植物细胞工程及其应用.ppt

第二章 细胞工程,第二章 细胞工程,【知识目标】了解制备植物细胞及微生物细胞的原生质体并进行细胞融合的基本方法。学习进行动植物细胞及组织的培养方法。认识单倍体植物的诱发及人工种子制备的基本要领。探讨植物脱除病毒的途径和检测手段。掌握利用动物体细胞克隆哺乳动物的基本做法及其重要意义。领会干细胞芯康脑砗凸饷髑熬啊,第三章 细胞工程,【技能目标】学会描述植物组织培养、原生质体融合、动物细胞组织培养及细胞融合的基本过程。掌握植物组织培养及快速繁殖的方法。,第一节 细胞工程概述,一、细胞工程的基本概念细胞工程就是在细胞水平研究、开发和利用各类细胞的工程。细胞工程是一种细胞水平上的遗传工程,第一节 细胞工程概述,二、细胞工程基础知识细胞是细胞工程操作的主要对象。生物界有两大类细胞：原核细胞与真核细胞。原核细胞如：细菌、放线菌等。真核细胞如：酵母、动植物等。原核细胞生长迅速，无蛋白质结合的DNA易于人们进行遗传操作，是细胞改造的良好材料。,第一节 细胞工程概述,三、细胞工程基本技术（一）无菌操作技术实验操作应在无菌室内进行无菌室要求注意周围环境的卫生整洁超净工作台是最基本的实验设备对生物材料进行彻底的消毒和除菌是实验成功的前提,第一节 细胞工程概述,三、细胞工程基本技术（二）细胞培养技术细胞培养是指动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长细胞培养步骤为：取材和除菌；配制细胞培养基，并对培养基进行灭菌或除菌；培养室培养,第一节 细胞工程概述,三、细胞工程基本技术（三）细胞融合技术1.制备原生质体2.诱导细胞融合3.筛选杂合细胞,第二节 植物细胞工程及其应用,一、植物组织培养（一）预备阶段 1.选择合适的外植体大小要适宜。同一植物不同部位的外植体，其细胞的分化能力、分化条件及分化类型有相当大的差别。植物胚与幼龄组织器官比会化组织、器官更容易去分化，产生大量的愈伤组织。不同物种相同部位的外植体其细胞分化能力可能大不一样。,第二节 植物细胞工程及其应用,一、植物组织培养2.外植体的消毒灭菌 外植体自来水多次漂洗消毒剂处理无菌水反复冲洗无菌滤纸吸干。,第二节 植物细胞工程及其应用,一、植物组织培养3.配制适宜的培养基组织培养基通常都包括三大类组分：含量丰富的基本成分如蔗糖或葡萄糖高达每升30克，以及氮、磷、钾、镁等；微量的无机物，如：铁、锰、硼酸等；微量有机物，如激动素、吲哚乙酸、肌醇等。各培养基中，吲哚乙酸和激动素的变动幅度很大，这主要因培养目的而异。,第二节 植物细胞工程及其应用,一、植物组织培养（二）诱导去分化阶段器官切段去分化，培养基中应添加较高浓度的生长素类激素诱导外植体去分化可以采用固体培养基，在培养室中多层培养外植体表面除菌后，切成小片（段）插入或贴放培养基表面即可通常把它们置于人工照明条件下培养，以期得到绿色愈伤组织。,第二节 植物细胞工程及其应用,一、植物组织培养（三）继代增殖阶段愈伤组织长出后经过46周后（四）生根成芽阶段胚状体光照是本阶段的必备外因（五）移栽成活阶段,第二节 植物细胞工程及其应用,二、植物细胞培养和次生代谢物的生产（一）悬浮细胞培养系统,第二节 植物细胞工程及其应用,二、植物细胞培养和次生代谢物的生产（二）固定化细胞培养系统1.平床培养系统,第二节 植物细胞工程及其应用,二、植物细胞培养和次生代谢物的生产（二）固定化细胞培养系统2.立柱培养系统,第二节 植物细胞工程及其应用,二、植物细胞培养和次生代谢物的生产（二）固定化细胞培养系统2.立柱培养系统 要选用高产细胞株系。在营养液中加入目的产物的直接或近直接前体物质，往往对增产目的产物有特效。对各类细胞的培养都应反复摸索碳源、氮源和生长调节物质的配比，找出最佳方案。适量光照及通气在多数情况下有利于产物的生成。,第二节 植物细胞工程及其应用,二、植物细胞培养和次生代谢物的生产（二）固定化细胞培养系统以下简要介绍褐藻酸钙固定植物细胞的技术路线：,第二节 植物细胞工程及其应用,三、植物细胞原生质体制备与融合（一）原生质体的制备1.取材与除菌2.酶解3.分离4.洗涤5.鉴定,第二节 植物细胞工程及其应用,三、植物细胞原生质体制制备与融合（二）原生质体的融合1.化学法诱导融合聚乙二醇（PEG）结合高钙高PH诱导融合法2.物理法诱导融合平行电极法,第二节 植物细胞工程及其应用,三、植物细胞原生质体制制备与融合（二）原生质体的融合融合处理后再生的细胞株将可能的类型：完全的杂合植株核质异源的植株融合细胞由双方胞质及一方核或再附加少量他方染色体或DNA片段构成。原生质体融合后两个细胞核尚未融合时就过早地被新出现的细胞壁分开。以后它们各自分裂生长成嵌合植株。,第二节 植物细胞工程及其应用,三、植物细胞原生质体制制备与融合（三）杂合体的鉴别与筛选1.杂合细胞的显微镜鉴别2.互补法筛选杂合细胞3.采用细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体4.根据融合处理后再生长出的植株的形态特征进行鉴别,第二节 植物细胞工程及其应用,四、单倍体植物诱发与利用（一）花药培养1.选取成熟度适中的花蕾或幼穗2.花药预处理3.选择适当的培养基与培养条件（二）花粉培养培育单倍体植株,第二节 植物细胞工程及其应用,四、单倍体植物诱发与利用（三）未授粉子房或胚珠的培养充满希望的发展方向（四）杂交法获单倍体植株（五）单倍体培养物的加倍可用0.2%0.4%秋水仙素处理2448h,第二节 植物细胞工程及其应用,五、人工种子的研制（一）人工种子的构成及特点1.人工种皮2.人工胚乳3.胚状体,第二节 植物细胞工程及其应用,五、人工种子的研制突出的优点：可以不受环境因素制约有利于保存该种系的优良性状；成本更低，更适合于机械化田间播种；可根据需要在人工胚乳中添加适量的营养物、激素、农药、抗生素、除草剂等,第二节 植物细胞工程及其应用,五、人工种子的研制（二）人工种子的制备1.胚状体的制备及其同步生长（1）低温法：（2）抑制剂法：（3）分离法：（4）通气法：（5）渗透压法：2.人工胚乳的制备MS(或SH、White)培养基马铃薯淀粉水解物（1.5%）；SH培养基（12浓度）麦芽糖（1.5%）3.配制包埋剂及包埋褐藻酸钠,人工种子包埋示意图,第二节 植物细胞工程及其应用,五、人工种子的研制（三）人工种子的贮存与萌发迄今为止尚未攻克的难关。一般将人工种子保存在低温（47）和干燥（相对湿度小于67%）条件下,第二节 植物细胞工程及其应用,六、植物脱病毒技术（一）植物脱病毒途径1.物理学方法2.化学方法3.生物学方法基本流程4.综合脱毒法,第二节 植物细胞工程及其应用,六、植物脱病毒技术（二）植物脱毒检测1.外形观察法2.电镜观察法3.免疫血清法,第三节 动物细胞工程及其应用,一、动物细胞培养动物细胞工程从细胞生物学和分子生物学的层次，根据人类的需要，一方面深人探索、改造生物遗传种性，另一方面应用工程技术的手段，大量培养细胞、组织或动物本身，以期收获细胞或其代谢产物以及可供利用的动物,第三节 动物细胞工程及其应用,二、动物细胞组织培养（一）细胞培养法培养动物细胞一般步骤：无菌取出目的细胞所在组织，以培养液漂洗干净。以锋利无菌刀具割舍多余部分，切成小组织块。将小组织块置解离液离散细胞（解离液含蛋白酶类，无钙、镁离子）。低速离心洗涤细胞后，将目的细胞吸移至培养瓶培养。,第三节 动物细胞工程及其应用,二、动物细胞组织培养1.微导管培养法,第三节 动物细胞工程及其应用,二、动物细胞组织培养2.微载体培养法（3）微胶囊培养法,第三节 动物细胞工程及其应用,二、动物细胞组织培养（二）组织培养法无菌操作取出目的组织，以培养液漂洗。以锋利无菌刀具割舍多余部分，将该组织分切成12mm2小块，移人培养瓶。加人合适的培养基浸润组织,小心地将培养瓶平翻180，搁置1530min，以利组织块的贴壁生长。翻回培养瓶，平卧静置于37培养。,第三节 动物细胞工程及其应用,二、动物细胞组织培养（三）培养物的传代（四）无血清培养三大部分：基础培养基 基质因子生长因子、激素和维生素,第三节 动物细胞工程及其应用,二、动物细胞组织培养（五）培养物的长期保存经典传代法冷冻保存法液氮保存法为：将成熟培养物（细胞）与510的甘油或二甲亚砜混匀，封装于若干个安瓯瓶中；缓慢降温（每分钟13）至一30；继续降温（每分钟1530min）至一150；转移至液氮冻存,可无限期保存。(六)细胞组织培养污染的防治,第三节 动物细胞工程及其应用,三、动物细胞融合（一）病毒诱导融合（二）化学诱导融合PEG诱导融合（三）电激诱导融合,第三节 动物细胞工程及其应用,四、单克隆抗体生产技术,第三节 动物细胞工程及其应用,五、细胞核移植与动物克隆（一）核移植1.异种核质关系研究2.脊椎动物克隆细胞核遗传全能性研究,第三节 动物细胞工程及其应用,五、细胞核移植与动物克隆（二）体细胞克隆“多莉”绵羊是如何克隆诞生的呢？,第三节 动物细胞工程及其应用,五、细胞核移植与动物克隆（二）体细胞克隆意义遗传素质完全一致的克隆动物将更有利于开展对动物（人）生长、发育、衰老和健康等机理的研究。有利于大量培养品质优良的家畜。经转基因的克隆哺乳动物，将能为人类提供源源不断的廉价的药品、保健品以及较易被人体接受的移植器官。科学家将很快地从目前的同种克隆技术推进到异种克隆,第三节 动物细胞工程及其应用,六、染色体转移（一）微细胞介导法 图供体细胞秋水仙素处理低温处理细胞破碎高速离心收集染色体,第三节 动物细胞工程及其应用,六、染色体转移 直接用微注射针向胞内注射染色体悬液。将染色体与细胞共培养，染色体被细胞以胞吞的方式摄入。本法转移成功率低。将染色体与高浓度CaCl2混匀后滴加到受体细胞上，可提高成功率。用卵磷脂与胆固醇混合液制成脂质体，将染色体包裹其中，再经聚乙二醇与受体细胞融合，达到转移染色体的目的。,第三节 动物细胞工程及其应用,七、干细胞研究干细胞（stem cell）是动物（包括人）胚胎及某些器官中具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是重建、修复病损或衰老组织、器官功能的理想种子细胞。,第三节 动物细胞工程及其应用,七、干细胞研究三种类型：全能性干细胞，即胚胎干细胞，是最原始的干细胞多能性干细胞，发育潜能受到一定的限制。如：骨髓造血干细胞可分化成为至少12种血细胞，但一般不能分化出造血系统以外的其他细胞。专一性干细胞，这类干细胞只能分化成一种类型或功能密切相关的两种类型的细胞，如上皮组织基底层的干细胞和肌肉中的成肌细胞等。,第三节 动物细胞工程及其应用,七、干细胞研究干细胞具有以下显著的特点：具有分裂成其他细胞的可能性；具有无限增殖分裂的潜能；可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态；以对称或不对称两种方式进行生长。,第三节 动物细胞工程及其应用,七、干细胞研究三个阶段：获得干细胞系建立干细胞诱导分化模型将上述干细胞或干细胞培育体系植入动物或人的相应器官或组织，考察其效果。,第三节 动物细胞工程及其应用,七、干细胞研究优点：低毒性（或无毒性），一次治疗有效；不需要完全了解疾病发病的确切机制；用于自身干细胞移植，可避免产生免疫排斥反应。,第四节 微生物细胞工程,一、原核细胞的原生质体融合G+：分别培养带遗传标志的双亲本菌株至指数生长中期分别离心收集菌体，以高渗培养基制成菌悬液混合双亲本，加入适量溶菌酶，作用2030min；高速离心后去上清液得原生质体，用少量高渗培养基制成菌悬液；加入10倍体积的聚乙二醇（40%）促使原生质体凝集、融合；数分钟后，加入适量高渗培养基稀释；涂接于高渗选择培养基上进行筛选。,第四节 微生物细胞工程,一、原核细胞的原生质体融合对G+而言，在加入溶菌酶数分钟后，应添加少量0.1molL的EDTANa2共同作用1520min，则可使90%以上的革兰氏阴性细菌转变为可供细胞融合用的球状体。,第四节 微生物细胞工程,二、真菌的原生质体融合真菌原生质体融合的要点以聚乙二醇为融合剂，在特异的选择培养基上筛选融合子。只有那些形成真正单倍重组体的融合子才能稳定传代。具有杂合双倍体和异核体的融合子遗传特性不稳定，需经多代考证和鉴定才能最后断定是否为真正的杂合细胞。不少大型食用菌，如蘑菇、香菇、木耳、凤尾菇和平菇等经细胞融合获得一些新的性状，取得了相当可观的经济效益。福建省轻工业研究所通过细胞融合获得了耐高温等性状的蘑菇新品种。,植物组织培养,一、实验目的了解离体无菌培养对实验材料消毒、接种的要求，初步掌握取材、培养材料灭菌和接种等操作技术。,植物组织培养,二、实验原理植物组织培养的理论依据是植物细胞具有全能性。即使是已经高度成熟和分化的细胞，也保持着恢复到分生状态的能力。植物细胞表现出全能性的条件是脱离母体并具有合适的生长条件。植物离体培养所需的营养是由培养基来提供的。在植物细胞脱分化和再分化的过程中，植物激素的调控至关重要。生长素和细胞分裂素的浓度和比例是控制植物离体培养细胞生长模式和器官发生的最重要的手段。,植物组织培养,三、实验仪器超净工作台,植物组织培养,四、试剂与用品MS培养基、0.1%升汞、酒精、无菌水、组培瓶、培养皿、酒精灯、棉线绳、封口膜、镊子、剪刀、解剖刀、脱脂棉、标签纸,植物组织培养,五、实验步骤1.准备2.接种前消毒3.取植物茎尖4.处理内层茎尖5.将灭菌处理后的茎尖用镊子小心地夹到垫有无菌滤纸的接种盘里，吸干水分，将升汞接触的切口切去一小段。6准备组培瓶7.接种前准备8.接种9.标记10.培养11.记录,蝴蝶兰快速繁殖技术,一、实验目的通过调控蝴蝶兰外植体的离体培养条件，使培养物建立再生体系，掌握离体器官发生的四种方式，观察发生过程。,蝴蝶兰快速繁殖技术,二、实验原理在离体培养时，不同植物种类和不同部位的外植体对营养的要求及外源激素的种类和配比的要求都有差异，并且培养条件还会决定植物器官发生方式。提供选择合适的外植体，调节培养基成分和培养条件来调控组织培养物的器官发生途径，从而建立植株再生体系，以实现快速繁殖。,蝴蝶兰快速繁殖技术,三、实验仪器超净工作台,蝴蝶兰快速繁殖技术,四、试剂与用品MS+BA3.0mgL+10椰乳+5%马铃薯培养基、KC+5椰乳+10%马铃薯培养基、KC+NAA0.2mgL+10%椰乳十5马铃薯培养基、0.1%升汞、蒸馏水、酒精、组培瓶、0.3%的多菌灵,蝴蝶兰快速繁殖技术,五、实验步骤1.无菌材料的建立及原球茎的诱导2原球茎的增殖及幼苗分化培养3成苗培养4移栽,