前体物质，将会使目的产物产量提高。选择适当的前体物质是相当重要的。Fett-neto等在紫杉细胞培养生产紫杉醇的研究中，证明向培养基中添加有效前体物质能促进紫杉醇及紫杉醇烷类物质的合成和分泌。,3前体（precursor）的应用,植物细胞次生代谢是一个复杂的生理生化过程，对于某一目的产物来讲可能有多种前体物质，而同一种前体物质又可能有多条代谢路径从而形成不同的代谢产物。因此，添加前体物质必须在充分了解目的产物的代谢途径的前体下，针对其合成的关键生化过程进行前体物质添加。,多数前体物质对细胞生长本身并不十分有利，因此，前体物质的添加时间也常常影响培养效率。前体的浓度对产物合成速率也会有一定影响。一些次生代谢途径中，过量的底物反而会产生反馈抑制。,4激发子（elicitor）的应用,生物激发子根据其来源不同又可分为外源性激发子（exogenous elicitor）和内源性激发子（endogenous elicitor）。外源性激发子多来源于微生物，包括经处理的有机体如菌丝，或微生物机体浸提物以及由微生物产生的多糖类、蛋白质类以及脂肪酸类等。内源激发子是来源于植物结构的化合物。如降解细胞壁的酶类、细胞壁碎片、寡聚糖以及其它有机分子（Akimoto等，1999）。,微生物诱导子 真菌（菌丝体、细胞壁片段、培养液）、酵母菌提取液（YE）寡糖 壳多糖、黄原胶、岩藻依聚糖、葡聚糖蛋白类 壳多糖酶、纤维素酶、果胶酶、糖蛋白第二信使 Ca2+、cAMP、茉莉酮酸及其甲氧基酯,其他 有机酸（花生四烯酸）、紫外线照射、金属离子、植物细胞壁、除草剂、杀虫剂、液体石蜡、琼脂糖、纤维素等,图 诱导子信号转导介导茉莉酸应答的ORCA 转录因子的基因表达的模型,激发子促进次生产物积累与其种类和浓度有关。施中东等（1999）在南方红豆杉细胞培养中证明，硝酸柿铵、硝酸银、花生四烯酸、水杨酸以及甲基茉莉酮酸均有促进紫杉醇合成的作用，但其促进的效果有一定差异。,选择有利于次生产物合成的细胞培养技术是高效生产目的产物的基本前提。这里所指的培养技术是一个综合体系，包括对反应器的选择和对培养方式的选择。,5培养技术的选择,培养技术的选择不仅要考虑细胞生长和产物积累的效率，同时还应考虑技术基础和生产成本。就目前的技术基础来讲，固定化培养是植物细胞规模化生产较为理想的系统，在条件允许的情况下，可优先考虑。,二步培养法,先采用生长培养基以促进生物量增长，再用合成培养基促进次生代谢产物合成和积累。,表 黄连细胞培养生产生物碱含量比较,两相培养技术主要由培养相和分离相组成。根据分离相的性质，两相培养可分为液液系统和液固系统。液液培养系统中，分离相和培养基的化学性质和比重不同，在系统中形成明显区分的两相，其分离相主要使用液体石蜡、烷类化合物、甘油等。液固系统是指提取相以固态形式存在于系统中，主要通过吸附分离目的产物，目前使用的主要有活性炭、硅酸镁载体、沸石、蚕丝以及树脂等。,大量研究证明，游离植物细胞从生理特性和可能进入的分化程度来看，与处于组织器官内的细胞具有较大差异，然而，使细胞处于相对固定和分化状态对次生代谢活动的高效性又是十分必要的。,除了研究细胞固定化化技术外，规模化培养组织器官生产次生产物也成为这一技术改进的重要内容，特别是通过发根农杆菌转化、规模化培养一些植物的发状根生产次生产物，已在人参、丹参、紫草、颠茄、黄芪等植物中进行了探索性研究，并取得良好进展。此外，一些以种子胚为次生代谢器官的植物的体细胞胚规模化培养用于次生产物的生产，也在少数植物中开展了研究。,其他 气体：O2、CO2、乙烯及其它。,6.3.3 次生产物生产实例,1983年，日本三井石油化学工业公司在世界上首次成功的采用紫草细胞培养工业化生产紫草宁。此后，人参细胞培养生产人参皂苷，黄连细胞培养生产小檗碱，长春花细胞培养生产长春花碱，红豆杉细胞培养生产紫杉醇等相继取得成功，迄今为止，已经从400多种植物中分离出细胞，并通过细胞培养，获得600多种化合物。,在生物转化方面的应用在医药行业的应用在现代农业领域的应用在食品行业的应用在基础研究中的应用,6.4 植物细胞培养的应用潜力,6.4.1 在生物转化方面的应用,生物转化(biotransformation,bioconversion)是利用生物体系的催化作用，将外源底物转化为产物的过程。生物体系包括各种细胞、组织、器官、原生质体、细胞器、无细胞提取物、游离酶和固定化酶。,利用生物细胞进行生物转化，其底物并不是营养物质经过细胞内的一系列代谢过程后产生的，而是细胞产生的某种酶对外源底物进行结构修饰的结果。因此，生物转化即不同于生物合成，也不同于生物降解。,1977年Alfermann等人成功地用毛地黄(Digitalis lanata)细胞对-甲基毛地黄毒苷的C-12进行-羟基化，生成-甲基地高辛，开创了利用植物细胞生物转化合成药物的先河。20世纪90年代以来，利用植物培养物进行生物转化的研究迅速发展。据不完全统计，已成功应用于生物转化的植物细胞超过40种。,表2 悬浮细胞转化系统,抗癌药物：玫瑰树碱、长春花碱、鬼臼毒素、紫杉醇、喜树碱等。其他药物：地高辛、利血平、奎宁碱、紫草宁、小檗碱、类胰岛素。,6.4.2 在医药行业的应用,玫瑰树碱（5，11-二甲基-3，4-二卡巴肼）具有对几种实验性异常新肿瘤具抗癌特性，同时也对人类几种癌症有效力。Ochrosia elliptica是法国常见的一种约1米高的小灌木，能分泌黄色的玫瑰树碱和其他不同形式的植物碱。可通过该植物细胞生物转化产生5-甲酸基玫瑰树碱。O.elliptica的培养基中可产生玫瑰树碱，9-甲酸基玫瑰树碱。,从Ochrosia Elliptia 中得到玫瑰树碱,木聚素广泛分布于各种植物中，超过200种木聚素已被记录，其中30种表现出抗肿瘤活性。盾叶鬼臼树脂根茎中已知含有好几种木聚素。其对人类好几种癌症有疗效，包括对舌小细胞癌，睾丸癌,霍专金氏病和淋巴瘤组织扩散。,盾叶鬼臼根茎中获取盾叶鬼臼树脂,6.4.3 在现代农业领域的应用,植物种质的保存人工种子的制备杀虫剂的生产,6.4.3.1 植物种质的保存,种质资源低温保存（Cryopreservation）是将植物的细胞或组织经过防冻处理后，在 80 以下的超低温下保存的方法。,极端低温温度下，活细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止。因此，细胞、组织和器官在超低温保存过程中不会引起遗传性状的改变，也不会丢失形态发生的潜能。同时，由于超低温条件下，生物的代谢和衰老过程大大减慢，甚至完全停止，因此可以长期保存植物材料。,可以在有限空间内保存大量资源；与种子保存相比，可以不受时间和高含水量的限制；与试管苗相比，可以避免频繁继代而带来的变异，同时节省工作量。,低温保存的意义,植物材料超低温冻存的细胞学基础,一.细胞内外水的冻结特性,水分约占植物细胞总重量的6090。细胞中的水是由游离水和束缚水组成，其中游离水约占90，很容易冻结。理论上讲，细胞外水的冻结温度为-5-15，细胞内游离水的冻结在-25，而结合水在-100 下也不冻结。根据Luyet的冻结理论，细胞游离水的冻结温度可被认为是细胞冻存的安全温度，一般将-30 视为一些技术研究的基础温度。,二.低温下细胞致死损伤,细胞超低温贮存一般要经过：预冻超低温长期贮存解冻。细胞致死损伤一般发生在预冻和解冻两个环节上。避免细胞致死损伤是超低温保存技术研究的重点。,细胞超低温贮存方法,直接快速冷冻,分级冷冻,包埋干燥冷冻,玻璃化冻存,影响超低温保存效果的主要因素,材料的基本特性,冰冻保护剂的应用,再培养,预培养与低温锻炼,解冻方法,6.4.3.2 人工种子的制备,人工种子(artificial seeds)亦称体细胞种子。早期的人工种子概念是：体细胞胚经过人工种皮包被后而形成的体细胞种子。任何一种经人工种皮包被或裸露的，具有形成完整植株能力的繁殖体均可称之为人工种子。,根据包被的程度可将人工种子分为三大类：,裸露的或休眠的繁殖体 如微鳞茎，微块茎等。它们在不加包被的情况下也具有较高的成株率。,人工种皮包被的繁殖体 一些体细胞胚、原球茎等不能过度干燥，但只需要用人工种皮包被即可维持良好的发芽状态，如胡萝卜体细胞胚。水凝胶包埋再包被人工种皮的繁殖体 大多数体细胞胚、不定芽、茎尖等均需要先包埋在半液态凝胶中，再经人工种皮包裹才能避免失水，从而维持良好的发芽能力。,根据繁殖体的类型可分为两类：体细胞胚人工种子 非体细胞胚人工种子,据报道，目前已对26个科，36个属的植物进行了人工种子研究。其研究范围显示出两大特点：一是重要经济作物和粮食作物的人工种子报道日益增多；二是以微器官为繁殖体的报道日益增多，其中包括微芽、微枝、原球茎、小鳞茎、小块茎等。,在无性繁殖植物中，有可能建立一种高效快速的繁殖方法，它既能保持原有品种的种性，又可以使之具有实生苗的复壮效应；可以对优异杂种种子不通过有性制种而快速获得大量种子，特别是对于那些制种困难的植物更具有主要的适用意义；,人工种子研究的意义,对于一些不能正常产生种子的特殊植物材料如三倍体、非整倍体、工程植物等，有可能通过人工种子在短期内加大繁殖应用；与田间制种相比，可以节省制种用地，且不受季节限制，可以实现工厂化生产，同时还避免了种子携带病原菌的危险；与利用试管苗相比，可以避免移栽困难，且可以实现机械化操作，同时还便于储藏和运输。,人工种子包被,繁殖体预处理,繁殖体包埋,人工种皮装配,一繁殖体的处理,体细胞胚形成后，需要在无激素培养基上经过一定阶段的后熟培养，然后进行脱水干燥，再将畸形胚选出后才能进行包埋。在脱水之前用ABA处理体细胞胚强迫其进入休眠，更有利于长期贮存。微型变态器官繁殖体不能过度脱水，但亦需要适当干燥，除去表面及多余的水分，同时要进行表面消毒处理以繁殖包被后的感染。为了延长贮存时间，亦需根据使用季节进行适当的休眠处理。芽为繁殖体的类型，则不能进行脱水处理，但必需筛选生长健壮、组织充实的芽进行包埋。,二繁殖体的包埋,包埋介质的要求：首先必需是对繁殖体及其它生物是无毒的，并具有一定的缓冲强度，以保证繁殖体在生产、运输和种植操作中的安全。同时，它最好能够提供类似于胚乳的营养物质，以供繁殖体发芽的需要。此外由于繁殖体的含水量较高，贮存中极易受到微生物感染危害，因此介质中还应含有适当的杀菌剂。,常用的两种人工胚乳液配方：MS（或SH、White）培养基加入1.5%的马铃薯淀粉水解物；SH（0.5）培养基加入1.5%的麦芽糖。,以海藻酸钠作包埋剂的操作程序是：在配制好的海藻酸钠溶液中，按一定比例加入繁殖体并混匀。将其逐滴滴入2.0%-2.5%的CaCl2溶液中，经2030min.的离子交换作用即形成含有繁殖体具有一定刚性的人工种子，用无菌水漂洗20min.以终止反应。,6.4.3.3 杀虫剂的生产,在自然中，植物保护自己免受害虫的侵害主要靠机械的和化学的防御。机械防御包括形成一层可以防止昆虫的摄食和在植物上产卵的厚角组织。化学防御是靠植物的高度进化以形成次生代谢物。,大量生产的起源于植物的杀虫剂包括除虫菊素、鱼藤酮类生物碱、烟碱、苦楝油、印度苦楝子素、苦木素等等。起源于植物的杀虫剂能有效的抵御大量的昆虫的侵袭；同时天然复合物对人类和其它哺乳类动物来说相对无风险。,植物中发现的植物蜕皮类固醇能打乱昆虫的生长周期，导致变态成虫的形成。脱皮甾酮是一种广泛的存在于植物蜕皮类固醇的物质。在 Polypodium vulgare,P.irginanum,Achyranthes aspera,Trianthema portulacastrum,Sidacarpinifolia,Sesuvium portulacastrum Gomphrena celosiodes.中都有记载。,植物蜕皮类固醇,狗筋蔓,用于植物保护的Aza A(印度苦楝子素)，是1985年第一个被环境保护组织批准的可以在美国市场销售的杀虫剂。Aza A 作为最常用的生物杀虫剂，可以对130种昆虫起作用。1992年，美国W.R.Grace公司被批准提取和加固Aza A的专利。,印度楝树,印楝素,鱼藤酮类生物碱在热带国家被用作杀虫剂和鱼类抑制剂。这组杀虫剂是在鱼藤属植物Tephrosia、Lonchocarpus、Millettia、Mundulea 中找到的。,鱼藤,鱼藤酮,除虫菊酯是植物来源的最经济重要的自然杀虫剂，它们对大范围的昆虫具有致死效应。,除虫菊,除虫菊素,6.4.4 在食品行业的应用,由于生物安全性的考虑，人们渐渐远离化学合成物而偏爱天然的食品添加剂，因此天然食品添加剂生产领域越来越受到垂青。许多国家开始全面在食品中采用天然物质。,要生产如此多的天然食品添加剂却有许多的困难，之一就是通过传统的栽培方式满足生产原料的供应，但是基于农业气候、特定的生产季节、病虫害等等原因，恐怕存在问题。总之，需要采用一种利用植物组织和细胞培养的生物方法生产产品。,I.色素,花青素藏花素和藏花酸辣椒素等,花青素是被子植物和开花植物的特性色素，集中存在于根、叶、花和果实等不同的部位。其中禾本科、豆科、蔷薇科、十字花科、葡萄科和茄科植物的花青素可用作食用色素。由于色素稳定性问题,提取方法及安全检测问题，只有小部分有效的资源具有作为花青素着色剂的潜力。,就国际而言，葡萄是花青素最具潜力的来源。日本提取自日本山茶花和 Perilla spp 的花青素有着很大的需求。据估计花青素将会是$135000,000的世界食用色素市场的主要候选者。纯花青素来自美国的报价是$1200 到 1500/公斤。,植物细胞培养被认为是花青素生产的一个优良来源，生产率达到10 20%（基于干细胞重）。根据Zhong及其同仁的研究，细胞悬浮培养的 Perilla frutescens的产量可达到3级。加拿大和以色列的生物科技公司积极投入花青素“依比例决定-增加”的研究中，而且现已尝试以细胞培养技术商业开发花青素。,香草是在给材料加香方面应用最广泛的，并且自然香料相对于生物工艺学上的香料产品来说市场更有前途。它是从香草planifdia 的豆荚中提取出来的一种合成的香料组成部分的混合物。它是其中一种最常见的化学香料并被广泛用于食品工业上。每年大约要消费12000吨的香草。天然香草的成本价格在美国大约是3200美元/公斤，非自然的大约13.5美元/公斤。,II香料,现在通过香草planifolia 植物组织培养的方法生产香草香料混合物被给予极大关注。香草 planifolia 的植物细胞培养和其他的香草系列物已经从不同植物器官诸如叶、茎细胞和组织中被开创出来。,蛇菊苷奇异果甜蛋白,III 增甜剂,蛇菊苷是从南非植物Stevia rebaudiara（甜菊属）中提取出来的。纯蛇菊苷比蔗糖甜300倍。目前作为商品售卖的是从整个植株中心提取的一中未被提纯的混合物，其中含41%的蛇菊苷。日本人是其主要消费者。大量对蛇菊苷安全性和毒性测试显示，它对于人类是安全的；而且牙医研究认为此产品可有效抑制口腔微生物的生长。,奇异果甜蛋白是一种相当甜的蛋白质，它存在于非洲竹芋科植物Thaunatococcus danieuin中。,奇异果甜蛋白主要包含两种蛋白，即奇异果甜蛋白和奇异果甜蛋白，以及一种微蛋白、奇异果甜蛋白b和c。其水溶液的甜度是蔗糖的5500倍。,Tdaniellii是一种只有在特殊的热带条件下才结果的灌木植物。因此这引发了科学家通过细胞培养和微生物基因工程来生产奇异果甜蛋白的兴趣。另外也存在这样一种可能性，即在水果或者植物中表达奇异果甜蛋白，使它们具有甜度。目前含奇异果甜蛋白的西红柿正在研究中。,思考题,试分析利用细胞培养生产次生产物的意义。如何建立符合要求的悬浮细胞系？悬浮培养过程中，怎样提高次生产物的产量？植物细胞培养技术在实践中有哪些应用？,