样品前处理及制备技术.ppt

样品前处理及制备技术,丁卓平 教授,目录,一、概述,第一章 溶剂萃取(2学时，自学1学时),第二章 蒸馏,第三章 固相萃取,第四章 气体萃取（顶空技术Headspace）,目录,第五章 膜分离,第六章 热解吸,第七章 衍生化技术,一、概述,指样品的制备和对样品中的待测组分进行提取、净化、浓缩的过程。,是消除基质干扰、保护仪器、提高检测方法的灵敏度、选择性、准确度、精密度。,1,2,3,5,4,基体复杂有水分、糖类、脂肪、蛋白质等固态有水果、蔬菜、肉、鱼、蛋、家禽、调味品等碳水化合物食品。液态有饮料、乳制品等。,检测限量越来越严格如欧盟要求食品中氯霉素检测限量要求为O.1g/kg，己烯雌酚要求为0.05g/kg。,各目标化合物的性质差异极大如极性、沸点、热稳定性等,多组分并存对人类健康影响有协同效应 例如狄氏剂、DDT等农药与多氯联苯共存时，会使毒性增加一倍,浓度极低1防止样品基体组分的信号掩蔽痕量被测物和污染仪器2接近仪器的检测限,3、食品样品前处理方法的选择取决于食品危害残留物质分析的特点,4、举例,9 氯霉素类（Chloramphenicols）P129-13210 大环内酯类（Macrolides）和林可霉素类（Lincosamides）P143-150,举例：HPLC测定邻苯二甲酸酯的样品处理：,净化,LLE（BBP、DBP）,1mL甲醇溶解,2g样品，2mL甲醇，4mL正己烷：甲基叔丁基醚（v:v,1:1），震荡提取2次，离心，上清氮吹，正己烷定容至4mL。,冷冻去脂，上清液定容至4mL。,SPE（DEHP、DNOP、DINP、DIDP）,氮吹浓缩,本底的去除、活化、上样、淋洗、洗脱,牛奶和乳酪,奶粉,黄油,2g样品，水浴融化，用5mL甲醇提取2次，离心，上清氮吹，正己烷定容至4mL。,5.分析包括,分析方法的选择,分析的全过程,样品的采集、制备及保存,样品前处理,本课程的内容,样品的采集、制备及保存,一、样品的采集分析的首项工作从大量的分析对象（即总体中）抽出一部分（即样品）作为分析材料，这项工作称为样品的采集。说明：样品来自总体，并代表总体，和总体有相同的属性,样品的采集、制备及保存,（一）采样原则1.采集的样品要均匀，有代表性，能反映全部被检食品的组成；2.采样过程中要设法保持原有的理化指标，防止成分逸散或带入杂质。重要性说明：否则，即使以后的样品处理、检测等都非常精密准确，其检测的结果亦毫无价值，以致导致错误的结论。,样品的采集、制备及保存,（二）采样步骤1.检样：由分析对象大批物料的各个部分采集的少量物料成为检样。2.原始样品：许多份检样综合在一起成为原始样品。3.平均样品：原始样品经过技术处理，再抽取其中的一部分供分析检验的样品,样品的采集、制备及保存,二、样品制备：粉碎、混匀、缩分 按采样规程采取的样品往往数量很多，颗粒太大，组成不均匀。因此为了确保分析结果的正确性，必须对样品进行粉碎、混匀、缩分，使任何一个部分都能代表全部样品的成分。,样品的采集、制备及保存,三、样品保存样品易变：1.食品是动植物组织，是活细胞，有酶的活动，又因食品中的营养素是天然培养基；2.经过采样，破坏了一部分组织，使汁液外流。,样品的采集、制备及保存,保存原则 1.应防止污染 2.应防止腐败变质 3.应稳定水分 4.应固定待测成分（不稳定，易挥发）。(应结合分析方法，在采样时加入某些溶剂或试剂，使待测成分处于稳定状态）,样品的采集、制备及保存,保存方法净：器具干净防止污染和变质密：稳定水分防止挥发损失避免引入污物冷：冷藏（05）下运输和保存 降低化学反应速度快：尽快分析避光：VB1、胡萝卜素、黄曲霉素B1,易发生光解 冷冻干燥：不能马上分析的样品最好冷冻升华 干燥来保存,5、本课程的目的,知道每一步所加药品或操作步骤的作用和目的,能看懂已确立的检测方法的前处理过程。,为研究建立新的检测方法、为改进前处理方法奠定基础,第一章 溶剂萃取(2学时，自学1学时),第一节、液-液萃取,第二节、液-固萃取,第三节、液-气萃取（溶液吸收）,第四节、萃取溶剂的选择,第一章 溶剂萃取,什么叫作溶剂萃取 在液体、固体或者气体中含有的某些物质，使用溶剂将它们溶解出来，这样的方法也称作溶剂萃取。液体样品最常用的萃取技术之一是溶剂萃取，通常叫做液一液萃取。据调查，在分析化学实验室中几乎半数的人员常常使用液一液萃取。溶剂萃取原理 液一液萃取、液一固萃取和液-气萃取(溶液吸收)等，它们都是属于两相间的传质过程，即物质从一相转入另一相的过程。,液一液,使用石油醚萃取水样品中的氯苯类化合物就是从液相到液相传质的液一液萃取,使用二硫化碳萃取活性炭中吸附的有机溶剂就是从固相到液相传质的液一固萃取；,液一固,举例,第一节 液-液萃取,液-液萃取是经典的提取方法之一，液-液萃取常用于样品中被测物质与基质的分离，在两种不相溶液体或相之间通过分配对样品进行分离而达到被测物质纯化和消除干扰物质的目的与其它方法相比，液-液萃取法仍是目前最常用的样品处理方法，其原因是：（1）通过萃取可将被测组分自大量内源性物质中分离出来，减少杂质对测定的干扰；（2）操作简单快速、经济实用；（3）可将萃取液蒸发，使组分富集；（4）可一次进行同类组分的萃取。,液-液萃取原理,它基于被测组分在不相混溶的两种溶剂中溶解度或分配比的不同来达到分离、提取或纯化的目的Nernst分配定律：物质将分配在两种不混溶的液相中。如果以有机溶剂和水两相为例，将含有有机物质的水溶液用有机溶剂萃取时，有机化合物就在这两相间进行分配。在一定的温度下有机物在两种液相中的浓度比是一常数：KD=cocab 式中，KD是分配系数，co是有机相中物质的浓度，cab是水相中此物质的浓度。,液-液萃取分类,常规液-液萃取,常规的液-液萃取方法使用分液漏斗，需要101000mL的液相(每一种)。对于一步萃取，为了获得较大的回收率(在某一相中达99以上)，分配系数KD必须大于10，因为相比(VoVaq)必须保持在0.110之间。在大部分的分液漏斗的液液萃取方法中，定量回收需要两次或更多次的萃取。如下式：E=1一1(1+VoKDV)n(3-3)式中，n是萃取次数。如果某一种物质的分配系数KD=5，两相的体积相等时(V=1)，必须进行3次萃取(n=3)才能获得大于99的回收率。每一次萃取都使用新鲜的溶剂。一般来说，多次萃取与一次萃取相比具有较高的萃取效率。,连续液-液萃取,如果KD值小或者需要的样品量大，多次萃取是不实际的。并且萃取的总体积也太大。在某些情况下，萃取的动力学可能是很慢的，需要很长时间才能建立平衡。在这些情况下，可以使用连续液一液萃取技术。,连续液-液萃取,在连续液一液萃取中，新鲜的有机溶剂可以循环地连续使用，通过含有被萃取的水相。图3-1表明一个连续液一液萃取器的结构，使用比水重的有机溶剂进行萃取。这种萃取溶剂从烧瓶中被加热蒸馏，上升到冷凝器被冷凝，并淋漓出两种不混合的水和带有萃取物的溶剂。最后，溶剂和萃取物返回到烧瓶中。此过程连续地进行直到足够量的被测物质被萃取出来。在某些模块中，烧瓶也作为浓缩器使用，连续萃取之后便于蒸发和除去萃取溶剂。,连续液-液萃取,优点,无需人工操作，可以处理低KD萃取，使用较少的溶剂，较高的效率。,缺点,在蒸馏过程中可能会损失高挥发性的化合物，热不稳定化合物也可能会降解，除非他们能够接受沸腾溶剂的温度。,逆流萃取,逆流萃取（Countercurrent Distribution）装置可以提供1000或者更多的塔板数用于更有效的液一液萃取,但是它需要很长时间和工作量。逆流萃取可以回收分配系数KD值相当小的组分。,微萃取,采用0.0010.01范围的相比率值(V)进行萃取过程。与传统的液一液萃取相比，它采用小体积有机溶剂。微萃取提供的回收率较差，但是在有机相中的欲测物质的浓缩大大地增高。此外，使用的溶剂量也大大地减少。在容量瓶中进行萃取，可以选择比水密度低的有机溶剂，结果有机溶剂积累在瓶颈部分并且便于抽取它们。在有机相中的被测物质的浓缩可以通过盐析作用得到加强。可以采用样品加入内标和萃取校正标准的方法进行测定。,萃取小柱(Cartridges)技术,使用萃取小柱代替分液漏斗完成液一液萃取，将一种液相混合到一种惰性介质中并经过渗滤，与色谱相类似的方式，不相容相进入不流动相（固定相）。这些萃取小柱同固相萃取小柱一样，在聚乙烯管中填充经煅烧助溶的高纯硅藻土。这些管的体积从0.3300mL(有商品出售)。具有大表面的填充物可提高萃取效率、防止水溶液样品(被硅藻土吸附的)和有机萃取溶剂之间的乳化。此技术操作简单，可以用于含有误用药物的体液的萃取。可先使用样品润湿萃取小柱中的吸附剂几分钟后，再将有机萃取溶剂加入到萃取小柱中。当有机溶剂还保存在萃取小柱中时(已经含有萃取物质)，分别调节pH值在45和90时，以萃取样品中的酸性或碱性物质。,在线萃取,在线萃取优缺点,可用于非常小的样品体积(低于100mL)，使用小量的试剂和有机溶剂(费用降低)，闭环系统(样品不会暴露到大气中，防止了污染和对人的毒性及溶剂的可燃性)，高的样品萃取产率，可充分自动化，流动系统的接口可直接与分析仪器相连接。,灵敏度较低，要求更复杂的硬件(泵、相沉淀器、相分离器)。,自动液一液萃取,传统的液一液萃取需要大量的手工操作，当样品负荷增加，并超过了合理的程度，人们就会考虑自动化。许多仪器厂家研制了全部自动或者部分自动地完成样品萃取和浓缩的装置。美国OI分析公司根据EPA SW-846方法35103520，研制了ExCell自动液一液萃取系统。此系统使用二氯甲烷作为萃取剂，在约3h时间内可同时处理6个1 L水样品中半挥发性物质的液一液萃取。此系统的萃取过程与传统的分液漏斗的液一液萃取不同，如图33所示。,自动液一液萃取,在萃取池中装有二氯甲烷溶剂，溶剂液体表面上通过风机作用使萃取池形成轻微的真空，水样品以液滴方式连续地被引进到萃取溶剂中。水样品液滴在进入二氯甲烷溶剂过程中，先通过一个专用的由外部电极产生的电场区域。电场促使萃取溶剂中的水滴进行运动，液滴形状产生扭曲并分裂成更小的液滴。这种分裂在水相和二氯甲烷相之间的界面上大量增加，导致水滴中的欲测定有机物分子快速地扩散进入二氯甲烷中。,二氯甲烷,真空,水滴运动,乳化现象的产生,液-液萃取中非常重要的操作是急速地振动样品。此步骤可确保两相的完全接触，有助于质量传递。在分液漏斗发生完全的混合，产生大量的界面区域使得有效的分配出现。由于物质剧烈的振动，在液一液萃取中乳化现象经常发生，特别是那些含有表面活性剂和脂肪的样品。收集欲测物质必须先进行破乳。为了防止乳化形成，应用采取加热或加盐的方法破乳。通过改变KD，改变溶剂或化学平衡作用的添加剂，诸如使用缓冲剂调节pH，盐调节离子强度等,乳化的害处,乳化现象能使被测组分损失。,1,2,3,5,4,加盐,使用加热-冷却萃取容器,通过离心作用,加进少量的不同的有机溶剂,通过玻璃棉塞过滤乳化液样品；通过相过滤纸过滤乳化液样品；,破乳的常用方法,破乳的常用方法,为了防止乳化，可应用较大体积的有机溶剂，避免猛烈振摇或加入适当的试剂改变其表面张力而破乳，若已发生严重的乳化现象，可将试管置于冰箱中冷冻破乳。,如何避免玻璃容器壁对某些药物的吸附,1,萃取过程中所用的玻璃容器壁对某些药物的吸附是不可忽略的特别是当药物浓度较低时更是如此。对萃取所用的器具进行硅烷化处理,2,还常在萃取剂中加入异戊醇。异成醇能减少玻璃壁的吸附，还可减少萃取过程中乳化的形成。也可以加入二乙胺，二乙胺能显著减少吸附作用，提高萃取回收率。,第一章 溶剂萃取(2学时，自学1学时),第一节、液-液萃取,第二节、液-固萃取,第三节、液-气萃取（溶液吸收）,第四节、萃取溶剂的选择,第二节、液-固萃取,最简单的液-固萃取就是将欲萃取的固体放入萃取溶剂中，加以振荡，必要时也可加热，然后利用离心或过滤的方法使液、固分离，欲萃取组分进入溶剂。但是，这种最简单的液一固萃取只能用于十分容易萃取的组分，它的萃取效率很低，加热时溶剂也容易损失，一般很少使用。,第二节、液-固萃取,最常用的液一固萃取是索氏萃取，如图3-4(a)所示3。索氏萃取装置有商品产品，其规格有1 25，250，500mL的。也可以自行设计加工制造。样品经索氏萃取之后，通常需要对萃取液进行浓缩和定容的程序。浓缩和定容的程序通过KD(Kudema-Danish)浓缩器完成。KD浓缩器的结构组成如图34(b)所示。最后可将样品萃取液浓缩定容到15mL。,第二节、液-固萃取,萃取时的温度,提高萃取时的温度虽然可以提高萃取效率，但是萃取温度也不能任意提高。当接近或超过溶剂的沸点时，溶剂汽化，致使萃取难以进行；如果萃取温度过高，常常是被萃取出来的杂质也随着增多。通常，萃取时的温度应当比所用的溶剂的沸点低1015。,第一章 溶剂萃取(2学时，自学1学时),第一节、液-液萃取,第二节、液-固萃取,第三节、液-气萃取（溶液吸收）,第四节、萃取溶剂的选择,三、液-气萃取(溶液吸收),溶液吸收装置由装有吸收液的气体吸收管、抽取气体样品的动力装置(或空气采样泵)和控制抽取气体流量的装置等基本部分组成，如图3-6所示。气体吸收管、空气采样泵等均有商品出售，可根据要求选取不同的规格和技术指标。,液-气萃取(溶液吸收)装置,液-气萃取(溶液吸收)原理,使用溶液吸收方法可以收集气态、蒸汽和气溶胶等样品，被抽取气体样品通过吸收液时，在气泡和吸收液的界面上，欲测组分的分子由于溶解作用或者化学反应很快地进入吸收液中，同时气泡中间的气体分子因存在浓度梯度和运动速度极快，能够迅速地扩散到气-液界面上。因此，整个气泡中欲测组分的分子很快地被溶解吸收。,综上所述,溶剂萃取是分析实验室常常使用的色谱分析样品制备方法。大部分的方式是在分液漏斗中一步或者多步萃取。连续萃取方法和反相萃取使它容易处理具有低分配系数的物质的样品。微萃取提供了灵敏度的改进和减少了溶剂用量。但是，必须改进回收率。萃取夹（萃取小柱）模仿传统的液一液萃取并且使得样品收集变得容易当处理大体积样品时，在线萃取系统、自动工作站和自动进样器是有效的，而手动的液一液萃取容易引入较大的误差。固相萃取是一种与经典液二液萃取具有竞争的技术之一，特别是在常规实验室的应用中尤其这样。,第一章 溶剂萃取,第一节、液-液萃取,第二节、液-固萃取,第三节、液-气萃取（溶液吸收）,第四节、萃取溶剂的选择,第四节、萃取溶剂的选择,液-液萃取常用的有机溶剂有甲醇、乙腈、丙酮、氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、乙醚、叔丁基甲醚、乙酸乙酯、苯、甲苯、正己烷。,溶剂选择应注意以下几点：,溶剂的极性：根据相似相溶原理，极性组分易溶于极性溶剂，反之亦然，应根据被测组份的极性选择相似极性的溶剂。例如，代谢物的极性一般比母体药物高，可选择极性较强的溶剂萃取，将其与母体药物分开。相反，若用较低极性的溶剂萃取，则可选择性地将母体药物同代谢物萃取分离开。又如生物材料中的内源成分大多为极性化合物，为了减少其混入萃取液中的少量杂质，则宜使用极性低的溶剂萃取。当然，实际萃取被测组分时，还常于萃取溶剂中加入第二种溶剂，以调整极性，使达到选择性萃取；,溶剂选择应注意以下几点：,溶剂的沸点：萃取分离后的有机相通常需置温水浴中通压缩空气（或氮气）使挥发，将被测组份浓集，因此萃取溶剂的沸点就不应接近或高于水的沸点，否者挥发困难；,溶剂选择应注意以下几点：,溶剂的毒性:使用对人体有害的溶剂萃取时，应在通风橱内进行。在常用溶剂中，乙酸乙酯既安全又无毒，对不同极性的被测组分均有较高的萃取回收率，又易于挥干，萃取物中混入的内源杂质量少，是较理想的首选溶剂；,溶剂选择应注意以下几点：,溶剂与水的互溶性：有的溶剂如乙醚，萃取后可混入大约1.2%的水分，因此伴随带入一些水溶性杂质。乙醚萃取能力强，又易于挥干浓缩，为常用萃取溶剂，除去混入水分的方法是加入无水Na2SO4脱水，减少混入的水溶性杂质量。无水Na2SO4使用前要烘干处理,溶剂选择应注意以下几点：,溶剂与水的互溶性：与水混溶的有机试剂，诸如低分子量的醇、酮、醛、甲基氰和二噁烷等，都不适合于液一液萃取。在液一液萃取中，分析学家应该选择在水中具有低溶解性(小于10)的有机溶剂和萃取后易挥发的、与分析技术匹配的、具有极性和氢键性质的有机溶剂。这样可以强化有机相中欲测定物质的回收率。,某些适合于液一液萃取的溶剂,某些溶剂与水的混溶性,溶剂极性的大小,溶剂极性的大小，可根据介电常数和偶极矩进行判断溶剂极性的大小还应该考虑分子间特殊作用力应该选择极性有机溶剂从水样品中萃取极性物质,有机相与水相容积比的选择,萃取过程中加入的有机溶剂并非越多越好，而应适量。一般有机相与水相容积比以1:1或2:1为佳，据被测组份的性质及方法需要，有时也增加有机相的比例。另外，萃取时若往水相中加入少量比重大的有机溶剂（如氯仿），而该溶剂对药物的溶解度又比较大，则可将药物从水相中浓集于小体积的有机相中，若萃取时使用的是尖底试管，则富含药物的有机相沉集于管尖部位，可直接取样分析，或将其分离出来。萃取时于水相中加入有机相后，一般只萃取一次。特殊情况下（如杂质不易除去），则必须将第一次萃取分出的含药有机相，再用一定pH的水溶液反萃取，最后再从水相将药物萃回到有机相中。,离子对试剂,一些酸性或碱性较强的有机药物在体液中呈离解状态，成为亲水性极强的带电荷离子，即使控制pH也不能抑制它们的电离，不能用有机溶剂将其自体液中提取出来。对于上述呈离解状态的药物，可加入离子对试剂，使它们形成具有一定脂溶性的离子对络合物，用有机溶剂将其从水相中萃取出来。,离子对试剂,阳离子药物配对的离子对试剂则为阴离子，其中以烷基磺酸类（RSO3H）为最常用，实际起配对作用的是其阴离子RSO3-，R为烷基，其碳链越长，生成的离子对络合物脂溶性越高。实际应用的试剂为其盐类，如戊烷磺酸钠（R=C5H11）、己烷磺酸钠（R=C5H11）和庚烷磺酸钠（R=C6H13）。此外，R除为直链烷烃外，也可选用芳烃基，如可用-萘磺酸作为离子对试剂。除上述烷基磺酸外，还可使用一些无机酸，如用高氯酸的阴离子ClO4-与阳离子有机药物配对。,离子对试剂,阴离子药物配对的离子对试剂主要为烷基季铵类化合物，可用通式R4N+X-表示，（X-可为酸根或氢氧基，R为烷基。烷基碳链长度常用C4C12，甚至可选用C20，碳链越长，则生成的离子对络合物脂溶性越高。常用的烷基季铵中有四丁基铵、四戊基铵等，商品试剂常用其盐，如磷酸四丁基铵、硫酸氢四丁基铵，或为其氢氧化碱，如氢氧化四丁基铵。,第二章 蒸馏,蒸馏是一种使用广泛的分离方法，根据液体混合物中液体和蒸气之间混合组分的分配差别进行分离。凡是学过有机化学实验课程的学生至少涉及到一个简单的二元混合体系有机物的分离或者纯化(精制)实验。实际上，蒸馏技术是挥发性和半挥发性有机物样品精制的第一选择。但是，在进行色谱分析样品制备时，蒸馏通常不是分析化学家的第一选择技术。化学家在实验室进行过许多次的蒸馏实验，其中的某些技术可以成功地用于色谱分析前样品的精制、清洗或者混合样品的预分离。,一、蒸馏原理,一、蒸馏原理 蒸馏的主要目的是从混合液体样品中分离出挥发性和半挥发性的组分。一种材料在不同温度下的饱和蒸气压变化是蒸馏分离的基础。大体说来，如果液体混合物中两种组分的蒸气压具有较大差别，就可以富集蒸气相中更多的挥发性和半挥发性的组分。两相液相和蒸气相可以分别地被回收，挥发性和半挥发性的组分富集在气相中而不挥发性组分被富集在液相中。,二简单蒸馏,三、分馏,四、减压蒸馏,五、水蒸气蒸馏,蒸馏技术的应用,1草药中植物油与GC联用的微蒸馏是一个理想的方法，用于测定草药中的植物油。这此化合物不能进行高温蒸馏。这种分析的常规方法是DABl996方法，使用水蒸气蒸馏11。与使用微蒸馏制备标准方法相比较，分析化学家应用水蒸气蒸馏方法从茴香种子中获得了植物挥发油。茴香种子是一种香味剂，被用来制造茴香油。他们的方法只使用0.200.25g样品。加入10ml水到煮沸瓶中以提供水蒸气。此方法包括一个75min的程序温度蒸馏，最后温度是108C。癸酸甲酯作为内标，p-二甲苯作为萃取溶剂。p-二甲苯使蒸馏液中植物油容易萃取出来12。此外，蒸馏瓶的设计允许蒸馏的植物油一二甲苯溶液从水相中分馏出来。使用移液管很容易除去有机层。Briechle和合作者通过常规和微蒸馏方法制备的萃取物进行毛细管GC分析获得了他们的结果。他们观察色谱图之间没有差别，这说明微蒸馏是一种可以接受的取代常规蒸馏的方法。微蒸馏方法与常规DAB方法相比的优点是，蒸馏时间短、能够制备多种样品、可进行小体积样品蒸馏(常规的2量)。,蒸馏技术的应用,2奶粉和其他奶产品中有机氯污染物 连续水蒸气蒸馏溶剂萃取已经被用作选择样品制备技术，用于GCECD分析有机氯农药13。虽然此技术已经被应用了许多年，每一次都进行了不同的技术改进。原来的方法使用比水重的溶剂(二氯甲烷)萃取，而现在使用比水轻的溶剂(低级石油醚)11钏。其他改进方法更完全地将溶剂和水蒸气混合，具有较大冷凝表面，分析化学家使用自来水用于冷凝，通过过流和连接管的变化防止交叉污染 为了完成实验，有人将5g有机氯农药奶粉装入蒸馏瓶中，再加入硫酸(打破胶束)、内标、甲醇和聚二甲基硅氧烷溶液(一种抗泡沫剂)。使用蒸汽发生器并且让水蒸气直接输人烧瓶中。蒸气一可蒸馏的挥发性农药被驱除并且被收集在20ml的石油醚中，其中含有内标物质。样品制备的最后一步是使用KD浓缩器将石油醚萃取物浓缩成l ml。最后，使用毛细管GCECD分析萃取物。人们发现15，当奶粉或者奶产品不到5时，此方法具有快速(11.5 h的蒸馏、清洗和1530min的萃取物浓缩)、选择性好、回收率高等特点。,蒸馏技术的应用,3真空蒸馏-GCMS用于测定环境样品中挥发性有机物 美国EPA研究了减压蒸馏方法用于测定环境样品中挥发性有机物，并且确定了控制回收率与潜在取代校正的相关性16。有学者研究了激活基质对物质回收率的作用，作为物质沸点和相对挥发性的函数17。这项研究中选择了114种替代物，测定它们的对这些参数的作用。对各种基质中多种物质分析测定以后，报告了测定一种物质的不确定度。在色谱分离之前，在真空瓶与GC之间使用冷却环进行捕集以浓缩蒸馏物。此方法获得了水、土壤和基体样品中ngg级水平的检出限。此研究结果表明，真空蒸馏一GC-MS技术的准确度足以完成蒸馏水中标准物质的分析测定，可用于测定各种样品体积中的挥发性有机物。,蒸馏技术的应用,4HPLC废溶剂的蒸馏 虽然此项应用不是一种预色谱蒸馏，但是它有助于减少HPLC实验室溶剂处理费用。大部分HPLC实验室使用大量的与有机溶剂混溶的水作为流动相，并且这些用过的溶剂实际上都是废液。因为大部分废溶剂混合有燃料可被烧掉，但水一有机化合物的热值较低，处理的费用较高。混合废物中的水增加了处理废物的体积。使用旋转带或者填充柱蒸馏技术，从这些废液中除去大部分的水是比较容易的。因为HPLC使用的大部分溶剂与水相比具有较低的沸点，在蒸馏之后大部分的水和痕量的物质被遗留在烧瓶中，如果使用合适的蒸馏技术，遗留的液体可以被处理到下水道中。通常，蒸馏仅需要少量的手动操作。处理含有75水的19L废液大约需要810h，而如果处理5.5L的溶剂，则会大大减少处理量和费用17。据统计18，使用高纯溶剂回收系统(NutraSweet公司产品)常规回收HPLC实验室的乙腈，每年节省的销售服务费和处理费用大约为2万美元。,第三章 固相萃取,第一节、固相萃取的模式及原理,第二节、固相萃取的常用吸附剂（固定相）,第三节、固相萃取的装置及操作程序,第四节、固相微萃取,第五节、固相萃取技术的应用,第三章 固相萃取,什么是固相萃取固相萃取(Solid Phase Extraction SPE)就是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的。,第一节、固相萃取的模式及原理,固相萃取法（Solid phase extraction，SPE）是近十几年迅速发展起来的一种样品预处理技术，它是以液相色谱分离机制为基础建立起来的分离和纯化方法。固相萃取实质上是一种液相色谱分离，其主要分离模式也与液相色谱相同,一种是保留杂质，待测组分不被保留而自然流出或者被洗脱,固相分离两种样品纯化的途径,更为常用的一种是先使待测物完全保留在柱上，使干扰杂质随样品溶剂或洗涤液洗出，然后以小体积溶剂洗脱待测物。,PAEs,BPA,第一节、固相萃取的模式及原理,1、快速,2、回收率高,3、精密度比较好,4、样品用量少,有一定的选择性，无乳化现象等,通常超过90%一般12min即可完成,10%,与经典的液-液萃取法相比，固相萃取的优点有:,SPE柱的类型,反相固相萃取所用的吸附剂通常是非极性的或极性较弱的，所萃取的目标化合物通常是中等极性到非极性化合物。目标化合物与吸附剂间的作用是疏水性相互作用，主要是非极性一非极性相互作用，是范德华力或色散力。,正相固相萃取所用的吸附剂都是极性的，用来萃取(保留)极性物质。在正相萃取时目标化合物如何保留在吸附剂上，取决于目标化合物的极性官能团与吸附剂表面的极性官能团之间的相互作用，其中包括了氢键，兀一兀键相互作用，偶极一偶极相互作用和偶极一诱导偶极相互作用以及其他的极性一极性作用。正相固相萃取可以从非极性溶剂样品中吸附极性化合物。,离子交换固相萃取所用的吸附剂是带有电荷的离子交换树脂，所萃取的目标化合物是带有电荷的化合物，目标化合物与吸附剂之间的相互作用是静电吸引力。,Al2O3填料石墨化碳填料,第三章 固相萃取,第一节、固相萃取的模式及原理,第二节、固相萃取的常用吸附剂（固定相）,第三节、固相萃取的装置及操作程序,第四节、固相微萃取,第五节、固相萃取技术的应用,第二节、固相萃取的常用吸附剂,固定相的选择,选择SPE固定相时，主要依据两个因素：需要提取的溶质和样品溶剂分析物的极性与固定相极性非常相似时，可得到分析物的最佳保留。两者极性越相似保留越好，所以要尽量选择极性相似的固定相例如，萃取碳氢化合物（非极性）是要采用反相柱（非极性）。当分析物极性适中时，正、反相固定相都可使用。,固定相的选择,固定相选择还受样品溶剂强度的制约。样品溶剂强度相对该固定相应该较弱，弱溶剂会增强分析物在吸附剂上的保留。如果溶剂太强，将得不到保留或保留很弱。举例来说，样品溶剂是正己烷时，用反相柱就不合适，因为正已烷是强溶剂，分析物不会有保留；当样品溶剂是水时，就可以用反相柱，因为水是弱溶剂，不影响分析物的保留。其他还应该考虑以下几点：分析物在极性或非极性溶剂中的溶解度；分析物有无可能离子化，从而决定可否用离子交换固定相；分析物有无可能与固定相形成共价键；不要的组分与分析物在固定相结合点上的竞争程度。,SPE柱填料的选择,第三章 固相萃取,第一节、固相萃取的模式及原理,第二节、固相萃取的常用吸附剂（固定相）,第三节、固相萃取的装置及操作程序,第四节、固相微萃取,第五节、固相萃取技术的应用,第三节、固相萃取的装置及操作程序,SPE柱的使用方法,方法,上加压式,多管真空固相萃取装置,离心方式,SPE柱的使用步骤,1.活化,2.上样,3.淋洗,4.洗脱,TEXT,TEXT,TEXT,TEXT,分析物，干扰物，其他干扰物,活化,以适当强溶剂湿润固相萃取柱使其溶剂化；以弱溶剂通常是水或缓冲溶液洗涤固定相，使其达到良好的分离状态；,上样,将溶于弱溶剂常是缓冲溶液中的样品加到固相提取柱上,淋洗,以强度适当的弱溶剂，如含有少量甲醇的水或缓冲溶液洗涤、除去基质或干扰组分；用强度较高的溶剂洗脱待测组分，收集洗脱液，直接或适当浓缩后进行色谱分析。,溶出（洗脱）,用强度较高的溶剂洗脱待测组分，收集洗脱液，直接或适当浓缩后进行色谱分析。,第三章 固相萃取,第一节、固相萃取的模式及原理,第二节、固相萃取的常用吸附剂（固定相）,第三节、固相萃取的装置及操作程序,第四节、固相微萃取,第五节、固相萃取技术的应用,第四节、固相微萃取,固相微萃取(Solid phase MicrOExtraction SPME)是在固相萃取基础上发展起来的一种新的萃取分离技术，与液一液萃取和固相萃取相比，具有操作时间短，样品量小，无需萃取溶剂，、适于分析挥发性与非挥发性物质，重现性好等优点。,第四节、固相微萃取,固相微萃取装置外形如一只微量进样器，由手柄(holder歹和萃取头或纤维头(fiber)两部分构成，萃取头是一根1 cm长，涂有不同吸附剂的熔融纤维，接在不锈钢丝上，外套细不锈钢管(保护石英纤维不被折断)；纤维头在钢管内可伸缩或进出，细不锈钢管可穿透橡胶或塑料垫片进行取样或进样。手柄用于安装或固定萃取头，可永远使用(图325)。,第四节、固相微萃取,第四节、固相微萃取,固相微萃取关键在于选择石英纤维上的涂层(吸附剂)，要使目标化合物能吸附在涂层上，而干扰化合物和溶剂不吸附，一般是：目标化合物是非极性时选择非极性涂层；目标化合物是极性时选择极性涂层。固相微萃取的采样方法是将固相微萃取针管(不锈钢套管)穿过样品瓶密封垫，插入样品瓶中。然后推出萃取头，将萃取头浸入,第三章 固相萃取,第一节、固相萃取的模式及原理,第二节、固相萃取的常用吸附剂（固定相）,第三节、固相萃取的装置及操作程序,第四节、固相微萃取,第五节、固相萃取技术的应用,第五节、固相萃取技术的应用,固相萃取主要用于复杂样品中微量或痕量目标化合物的分离和富集。例如，生物体液(如血液，尿等)中药物及其代谢产物的分析，食品中有效成分或有害成分的分析，环保水样中各种污染物(可挥发性有机物和半挥发性有机物)的分析都可使用固相萃取将目标化合物分离出来，并加以富集，然后进行色谱分析。,举例：,1血浆中苯并二氮杂类药物(安定)的测定 使用6mL固相萃取柱；柱内填加500mg C18吸附剂。用5ml甲醇活化，然后再用5mL水淋洗。将l mL0.1mol/L乙酸钠加入4mL血浆中，充分混合后倒入萃取柱内，抽滤。然后加入3mL水，抽滤30s。再将固相萃取柱在10001500rmin离心机上离心5min。用3ml丙酮洗脱，收集洗脱液，将洗脱液在氮气流下缓缓加热(45C)至干燥。用200uL甲醇溶解残渣，进样20uL，进行HPLC分析,举例：,2水中多环芳烃(PAHS)的测定使用6mL固相萃取柱，柱内填加500mgCl8吸附剂，用5mL二氯甲烷活化，然后再用甲醇冰(5ml甲醇和5mL水)淋洗液重复淋洗2次。加2mL异丙醇到20mL水样中(10异丙醇含量)，混合后倒人固相萃取柱，流速不得大于10mLmino用3mL甲醇水(体积比=50：50)淋洗，抽真空30s，再将固相萃取柱在10001500rmin离心机上离心5mino用3mL二氯甲烷洗脱，收集洗脱液。将洗脱液在干燥氮气流下浓缩到50200uL，浓缩时样品不要加热，以免造成小分子多环芳烃的丢失。加二氯甲烷至总体积为200uL，进样20uL，进行GC分析。,举例：3.邻苯二甲酸酯类污染来源,生产过程,加工过程,包装环节,奶牛场散户,欧盟官方的监控,BBP:30 mg/kgDBP:0.3 mg/kgDEHP:1.5 mg/kgDNOP:9.0 mg/kgDINP:9.0 mg/kgDIDP:9.0 mg/kg,Commission Directive 2007/19/EC of EU(MRL of PAEs),6种PAEs的结构式,图1 6种PAEs的结构式（a）邻苯二甲酸丁苄酯,（b）邻苯二甲酸二丁酯,（c）邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯,（d）邻苯二甲酸二正辛酯,（e）邻苯二甲酸二异壬酯,（f）邻苯二甲酸二异癸酯Fig.1 The structures of six PAEs(a)Benzyl Butyl Phthalate，BBP(b)Dibutyl Phthalate，DBP(c)Bis(2-ethylhexyl)Phthalate，DEHP(d)Di-n-octyl Phthalate，DNOP(e)Diisononyl Phthalate，DINP(f)Diisodecyl Phthalate，DIDP,(a),(b),(c),(d),(e),(f),样品处理：HPLC,净化,LLE（BBP、DBP）,1mL甲醇溶解,2g样品，2mL甲醇，4mL正己烷：甲基叔丁基醚（v:v,1:1），震荡提取2次，离心，上清氮吹，正己烷定容至4mL。,冷冻去脂，上清液定容至4mL。,SPE（DEHP、DNOP、DINP、DIDP）,氮吹浓缩,本底的去除、活化、上样、淋洗、洗脱,牛奶和乳酪,奶粉,黄油,2g样品，水浴融化，用5mL甲醇提取2次，离心，上清氮吹，正己烷定容至4mL。,样品处理(HPLC-MS/MS),SPE净化,1mL甲醇溶解，离心,1g样品，加入各自对应同位素内标物，以下几步同HPLC方法正己烷定容至2mL。,氮吹浓缩,洗脱液：含50%乙酸乙酯的正己烷溶液，洗脱25mL。,BBP-3,4,5,6-D4DBP-3,4,5,6-D4DEHP-3,4,5,6-D4DNOP-3,4,5,6-D4,Waters公司电喷雾四极杆飞行时间串联质谱仪（ESI Q-TOF MS/MS）,1.SPE柱的选择,保留较弱，回收率偏低,DEHP、DNOP、DINP和DIDP的保留时间较长(纯甲醇洗脱，也会造成DINP和DIDP的严重拖尾),回收率较好、峰型尖锐,淋洗体积、洗脱范围、分析时间：500mg,填充量选择（500,1000,1500mg）,C18,2.洗脱曲线的确定,SPE柱经活化后，取2.0 mL样液，加入适量的混合标准溶液，使其添加量相当于2倍MRL的浓度。上样，分批次淋洗30mL。(淋洗液：含0.7%乙酸乙酯的正己烷溶液)。,图 2 4种PAEs（DEHP、DNOP、DINP和DIDP）的淋洗曲线图Fig.2 The elution curve of four PAEs（DEHP、DNOP、DINP and DIDP）,3.柱体和塞板的选择,普通SPE柱,玻璃柱体,玻璃柱体,聚四氟乙烯,烧结玻璃,传统筛板,第四章 气体萃取（顶空技术Headspace）,第一节、概述,第二节、静态顶空技术,第三节、动态顶空（吹扫/捕集）技术,第四节、顶空/气相色谱测定方法作为标准方法的使用情况,第一节、概述,顶空气相色谱不是一种新技术，此技术自从气相色谱出现初期就一直在应用着。目前它仍然是常用的色谱分析样品制备技术之一，因为它具有简单、方便、花费少和易于自动化等特点。现代的许多色谱仪器都配备有计算机控制的自动进样器可以实现这种技术。,第一节、概述,对于样品中痕量高挥发性物质的分析测定，可使用气体萃取的方法，因为气体是挥发性物质的最理想的溶剂。与大部分的有机溶剂相比，气体既容易处理又容易纯化。气体萃取就是顶空技术，常常用于气相色谱分析顶空技术有静态顶空和动态顶空,第二节、静态顶空技术,静态顶空是“一步气体萃取”。静态顶空作定性分析非常简便，但是进行定量测定比较繁杂，,Headspace,第三节、动态顶空（吹扫/捕集）技术,使用吹扫气体连续地萃取样品，将一些组分吹出，然后通过冷冻浓缩技术或者使用吸附浓缩技术将这些组分浓缩，最后用加热的方法释放出这些组分，进行GC分析。动态顶空是一种”连续气体萃取方法，不必等到样品瓶中两相达到平衡和抽取等份的顶空样品进行测定。,第三节、动态顶空（吹扫/捕集）技术,第四节、顶空/气相色谱测定方法作为标准方法的使用情况,目前，顶空气相色谱分析方法已经广泛地应用于各种实验室作为标准方法测定环境样品中各种有毒污染物。测定血液中乙醇的顶空方法就是许多国家规定的标准测定方法。下面就美国、德国和日本三个国家中将顶空气相色谱方法作为标准方法的使用情况作一个简要介绍。,美国,在美国，EPA发布了许多测定方法涉及静态顶空和动态顶空技术。使用静态顶空气相色谱方法测定废水中和PVC树脂中的氯乙烯、污泥中和乳胶中的氯乙烯；美国联邦食品和药品管理局也接受了静态顶空气相色谱方法测定植物油、合成食品、醋等样品中的氯乙烯；美国药典中也提议使用静态顶空气